Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Neuartiger Nanoemulsionsimpfstoff hat große Vorteile in der Therapie von Krankheiten. Diese Set-Effekte werden durch Eigenschaften wie den einzigartigen Tumorchopismus, die Identifizierung spezifischer Taktiken und die geringe systemische Toxizität minimiert. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Ectype-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.

Mischen Sie zunächst ein Milligramm Monophosphorollipid A mit 100 Mikrolitern DMSO. Fünf Minuten vortexen und vier Stunden bei Raumtemperatur auflösen lassen. Fügen Sie TWEEN 80 und I-OVA quantitativ hinzu.

Mischen Sie die Komponenten und fügen Sie Squalen hinzu. Als nächstes fügen Sie der vorbereiteten Mischung 100 Mikroliter MPLA-Lösung hinzu. Zur Herstellung des Nanoemulsionsimpfstoffs wird die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen gegeben und vorsichtig umgerührt, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten.

Beginnen Sie bei In-vitro-Assays mit der Wiederbelebung der BEAS2B-Epithelzellen. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Tauen Sie die gefrorenen Zellfläschchen schnell in einem Wasserbad auf, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist.

Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Milliliter des gesamten Nährmediums hinzugefügt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 129 G fünf Minuten lang. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern des gesamten Nährmediums.

Nachdem Sie die Zellen erneut zentrifugiert haben, entfernen Sie das Supinatant und fügen Sie sechs Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Anschließend werden die Zellen in einen T25-Kulturkolben überführt und bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator inkubiert. Sobald die Zelldichte 80 % bis 90 % erreicht hat, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS.

Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Tripsin hinzu, um die Zellen ein bis zwei Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort vier Milliliter des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen und saugen Sie die Proben in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ab.

Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 129 G. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter RPMI 1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf einmal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter.

Dann werden die BEAS2B-Zellen mit einer Dichte von einmal 10 bis vier Zellen pro Well in 96-Well-Platten in 100 Mikrolitern RPMI 1640-Komplettmedium plattiert und die Platten 24 Stunden lang vorinkubiert, wie zuvor gezeigt. Am Ende der Inkubation wird das Supinatant verworfen und 100 Mikroliter RPMI 1640 in jede Vertiefung der 96-Well-Platte gegeben. Jeweils 100 Mikroliter I-OVA Nanoemulsion, I-OVA gemischt mit BNE und I-OVA mit einem kompletten Nährmedium in verschiedenen Endkonzentrationen mit BNE als Kontrolle vorverdünnt und 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Medium und stellen Sie die Platte an einen dunklen Ort. Geben Sie 90 Mikroliter des vollständigen Wachstumsmediums und 10 Mikroliter CCK8-Lösung in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Messen Sie die Absorption jedes Wells bei 450 Nanometern mit einem enzymmarkierten Plattenleser. Verwenden Sie 10-Mikroliter-Pipettenspitzen, um die Mäuse drei Tage lang nasal mit I-OVA, I-OVA plus BNE und I-OVA NE zu immunisieren. Verwenden Sie BNE und PBA als experimentelle Kontrolle.

Schneiden Sie anschließend mit einer Schere etwa drei Millimeter dicke Proben des Nasengewebes ab und legen Sie sie in 4%iges Paraformaldehyd. Entfernen Sie das Lungengewebe und fixieren Sie das Nasen- und das gesamte Lungengewebe 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd. TEM und AFM werden zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotentials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs verwendet.

Partikelgrößen, Polydispersitätsindizes, Zetapotentiale und Elektrophoresemobilität von I-OVA NE in Musin-Stabilitätsanalysen werden gezeigt. Die relative Lebensfähigkeit von BEAS2B-Zellen beträgt mehr als 80 % in Kulturen, die 24 Stunden lang unterschiedlichen Peptidkonzentrationen von I-OVA, BNE+I-OVA und I-OVA NE ausgesetzt waren. Die I-OVA EN-Gruppe hatte keine offensichtliche Schleimhauttoxizität, Gewebeschädigung, Blutung oder entzündliche Zellinfiltration.

Die epithelialen BEAS2B-Zellen fingen mehr FITC-markierte I-OVA NE ein als die ihrer wässrigen Lösung. Der Retardeffekt von I-OVA NE in vitro wurde mit dem IV-IS-System analysiert. Der Impfstoff I-OVA NE hatte im Vergleich zur wässrigen Lösung von I-OVA eine verzögerte Freisetzung.

In der I-OVA NE-Gruppe ist die prozentuale Überlebenszeit im Vergleich zu anderen Gruppen höher, und das Tumorvolumen war signifikant kleiner, was darauf hindeutet, dass er eine bessere präventive Schutzwirkung hat als die anderen Gruppen. Im therapeutischen Modell unterschied sich die mediane Überlebenszeit signifikant zwischen den verschiedenen Gruppen. Das Tumorvolumen der I-OVA NE-Gruppe war signifikant kleiner als das der I-OVA-Gruppe.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Mischung gleichmäßig zu rühren. Andernfalls verringert sich die Effizienz von Nanoimpfstoffen.