Name: Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs für die Immuntherapie. Diese Methode zeigt reduzierte Toxizität und verbesserte Wirksamkeit bei der Behandlung von Tumoren.

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Diese Studie wurde unterstützt von Nr. 31670938, 32070924, 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Nr. 2020XBK24 und Nr. 2020XBK26 der Sonderprojekte der Army Medical University sowie Nr. 202090031021 und Nr. 202090031035 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Laboratory Animal – Guideline for ethical review of animal welfare (GB/T 35892-2018) durchgeführt und von der Laboratory Animal Welfare and Ethics Commission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Die Mäuse wurden durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital euthanasiert.
1. Vorbereitung der I-OVA NE
<ol><li>Mischen Sie 1 mg Monophosphoryllipid A (MPLA) mit 100 μl DMSO, wirbeln Sie 5 Minuten lang und lassen Sie es 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT) stehen, um sich vollständig aufzulösen.</li>
	<li>Fügen Sie Tween 80 und I-OVA quantitativ hinzu und mischen Sie. HINWEIS: Tween 80 und I-OVA wurden in einem Massenverhältnis von 25:119 gemischt.</li>
	<li>Fügen Sie Squalen zu der in Schritt 1.2 zubereiteten Mischung hinzu (7:3, Smix: Squalen).</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl MPLA-Lösung (10 mg/ml) zu der in Schritt 1.3 hergestellten Mischung hinzu.</li>
	<li>Bereiten Sie den Nanoemulsionsimpfstoff mit energiesparenden Emulgiermethoden19 vor: Geben Sie die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen und rühren Sie vorsichtig um, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten. HINWEIS: Die BNE-Kontrolle (Blindemulsion) wurde nach der gleichen Methode hergestellt, wobei Wasser durch I-OVA ersetzt wurde.</li>
</ol>2. Physikalisch-chemische Charakterisierung und Stabilität
HINWEIS: Beurteilen Sie die Tröpfchengrößenverteilung, das Zetapotenzial und andere physikalisch-chemische Daten des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.1-2.3; Durchführung der morphologischen Charakterisierung des I-OVA NE-Impfstoffs gemäß den Schritten 2.4-2.7; und untersuchen Sie die 3D-Struktur des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 2.8-2.9.
<ol><li>Mischen Sie 50 mg Muzinprotein mit 100 ml Wasser für Injektionszwecke, um eine 0,05%ige Muzinlösung herzustellen.</li>
	<li>4 mg/ml I-OVA NE 200-fach mit 0,05 mg/ml Muzinprotein oder deionisiertem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Beobachten Sie die Partikelgrößen, das Zetapotential, den Polydispersitätsindex (PDI) und die elektrophoretische Mobilität bei 25 °C mit einem Nanoanalysator19.</li>
	<li>10 μl I-OVA NE 200-fach mit 2 ml deionisiertem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Geben Sie 5 μl vorverdünnten I-OVA NE-Impfstoff (Schritt 2.4) auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter und bedecken Sie es 3 Minuten lang mit 10 μl 1%iger Phosphowolframsäure.</li>
	<li>Entfernen Sie die überschüssige Phosphowolframsäure mit Filterpapier.</li>
	<li>Abrufen von Bildern mit TEM. Legen Sie eine 50-fach verdünnte 10-μl-Probe auf ein 100-mesh-Kohlenstoffkupfergitter und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) stehen, bevor Sie 10 μl Phosphowolframsäure (1%, pH 7,4) hinzufügen. Untersuchen Sie alle Proben mit TEM bei einer Spannung von 120 kV.</li>
	<li>Charakterisieren Sie die molekulare Morphologie der I-OVA NE mit einem hochauflösenden Rasterkraftmikroskop. Die Farbbilder von I-OVA NE sind unter folgenden Bedingungen zu erhalten: für Wolframsonden (Kraftkonstante: 0,06 N·m-1); Scanbereich: 450 nm x 450 nm; Tapping-Modus: Imaging-Modus; und Scanmethode: Punkt-für-Punkt-Scannen bei RT.</li>
</ol>3. In-vitro- und In-vivo-Toxizitätstests 
ANMERKUNG: Die In-vitro-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs wurde nach den Schritten 3.1 bis 3.9 und die In-vivo-Toxizität des I-OVA NE-Impfstoffs nach den Schritten 3.10 bis 3.13 bewertet.
<ol><li>Humane BEAS-2B-Epithelzellen werden nach den Schritten 3.1.1-3.1.4 wiederbelebt und in einem vollständigen Wachstumsmedium bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator kultiviert. Anmerkungen: Um das vollständige Nährmedium herzustellen, fügen Sie dem RPMI-1640-Medium fötales Kälberserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin in Endkonzentrationen von 10 % bzw. 1 % hinzu.<ol><li>Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Entfernen Sie die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Zellfläschchen und tauen Sie sie schnell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.</li>
		<li>Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettiert, 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzugefügt und 5 Minuten lang bei 129 x g zentrifugiert.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie 6 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und überführen Sie die Zellen in einen T25-Kulturkolben, um die Zellen bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator zu kultivieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn die Zelldichte 80%-90% erreicht, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Fügen Sie 1 ml 0,25%iges Trypsin hinzu, um die Zellen 1-2 Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort 4 ml des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.</li>
	<li>Mischen und saugen Sie die Proben in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 129 x g .</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml RPMI-1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 μl für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf 1 x 105 Zellen/ml.</li>
	<li>Die BEAS-2B-Zellen werden mit einer Dichte von 1 x 104 Zellen/Well in 96-Well-Platten in 100 μl RPMI-1640 Komplettmedium geplättet und die Platten für 24 h bei 37 °C in einem 5% CO2 -Inkubator vorinkubiert.</li>
	<li>Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 100 μl I-OVA NE, 100 μl I-OVA+BNE (physikalisch gemischt) und 100 μl I-OVA vorverdünnt mit einem vollständigen Wachstumsmedium in verschiedenen Endkonzentrationen (0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 8 mg/ml) mit BNE als Kontrolle hinzu. 24 h bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Fügen Sie den Negativkontrollgruppen 100 μl vollständiges Wachstumsmedium und den Positivkontrollgruppen 100 μl Zellsuspension (1 x 105/ml) hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und geben Sie 90 μl vollständiges Wachstumsmedium und 10 μl CCK-8-Lösung in jede Vertiefung der Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte für 2 h bei 37 °C in einem 5% CO2 - Inkubator.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei 450 nm mit einem enzymmarkierten Plattenleser.</li>
	<li>Berechnen Sie das Überlebensverhältnis von BEAS-2B-Zellen wie in der folgenden Gleichung angegeben: (OD450-Probe − OD450 Negativkontrolle/OD450 Positivkontrolle − OD450 Negativkontrolle) × 100 %</li>
	<li>6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n = 5 in jeder Gruppe) aufgeteilt und zur Induktion mit 4 % Isofluran betäubt. Pflegen Sie die Anästhesie mit 2% Isofluran. Verwenden Sie Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse, um Trockenheit vorzubeugen.</li>
	<li>Verwenden Sie 10-μl-Pipettenspitzen, um die nasale Immunisierung der Mäuse mit 10 μl/Nasenloch I-OVA, I-OVA+BNE und IOVA NE in einer Dosierung von 4 mg/ml für alle 3 Tage durchzuführen. Verwenden Sie BNE und PBS als experimentelle Kontrolle. Anmerkungen: Bieten Sie thermische Unterstützung, bis sich das Tier von der Narkose erholt hat.</li>
	<li>Euthanasieren Sie alle Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1% Natrium-Pentobarbital an Tag 4.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere ca. 3 mm dicke Proben des Nasengewebes ab und entfernen Sie das Lungengewebe.</li>
	<li>Fixieren Sie das Nasengewebe und das gesamte Lungengewebe 24 h lang in 4%igem Paraformaldehyd. Dehydrieren Sie das Gewebe durch einen seriellen Alkohol- und Xylolgradienten und betten Sie es dann in Paraffin ein. Die fertigen Wachsblöcke auf einem Paraffinschneider mit einer Dicke von 4 μm in Scheiben schneiden.</li>
	<li>Färben Sie die Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Beobachten Sie dann die Schleimhauttoxizität, einschließlich Hyperämie, Ödemen, Infiltration neutrophiler Granulozyten und struktureller Schäden in der Nasenschleimhaut und im Lungengewebe, unter dem Mikroskop (100x und 200x)7.</li>
</ol>4. In-vitro-Zellaufnahme
<ol><li>BEAS-2B-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen/Well in 12-Well-Platten mit Deckgläsern in 2 mL des kompletten Nährmediums einfüllen und die Platten über Nacht bei 37 °C in einem5 % CO2 -Inkubator vorinkubieren.</li>
	<li>100 μl FITC-markierte I-OVA NE (Reinheit: 98,3 %, vom Unternehmen hergestellt, 4 mg/ml) oder I-OVA (4 mg/ml) zu 900 μl Zellsuspension geben und 90 min bei 37 °C platzieren. HINWEIS: Bereiten Sie die FITC-gekennzeichnete I-OVA NE wie in Schritt 4.1 beschrieben vor. Fügen Sie den Kontrollgruppen 1 ml des vollständigen Wachstumsmediums hinzu.</li>
	<li>Nach der Behandlung dreimal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C waschen.</li>
	<li>Fixieren Sie diese Proben mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten im Dunkeln. Nach der Fixierung wird das Paraformaldehyd entfernt und 3 mal mit 0,1 M PBS (1 ml/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.</li>
	<li>Die Proben werden mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min im Dunkeln vorinkubiert und dann nach der Behandlung 5 mal mit 0,1 M PBS (1 mL/Well) für 30 min bei 37 °C gewaschen.</li>
	<li>Ermitteln Sie die zelluläre Aufnahme durch CLSM mit den folgenden Parametereinstellungen: Bildgröße: 512 px x 512 px, Scangeschwindigkeit: 8; Zeilenschritt: 1; Mittelwert: 2.</li>
</ol>5. In-vivo-Freisetzung
<ol><li>Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie bei 2 % Isofluran aufrecht. Immunisieren Sie Nacktmäuse intranasal mit 10 μl PE-markierten I-OVA in 4 mg/ml oder PE-markierten I-OVA NE in 4 mg/ml in jedem Nasenloch.</li>
	<li>Bei 0 h, 0,5 h, 1,5 h, 3, 6 h, 9 h, 12 h und 24 h werden alle Mäuse unter Narkose vom IVIS-System erfasst.</li>
	<li>Führen Sie unmittelbar vor der intranasalen Verabreichung einen Hintergrundscan durch, um einen Schwellenwert (Min = 1,06 x 106) zu ermitteln, um die zu allen Zeitpunkten aufgenommenen Bilder anzupassen.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Living Image-Software, um die Sequenz zu starten, und klicken Sie auf Initialisieren, um das IVIS-System zu initialisieren </li>
	<li>Bei der Initialisierung leuchtet die Temperaturstatusanzeige in der IVIS-Erfassungszentrale rot. Wenn die Temperaturstatusanzeige auf grün wechselt, kann eine Bildgebung durchgeführt werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf Imaging-Assistent , und wählen Sie dann im angezeigten Dialogfeld Fluoreszenz aus.</li>
	<li>Passen Sie die folgenden Parameter an: Belichtungszeit: Automatik, Binning: 8, Blende: 2, Sichtfeld: D.</li>
	<li>Wählen Sie den 620-nm-Anregungsfilter und den 670-nm-Emissionsfilter. Klicken Sie auf Sequenz erfassen, um das Bild zu erfassen .</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Live-Bilder aller Mäuse und die Strahldichtedaten mit der Living Image-Software.<ol><li>Nachdem Sie das Bild aufgenommen haben, klicken Sie in der Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge, wählen Sie Kreis und erstellen Sie einen ROI-Kreis .</li>
		<li>Klicken Sie auf ROIs messen , um einen quantitativen Wert für den ROI-Bereich zu erhalten.</li>
	</ol></li>
</ol>6. In-vivo-Antitumor-Wirksamkeit
<ol><li>Die E.G7-OVA-Zellen des Maus-Lymphoms aus EL4 werden mit einem vollständigen Nährmedium nach den Schritten 2.1.1-2.1.4 aufgefrischt und kultiviert. Anmerkungen: Zur Herstellung eines vollständigen Wachstumsmediums für E.G7-OVA-Zellen wird das Medium RPMI 1640 mit 2 mM L-Glutamin gemischt, das so eingestellt ist, dass es 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 4,5 g/l Glukose, 10 mM HEPES und 1,0 mM Natriumpyruvat enthält und mit 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 0,4 mg/ml G418, 90%, und fötalem Kälberserum, 10%, ergänzt wird.</li>
	<li>Subkultivieren Sie die Zellen im Verhältnis 1:2, wenn die Zellen eine Dichte zwischen 1 x 106 Zellen/ml und 1 x 107 Zellen/ml erreichen.</li>
	<li>Bewerten Sie die vorbeugende Schutzwirkung bei Mäusen wie in den Schritten 6.3.1-6.3.4 beschrieben.<ol><li>Teilen Sie 6 Wochen alte C57BL/6-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen ein (n = 8 in jeder Gruppe). Betäuben Sie nackte Mäuse mit 4 % Isoflurangas und halten Sie die Anästhesie mit 2 % Isofluran aufrecht. Rasieren Sie die hinteren Haare und die Neomycinsulfat-Salbe auf den Augen der Mäuse teilweise, um Trockenheit zu vermeiden.</li>
		<li>Intranasal immunisieren Sie die Mäuse mit 10 μl 1 mg/ml i-ova, BNE+I-OVA oder I-OVA NE in jedem Nasenloch, BNE (viermal mit PBS verdünnt) oder einer PBS-Kontrolle 3-mal mit einem 7-tägigen Abstand zwischen den einzelnen Immunisierungen.</li>
		<li>Impfen Sie alle Mäuse am 7. Tag nach der Endimmunisierung hypodermisch in den rechten Rücken mit 5 x 105 E. G7-OVA-Zellen.</li>
		<li>Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der endgültigen Immunisierung das Tumorvolumen, indem Sie zwei Achsen des Tumors mit digitalen Messschiebern messen, und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben (nach der endgültigen Immunisierung) der Mäuse auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Die therapeutische Schutzwirkung auf Mäuse nach der Inokulation von E.G7-OVA-Zellen ist wie in den Schritten 6.4.1-6.4.3 beschrieben zu bewerten. Für die Gruppierung und den Umgang mit Mäusen siehe Schritt 6.3.1.<ol><li>An Tag 0 injizieren Sie die C57BL/6-Mäuse subkutan in den rechten Rücken mit E.G7-OVA-Zellen (5 x 105 Zellen/Maus).</li>
		<li>Immunisieren Sie 0, 7 und 14 Tage nach der Injektion alle Mäuse, die intranasal immunisiert wurden, dreimal mit 10 μl I-OVA, BNE+I-OVA, I-OVA NE (alle in Konzentrationen von 1 mg/ml), BNE oder PBS in jedes Nasenloch.</li>
		<li>Überwachen Sie 0, 6, 9, 12, 15 und 18 Tage nach der Injektion das Tumorvolumen und zeichnen Sie das 30-Tage-Überleben der Mäuse auf. HINWEIS: Wenn das Tumorvolumen 3.000mm3 überschreitet, sollten die Mäuse aus humanen Gründen eingeschläfert werden, und diese Mäuse gelten in der Überlebenskurve als tot. Das Tumorvolumen wird durch eine modifizierte ellipsoidische Formel berechnet, wie in der folgenden Gleichung angegeben: Volumen = π/6 x L x B2 wobei L für die Tumorlänge und W für die Tumorbreite steht (Längeneinheit: mm, Volumeneinheit:mm 3).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Statistische Analyse
<ol><li>Analysieren Sie die Unterschiede in den Daten zwischen den verschiedenen Gruppen mit geeigneter statistischer Software mit einfaktorieller ANOVA, Tukey-Mehrfachvergleichen oder einem Student-t-Test. Verwenden Sie die Kaplan-Meier-Methode, um die Überlebensergebnisse zu schätzen und die Gruppen mit Log-Rank-Statistiken zu vergleichen. Drücken Sie alle Ergebnisse als Mittelwert ± SD aus. Die Signifikanz der P-Werte P < 0,05, P < 0,01 und P < 0,001 wird in den Diagrammen mit *, ** bzw. *** dargestellt. </li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.

Nanoimpfstoffe, die mit Immunozytenmembranen funktionalisiert sind, haben große Vorteile in der krankheitsspezifischen Therapie, und die Nebenwirkungen werden durch Eigenschaften wie einzigartigen Tumortropismus, die Identifizierung spezifischer Ziele, eine verlängerte Durchblutung, verstärkte interzelluläre Interaktionen und eine geringe systemische Toxizität minimiert. Sie lassen sich auch leicht in andere Behandlungsmodule integrieren, um Krebserkrankungen kooperativ zu behandeln16,20</sup...

Als eine der wichtigsten Innovationen im Bereich der öffentlichen Gesundheit spielen Impfstoffe eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung der globalen Krankheitslast beim Menschen1. So werden derzeit mehr als 120 Impfstoffkandidaten gegen COVID-19-Erkrankungen getestet, von denen einige in vielen Ländern zugelassen sind2. Jüngste Berichte besagen, dass Krebsimpfstoffe den Fortschritt klinischer Krebsbehandlungen effektiv verbessert haben, da sie das Immunsystem von Krebspatienten dazu bringen, Antigene als körperfremd zu erkennen3. Darüber hinaus können mehrere T-Zell-Epitope, die sich innerhalb oder außerhalb von Tumorzellen befinden, zur Entwicklung von Peptidimpfstoffen verwendet werden, die sich bei der Behandlung von metastasierendem Krebs als vorteilhaft erwiesen haben, da sie nicht die signifikante Toxizität aufweisen, die mit Strahlen- und Chemotherapie verbunden ist 4,5. Seit Mitte der 1990er Jahre werden präklinische und klinische Studien zur Tumorbehandlung hauptsächlich mit Antigenpeptid-Impfstoffen durchgeführt, aber nur wenige Impfstoffe zeigen eine ausreichende therapeutische Wirkung bei Krebspatienten6. Darüber hinaus weisen Krebsimpfstoffe mit Peptidepitopen eine schlechte Immunogenität und eine unzureichende Verabreichungseffizienz auf, was auf den schnellen Abbau extrazellulärer Peptide zurückzuführen sein kann, die schnell von der Verabreichungsstelle diffundieren, was zu einer unzureichenden Antigenaufnahme durch Immunzellen führt7. Daher ist es notwendig, diese Hindernisse mit Technologie zur Verabreichung von Impfstoffen zu überwinden.
OVA 257-264, das MHC-Klasse-I-bindende257-264-Epitop, das als Fusionsprotein exprimiert wird, ist ein häufig verwendetes Modellepitop8. Darüber hinaus ist OVA257-264 entscheidend für die adaptive Immunantwort gegen Tumore, die von der zytotoxischen T-Lymphozyten-Antwort (CTL) abhängt. Sie wird durch antigenspezifische CD8+ T-Zellen im Tumor vermittelt, die durch das OVA257-264 Peptid induziert werden. Es ist gekennzeichnet durch unzureichendes Granzym B, das von zytotoxischen T-Zellen freigesetzt wird, was zur Apoptose der Zielzellen führt8. Die Verabreichung von freiem OVA257-264-Peptid kann jedoch eine geringe CTL-Aktivität induzieren, da die Aufnahme dieser Antigene in unspezifischen Zellen und nicht in antigenpräsentierenden Zellen (APCs) erfolgt. Das Fehlen einer geeigneten Immunstimulation führt zu einer CTL-Aktivität5. Daher erfordert die Induktion einer wirksamen CTL-Aktivität erhebliche Fortschritte.
Aufgrund der Barriere durch Epithelzellen und der kontinuierlichen Schleimsekretion werden Impfantigene schnell aus dem Nasenschleim entfernt 9,10. Die Entwicklung eines effizienten Impfstoffvektors, der das Schleimhautgewebe passieren kann, ist von entscheidender Bedeutung, da sich die antigenpräsentierenden Zellen unter dem Schleimhautepithel befinden9. Die intranasale Injektion von Impfstoffen induziert theoretisch eine Immunität der Schleimhäute zur Bekämpfung von Schleimhautinfektionen11. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung eine effektive und sichere Verabreichungsmethode für Impfstoffe, da sie bequem ist, die Verabreichung des Darms vermeidet und dieCompliance der Patienten verbessert 7. Daher ist die nasale Verabreichung ein gutes Mittel zur Verabreichung des neuartigen Peptid-Epitop-Nanoimpfstoffs.
Es wurden mehrere synthetische Biomaterialien entwickelt, um Epitope von Zellgewebe und Zell-Zell-Interaktionen zu kombinieren. Bestimmte bioaktive Proteine, wie z. B. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV), wurden als Teil der Struktur des Hydrogels eingeführt, um Bioaktivität zu verleihen12. Dieses Peptid trägt wahrscheinlich zur Zellanhaftung, -migration und -ausbildungbei 13 und bindet Integrine α 3β1 und α6β1, um mit verschiedenen Krebszelltypen zu interagieren. IKVAV ist ein Zelladhäsionspeptid, das sich von der Laminin-Basalmembranprotein-α-1-Kette ableitet, die ursprünglich zur Modellierung der neuronalen Mikroumgebung und zur neuronalen Differenzierung verwendet wurde14. Daher ist es wichtig, ein effizientes Verabreichungsvehikel für diesen neuartigen Impfstoff zu finden, um Krankheiten zu kontrollieren.
Kürzlich beschriebene Emulsionssysteme wie W805EC und MF59 wurden ebenfalls für die Verabreichung von inaktiviertem Influenza-Impfstoff oder rekombinantem Hepatitis-B-Oberflächenantigen in die Nasenhöhle hergestellt und es wurde gezeigt, dass sie sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität auslösen15. Nanoemulsionen (NEs) haben im Vergleich zu partikulären Schleimhautverabreichungssystemen die Vorteile einer einfachen Verabreichung und einer bequemen Co-Bildung mit wirksamen Adjuvantien16. Es wurde berichtet, dass Nanoemulsionsimpfstoffe den allergischen Phänotyp nachhaltig verändern, anders als bei der herkömmlichen Desensibilisierung, was zu langfristigen unterdrückenden Wirkungen führt17. Andere berichteten, dass Nanoemulsionen in Kombination mit Mtb-spezifischen immundominanten Antigenen starke Schleimhautzellantworten induzieren und einen signifikanten Schutz verleihen könnten18. Daher wurde ein neuartiger intranasaler selbstassemblierter Nanoimpfstoff mit dem synthetischen Peptid IKVAV-OVA 257-264 (I-OVA, das Peptid bestehend aus IKVAV gebunden an OVA257-264) entwickelt. Es ist wichtig, diesen neuartigen Nanoimpfstoff systematisch zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die Toxizität und die Stabilität des Nanoimpfstoffs systematisch zu bewerten, festzustellen, ob die Antigenaufnahme und die schützende und therapeutische Wirkung mit technischen Mitteln verbessert werden, und die wichtigsten experimentellen Inhalte zu erläutern. In dieser Studie haben wir eine Reihe von Protokollen erstellt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, das Ausmaß der Toxizität der I-OVA NE zu BEAS-2B-Zellen durch CCK-8 zu bestimmen und die Antigen-präsentierende Fähigkeit von BEAS-2B-Zellen zum Impfstoff mittels konfokaler Mikroskopie zu beobachten, die Freisetzungsprofile dieses neuartigen Nanoimpfstoffs in vivo und in vitro zu bewertenund die schützende und therapeutische Wirkung dieses Impfstoffs anhand eines E.G7-OVA-Tumor-tragenden Mausmodells nachzuweisen.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0 Mikroplatten-Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td><td>&nbsp; Bio-Rad 6.0</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Kits</td><td>Dojindo, Japan</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>FITC-markiertes I-OVA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>HF 90/240 Inkubator</td><td>Heal Force, Schweiz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>Verifizierter Lieferant - Shanghai Botai Biotechology Co., Ltd.</td><td>E2695</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon, Japan</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>IPC-208</td><td>Chong Qing University, China</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS System&nbsp;</td><td>Caliper Life Science Limited Company</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1230 TEM</td><td>JEOL Limited Company of Japan</td><td>1230 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS</td><td>Malvern Instruments Ltd., UK</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MPLA</td><td>&nbsp; Invivogen Lit. Co.</td><td>tlrl-mpla</td><td></td></tr><tr><td>Neomycinsulfat-Salbe</td><td>Shanghai CP General Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>H31022262</tr><tr><td>OVA257&ndash; 264</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisches Peptid (I-OVA) Konjugation von IKVAV-PA</td><td>Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Zeiss LSM800 konfokales Laserscanning-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>Zeiss LSM800</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung, eigenschaften, toxizität und wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten nanoemulsions-tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitoppeptide haben auf dem Gebiet der Tumorimpfstoffe aufgrund ihrer Sicherheit, hohen Spezifität und bequemen Herstellung große Aufmerksamkeit erregt. Insbesondere einige MHC-I-restriktive Epitope können eine effektive zytotoxische T-Lymphozytenaktivität induzieren, um Tumorzellen zu beseitigen. Darüber hinaus ist die nasale Verabreichung aufgrund ihrer Bequemlichkeit und verbesserten Patientencompliance eine effektive und sichere Verabreichungstechnik für Tumorimpfstoffe. Epitoppeptide sind jedoch aufgrund ihrer schlechten Immunogenität und mangelnden Abgabeeffizienz für die nasale Verabreichung ungeeignet. Nanoemulsionen (NEs) sind thermodynamisch stabile Systeme, die mit Antigenen beladen und direkt an die Nasenschleimhautoberfläche abgegeben werden können. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) ist das Kernpentapeptid von Laminin, einem Integrin-bindenden Peptid, das von menschlichen Epithelzellen der Atemwege exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde ein intranasaler selbstassemblierter Epitoppeptid-NE-Tumorimpfstoff, der das synthetische Peptid IKVAV-OVA257-264 (I-OVA ) enthielt, durch eine niederenergetische Emulgiermethode hergestellt. Die Kombination von IKVAV und OVA257-264 kann die Antigenaufnahme durch die Epithelzellen der Nasenschleimhaut verbessern. Hier erstellen wir ein Protokoll zur Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Rasterkraftmikroskopie (AFM) und dynamischer Lichtstreuung (DLS); Stabilität in Gegenwart von Muzinprotein; Toxizität durch Untersuchung der Zellviabilität von BEAS-2B-Zellen und des Nasen- und Lungengewebes von C57BL/6-Mäusen; zelluläre Aufnahme durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM); Freisetzungsprofile durch Bildgebung von Kleintieren in vivo; und die schützende und therapeutische Wirkung des Impfstoffs unter Verwendung eines E.G7-Tumor-tragenden Modells. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Epitop-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.

Gemäß dem Protokoll haben wir die Vorbereitung und die experimentelle In-vitro- und In-vivo-Bewertung der Verabreichung des Nanoimpfstoffs für Nasentumore abgeschlossen. TEM, AFM und DLS sind effektive Mittel zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotenzials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs (Abbildung 1). BEAS-2B-Epithelzellen sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von nasalen Impfstoffen (<strong c...

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

Neuartiger Nanoemulsionsimpfstoff hat große Vorteile in der Therapie von Krankheiten. Diese Set-Effekte werden durch Eigenschaften wie den einzigartigen Tumorchopismus, die Identifizierung spezifischer Taktiken und die geringe systemische Toxizität minimiert. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll technische und theoretische Hinweise für die zukünftige Entwicklung neuartiger T-Zell-Ectype-Peptid-Mukosa-Impfstoffe liefern wird.Mischen Sie zunächst ein Milligramm Monophosphorollipid A mit 100 Mikrolitern DMSO. Fünf Minuten vortexen und vier Stunden bei Raumtemperatur auflösen lassen. Fügen Sie TWEEN 80 und I-OVA quantitativ hinzu.Mischen Sie die Komponenten und fügen Sie Squalen hinzu. Als nächstes fügen Sie der vorbereiteten Mischung 100 Mikroliter MPLA-Lösung hinzu. Zur Herstellung des Nanoemulsionsimpfstoffs wird die gemischte Lösung bei ca. 70 % des Gesamtvolumens zu Wassertröpfchen gegeben und vorsichtig umgerührt, um eine transparente und leicht fließende Mischung zu erhalten.Beginnen Sie bei In-vitro-Assays mit der Wiederbelebung der BEAS2B-Epithelzellen. Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Tauen Sie die gefrorenen Zellfläschchen schnell in einem Wasserbad auf, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist.Nach dem Auftauen werden die Zellen schnell in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettiert und zwei Milliliter des gesamten Nährmediums hinzugefügt. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 129 G fünf Minuten lang. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern des gesamten Nährmediums.Nachdem Sie die Zellen erneut zentrifugiert haben, entfernen Sie das Supinatant und fügen Sie sechs Milliliter des vollständigen Wachstumsmediums hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Anschließend werden die Zellen in einen T25-Kulturkolben überführt und bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator inkubiert. Sobald die Zelldichte 80 % bis 90 % erreicht hat, verwerfen Sie das Nährmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit zwei Millilitern PBS.Fügen Sie einen Milliliter 0,25%Tripsin hinzu, um die Zellen ein bis zwei Minuten lang zu verdauen. Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie sofort vier Milliliter des gesamten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Mischen und saugen Sie die Proben in einem sterilen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ab.Zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei 129 G. Entfernen Sie das Supinatant und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter RPMI 1640 Komplettmedium. Verwenden Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension für die Zellzählung und verdünnen Sie die Zellen auf einmal 10 bis fünfte Zellen pro Milliliter.Dann werden die BEAS2B-Zellen mit einer Dichte von einmal 10 bis vier Zellen pro Well in 96-Well-Platten in 100 Mikrolitern RPMI 1640-Komplettmedium plattiert und die Platten 24 Stunden lang vorinkubiert, wie zuvor gezeigt. Am Ende der Inkubation wird das Supinatant verworfen und 100 Mikroliter RPMI 1640 in jede Vertiefung der 96-Well-Platte gegeben. Jeweils 100 Mikroliter I-OVA Nanoemulsion, I-OVA gemischt mit BNE und I-OVA mit einem kompletten Nährmedium in verschiedenen Endkonzentrationen mit BNE als Kontrolle vorverdünnt und 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie das Medium und stellen Sie die Platte an einen dunklen Ort. Geben Sie 90 Mikroliter des vollständigen Wachstumsmediums und 10 Mikroliter CCK8-Lösung in jede Vertiefung der Platte. Inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Messen Sie die Absorption jedes Wells bei 450 Nanometern mit einem enzymmarkierten Plattenleser. Verwenden Sie 10-Mikroliter-Pipettenspitzen, um die Mäuse drei Tage lang nasal mit I-OVA, I-OVA plus BNE und I-OVA NE zu immunisieren. Verwenden Sie BNE und PBA als experimentelle Kontrolle.Schneiden Sie anschließend mit einer Schere etwa drei Millimeter dicke Proben des Nasengewebes ab und legen Sie sie in 4%iges Paraformaldehyd. Entfernen Sie das Lungengewebe und fixieren Sie das Nasen- und das gesamte Lungengewebe 24 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd. TEM und AFM werden zur Beurteilung der grundlegenden Eigenschaften des Zetapotentials an der Oberfläche und der Partikelgröße des Nanoimpfstoffs verwendet.Partikelgrößen, Polydispersitätsindizes, Zetapotentiale und Elektrophoresemobilität von I-OVA NE in Musin-Stabilitätsanalysen werden gezeigt. Die relative Lebensfähigkeit von BEAS2B-Zellen beträgt mehr als 80 % in Kulturen, die 24 Stunden lang unterschiedlichen Peptidkonzentrationen von I-OVA, BNE+I-OVA und I-OVA NE ausgesetzt waren. Die I-OVA EN-Gruppe hatte keine offensichtliche Schleimhauttoxizität, Gewebeschädigung, Blutung oder entzündliche Zellinfiltration.Die epithelialen BEAS2B-Zellen fingen mehr FITC-markierte I-OVA NE ein als die ihrer wässrigen Lösung. Der Retardeffekt von I-OVA NE in vitro wurde mit dem IV-IS-System analysiert. Der Impfstoff I-OVA NE hatte im Vergleich zur wässrigen Lösung von I-OVA eine verzögerte Freisetzung.In der I-OVA NE-Gruppe ist die prozentuale Überlebenszeit im Vergleich zu anderen Gruppen höher, und das Tumorvolumen war signifikant kleiner, was darauf hindeutet, dass er eine bessere präventive Schutzwirkung hat als die anderen Gruppen. Im therapeutischen Modell unterschied sich die mediane Überlebenszeit signifikant zwischen den verschiedenen Gruppen. Das Tumorvolumen der I-OVA NE-Gruppe war signifikant kleiner als das der I-OVA-Gruppe.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Mischung gleichmäßig zu rühren. Andernfalls verringert sich die Effizienz von Nanoimpfstoffen.

preparation-characteristics-toxicity-efficacy-evaluation-nasal-self

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Herstellung von Nanoemulsions-Tumorimpfstoffen. Die stabilen Ölreservoir-Depots, die synthetische Peptide und Adjuvantien enthalten, werden durch niederenergetische Nanoemulsionen hergestellt, was für die Tumorimmuntherapie vielversprechend ist.

Herstellung eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Das schlechte Verständnis der In-vivo-Leistung von Nanomedikamenten behindert ihre klinische Umsetzung. Verfahren zur Bewertung des in vivo-Verhaltens von Krebs-Nanoarzneimitteln auf systemischer, Gewebe-, Einzelzell- und subzellulärer Ebene bei tumortragenden immunkompetenten Mäusen werden hier beschrieben. Dieser Ansatz kann Forschern helfen, vielversprechende Krebs-Nanomedikamente für die klinische Umsetzung zu identifizieren.

Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung der<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance von Krebs Nanomedizin

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Dieses Protokoll beschreibt einen detaillierten Workflow für die Generierung und ex-Vivo Charakterisierung von onkolytische Viren für den Ausdruck von Immunmodulatoren, Masern-Viren Codierung bispezifische T Zelle Engagers als Beispiel verwenden. Anwendung und Anpassung an andere Vektor-Plattformen und transgene beschleunigt die Entwicklung von neuartigen Immunovirotherapeutics für klinische Übersetzung.

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Es wird ein Standardprotokoll beschrieben, um die Antitumoraktivität und die damit verbundene Toxizität von IL-1α in einem syngenen Mausmodell von HNSCC zu untersuchen.

Bewertung der in vivo Antitumoraktivität von Polyanhydrid IL-1α Nanopartikeln

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.

Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.

Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion

In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.

Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

Erfahren Sie die Herstellung eines nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs für die Immuntherapie. Diese Methode zeigt reduzierte Toxizität und verbesserte Wirksamkeit bei der Behandlung von Tumoren.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo (Video) | JoVE Journal

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

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