Name: Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Erfahren Sie die CRISPR-EZ-Methode zur effizienten Genom-Editierung von Mäusezygoten durch Elektroporation. Diese Technik erreicht nahezu 100% Effizienz bei der Erzeugung genetisch modifizierter Mäusemodelle.

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A.J.M. entwickelte das ursprüngliche Konzept, das zur Entwicklung von CRISPR-EZ führte, und produzierte die Zahlen. C.K.D. hat die internen und veröffentlichten Protokolle für dieses aktuelle Manuskript zusammengestellt und angepasst. A.J.M. wird von NIH (R00HD096108) unterstützt.

<ol><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+phenotype-expressing+triple-knockout+mice+with+heritable+mutated+alleles+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system.</a> Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).</li>
<li>Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+genome+editing+of+rodent+intact+embryos+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation.</a> PLoS One. 10 (11), 0142755(2015).</li>
<li>Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing.</a> Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mouse+genome+engineering+by+CRISPR-EZ+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Hur, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+mice+by+electroporation+of+Cpf1+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).</li>
<li>Tröder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), 0196891(2018).</li>
<li>Qin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR%2Fcas9-mediated+genome+editing+in+mice+by+zygote+electroporation+of+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease.</a> Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
<li>Nishio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+voltage+strength+during+electroporation+on+the+development+and+quality+of+in+vitro-produced+porcine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos.</a> Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Frontiers in Genetics. 11, 570069(2020).</li>
<li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+%28still+not%29+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+validation+strategies+for+CRISPR-Cas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing.</a> Scientific Reports. 8, 888(2018).</li>
<li>Modzelewski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse-specific+retrotransposon+drives+a+conserved+Cdk2ap1+isoform+essential+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development.</a> Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
<li>Sanson, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+libraries+for+CRISPR-Cas9+genetic+screens+with+multiple+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities.</a> Nature Communications. 9 (1), 5416(2018).</li>
<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811(2019).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
<li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GONAD%3A+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system%3A+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406(2015).</li>
<li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081(2017).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87(2015).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47(2009).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

Es gibt keine relevanten Finanzerklärungen der Autoren.

Hier wird eine einfache und hocheffiziente Maus-Genom-Editing-Technologie vorgestellt. Die Elektroporation kann verwendet werden, um modifizierte Embryonen in 1-2 Wochen zu erzeugen (Abbildung 1) und kann innerhalb von 6 Wochen editierte Mäuse produzieren9. Im Vergleich zu zeitgleich entwickelten elektroporationsbasierten Protokollen, die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32 liefern, ist die hier beschriebene Methode konzeptionell ähnlich und bietet Wirkungsgrad...

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierungzugänglicher und erschwinglicher geworden 1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern 4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und Studenten geeignet und erfordert auch teure Geräte, die sich ein bescheiden finanziertes Labor nicht leisten kann. Die Mikroinjektion wird in der Regel von erfahrenen Technikern in transgenen Anlagen mit Zeitplänen und Servicepreisen durchgeführt, die für viele Forscher preisbegrenzend sind. Ein zugänglicherer Ansatz ist die Elektroporation, die sich als sehr effektiv für die Verabreichung von CRISPR-Cas9-mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium erwiesen hat7. Weitere Verbesserungen bei der Genom-Editierung und den Verabreichungsstrategien von CRISPR deuten darauf hin, dass vorkonfektionierte RNPs, die bereits mit sgRNAs verbunden sind, ein wirksames Mittel zur Verringerung des Mosaizismus sein könnten8.
Der Grund für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls bestand darin, viele der Einschränkungen und Hindernisse zu umgehen, die mit der Mikroinjektion verbunden sind. Wie der Name schon sagt, wäre eine einfache, hauseigene und kostengünstige Methode, mit der schnell festgestellt werden kann, ob sich ungetestete sgRNA-Designs während eines Mikroinjektionsexperiments lohnen, ein sehr praktischer Schritt zur Qualitätskontrolle im ersten Durchgang (Abbildung 1). Während diese Methode die Mikroinjektion für komplexere Strategien, wie die Einführung langer Spender-DNA-Sequenzen für rekombinationsbasierte Ergebnisse, nicht ersetzen kann, ist sie ideal für weniger komplexe Strategien wie kleine Deletionen oder Insertionen und die Markierung von Genen. Diese Methode eignet sich für Forscher mit grundlegenden Fähigkeiten in der Manipulation von Embryonen, die einfache Bearbeitungsbedürfnisse haben, ihre Hypothese innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung testen möchten oder es vorziehen, sgRNAs in Embryonen zu testen, bevor sie einen Termin mit einem Mikroinjektionsspezialisten vereinbaren. Hier werden Editierreagenzien vorübergehend als Cas9 / sgRNA-RNPs über Elektroporation (eine Reihe elektrischer Impulse) in Embryonen im pronuklearen Stadium eingebracht, um die Effizienz zu maximieren und gleichzeitig den Mosaikismus zu verringern8. Unter Verwendung einer Embryonen-Genotypisierungsmethode liegen die Bearbeitungsergebnisse in ca. 1 Woche9 vor, wodurch der Bedarf an verschiedenen Mikroinjektionsanwendungen zu deutlich reduzierten Kosten reduziert wird.
Die Wirksamkeit dieser Methode erreicht ihren Höhepunkt im pronukleären Embryostadium, wenn der Embryo noch nicht mit den mütterlichen und väterlichen Vorkernen verschmolzen ist oder in die S-Phase eingetreten ist (Abbildung 2). Superovulation wird verwendet, um die Anzahl der Zygoten zu maximieren, produziert aber sowohl pronukleäre Zygoten als auch unbefruchtete Eier. Gesunde Zygoten können auch vor der Elektroporation vorselektiert werden, um die Gesamteffizienz zu erhöhen. Da andere Elektroporationsprotokolle Zygoten effizient editiert haben, ohne dass ein ähnlicher Schritt 7,10,11,12,13,14,15 erforderlich ist, ist ein optionaler Schritt dieses Protokolls die leichte Erosion der Zona pellucida (ZP). Das ZP ist eine Glykoproteinschicht, die die Bindung von Spermatozoen, die Akrosomenreaktion und die Befruchtung von Embryonen im Pronuklearstadium unterstützt. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass eine sanfte säurebasierte Erosion des ZP eine zuverlässige Cas9-RNP-Elektroporation mit nur marginalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit bietet.
Wir haben RNP-Lieferraten von bis zu 100% Effizienz durch Elektroporation in Mausstämmen beobachtet, die häufig in der Forschung verwendet werden, wie C57BL / 6J und C57BL / 6N 9,16. Unabhängige Gruppen haben auch auf Elektroporation basierende Verfahren entwickelt, deren Wirkungsgrade größer oder gleich denen der Mikroinjektion 11, 12, 13, 14, 15, 17 sind, wobei die Elektroporationsprotokolle bei Ratten18, 19, Schweinen 20,21, 22 und Kühen 23 gut funktionieren Daher empfehlen wir den Lesern, die Protokolle zu vergleichen, um die Bedingungen zu finden, die ihren Experimentier- und Ausrüstungsanforderungen am besten entsprechen. Das hier beschriebene System verwendet gängige Materialien und Geräte, die nur grundlegende Fähigkeiten zur Manipulation von Embryonen erfordern. Diese Technik ist für eine Reihe von Bearbeitungsstrategien wirksam und macht diese Methode für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich.
Das Design idealer Small-Guide-RNAs (sgRNAs) ist für eine effiziente Bearbeitung unerlässlich. Wir empfehlen, zwei bis drei sgRNA-Strategien pro Zielort direkt in Mausembryonen zu screenen, insbesondere wenn die Generierung von Mauslinien gewünscht wird. Einmal entwickelt, werden klonenfreie Methoden wie die In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung hochwertiger sgRNAs empfohlen3. Die RNPs und sgRNAs werden mit 30-50 prozessierten Embryonen im Pronuklearstadium gemischt und einer Reihe von elektrischen Impulsen ausgesetzt, um zuerst vorübergehend die ZP und die Zellmembran zu permeabilisieren, mit nachfolgenden Impulsen, um die Poren offen zu halten und die RNPs durch die Zygote24 zu elektrophorisieren. Nach der Optimierung fanden wir heraus, dass sechs 3-ms-Impulse bei 30 V für Massenembryonen (~ 50) optimal für die Editiereffektivität und Lebensfähigkeit waren und eine hocheffiziente Cas9 / sgRNA-RNP-Lieferung 9,16,25 ermöglichten. Editierereignisse in einzelnen Mausmorula können mit einer Vielzahl von Validierungsstrategien bestätigt werden, die für die CRISPR-Bearbeitung üblich sind, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), T7-Endonuklease-Verdauung und Sanger-Sequenzierung der interessierenden Region26.
Die aktuelle Methode eignet sich am besten für einfache Bearbeitungsschemata (Abbildung 3), wie z. B. Einfügungen/Löschungen (Indels), Exon-große Löschungen in der Größenordnung von 500-2000 bp und die Bereitstellung von Punktmutationen und kleinen Insertionen wie C- oder N-Terminal-Tags (z. B. FLAG, HA oder V5)9,16,27. Das Potenzial für komplexe Genom-Editierung, wie große Insertionen von Fluoreszenz-Tags oder bedingten Allelen, bleibt ungewiss und steht derzeit im Fokus bevorstehender Verbesserungen.
Diese Methode ist leicht zu beherrschen und kann verwendet werden, um sgRNAs in kultivierten Mausembryonen in 1 Woche9 schnell zu testen (Abbildung 1). In dieser Arbeit wird ein sechsstufiges Protokoll vorgestellt, das 1) sgRNA-Design; 2) sgRNA-Synthese; 3) Superovulation und Paarung; 4) Embryonenkultur, -entnahme und -verarbeitung; 5) RNP-Montage und Elektroporation; 6) Embryokultur und Genotypisierung. Informationen über alle verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt (Materialtabelle). Als Positivkontrolle wurden Reagenzien zur Bearbeitung des Tyrosinase (Tyr)-Locus 9,16 in die Ergänzungstabelle 1 aufgenommen.

<table><tbody><tr><td>Elektroporationsküvette mit 0,1 cm Spalt</td><td>Bio-Rad</td><td>Kat.-Nr. 1652089</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>26-G, 1/2-Zoll-Nadel</td><td>BD</td><td>Kat.-Nr. 305111</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>3&ndash; 8 Monate alte männliche Mäuse und 3 bis 5 Wochen alte weibliche Mäuse</td><td>JAX</td><td>Kat.-Nr. 000664</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>35 mm Gewebekulturschale</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>Kat.-Nr. 627-160</td><td>Embryokultur</td></tr><tr><td>60 mm Gewebekulturschale</td><td>Greiner Bio-One,</td> <td>Kat.-Nr. 628-160</td><td>Embryoaufbereitung</td></tr><tr><td>6x Ladefarbstoff</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr. R0611</td><td>sgRNA-Synthese und Genotypisierung</td></tr><tr><td>Saure Tyrode (AT)-Lösung, Embryokulturqualität</td><td>Sigma-Aldrich,</td> <td>Kat.-Nr. T1788</td><td>Embryo Processing</td></tr><tr><td>BSA, Embryokulturqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. A3311</td><td>Embryo Processing and Culture</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuklease 3NLS</td><td>Kat.-Nr. 1074181</td><td>Elektroporation</td></tr><tr><td>DNase I, RNase-frei</td><td>New England BioLabs,</td> <td>Kat.-Nr. M0303</td><td>sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>DPBS (calcium- und magnesiumfrei)</td><td>Gibco</td><td>Kat.-Nr. 14190-144</td><td>Embryo Processing</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>Kat.-Nr. R3101S</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>EDTA, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. EDS-100G</td><td>RNP Puffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Koptec</td><td>Kat.-Nr. V1016</td><td>sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>Gelatine (Pulver) Typ B, Laborqualität</td><td>Fisher,Kat</td><td>.-Nr. G7-500</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Glycerin,&nbsp; molekularbiologischer Grad</td><td>Fisher</td><td>Kat.-Nr. BP229</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>Taq Polymerase</td><td>Promega</td><td>Kat.-Nr. M712</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>HEPES, Zellkulturqualität</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. H4034</td><td>RNP Buffer</td></tr><tr><td>HinfI (10.000 U/ml)</td><td>NEB</td><td>Kat.-Nr. R0155S</td><td>Genotypisierung</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs,</td> <td>Kat.-Nr. E2040</td><td>sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>Humanes Choriongonadotropin, lyophilisiert (hCG)</td><td>Millipore</td><td>Kat.-Nr. 230734</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase/M2</td><td>Millipore</td><td>Kat.-Nr. MR-051-F</td><td>Embryo Processing</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve medium (kaliumergänztes simplex-optimiertes Medium plus Aminosäuren)</td><td>Zenith Biotech</td><td>Kat.-Nr. ZEKS-050</td><td>Embryokultur</td></tr><tr><td>LE Agarose, analytische Qualität</td><td>BioExpress</td><td>Kat.-Nr. E-3120-500</td><td>sgRNA-Synthese und Genotypisierung</td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Zenith Biotech</td><td>Kat.-Nr. ZFM2-050</td><td>Embryonenaufbereitung</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid, wasserfrei (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. M8266</td><td>RNP und Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Millipore</td><td>Kat.-Nr. ES-005C</td><td>Embryokultur</td></tr><tr><td>Nonidet P-40, Ersatz (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. 74385</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser, molekularbiologische Qualität</td><td>Ambion</td><td>Kat.-Nr. AM9937</td><td>sgRNA-Synthese und Genotypisierung</td></tr><tr><td>Oligos für die sgRNA-Synthese, Spender-Oligos und PCR-Primer für die Genotypisierung</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>Sonderanfertigungen</td><td>sgRNA Design</td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kat.-Nr. 31985062</td><td>Embryokultur</td></tr><tr><td>High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs,</td> <td>Kat.-Nr. M0530</td><td>sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>Kaliumchloridemolekulär-biologisch (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. P9333</td><td>RNP und Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Trächtige Stute Serum Gonadotropin lyophilisiert ((PMSG)</td><td>ProspecBio</td><td>Kat.-Nr. HOR-272</td><td>Superovulationsproteinase</td></tr><tr><td>K, molekularbiologische Qualität</td><td>Fisher</td><td>Kat.-Nr. BP1700-100</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>RNasefreies 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>Kat.-Nr. 20170-333</td><td>sgRNA-Synthese und Genotypisierung</td></tr><tr><td>RNase-freie Acht-Well-PCR-Streifenröhrchen</td><td>VWR</td><td>Kat.-Nr. 82006-606</td><td>sgRNA-Synthese und Genotypisierung</td></tr><tr><td>Magnetische Reinigungskügelchen</td><td>GE Healthcare</td><td>Kat.-Nr. 65152105050250</td><td>sgRNA-Synthese</td></tr><tr><td>Tris (2-carboxyethyl) phosphin Hydrochlorid (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. C4706</td><td>RNP Puffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl-Lösung, pH 8,5 molekularbiologisch</td><td>Teknova</td><td>Kat.-Nr. T1085</td><td>Lysepuffer</td></tr><tr><td>Tween 20 molekularbiologisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.-Nr. P7949-500</td><td>Lysepuffer</td></tr></tbody></table>

effiziente genom-editierung von mäusen durch crispr-elektroporation von zygoten

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

Mit außergewöhnlicher Effizienz, Genauigkeit und Leichtigkeit hat das CRISPR/Cas9-System die Genom-Editierung in Zellkultur- und Labortierversuchen deutlich verbessert. Bei der Erstellung von Tiermodellen bietet die Elektroporation von Zygoten eine höhere Effizienz, Einfachheit, Kosten und einen höheren Durchsatz als Alternative zur Goldstandardmethode der Mikroinjektion. Die Elektroporation ist auch schonender, mit höherer Lebensfähigkeit und liefert zuverlässig Cas9 / Single-Guide-RNA (sgRNA) Ribonukleoproteine (RNPs) in die Zygoten gängiger Labormausstämme (z. B. C57BL / 6J und C57BL / 6N), die eine 100%ige Liefereffizienz erreichen. Diese Technik ermöglicht Insertions-/Deletionsmutationen (Indels), Punktmutationen, die Deletion ganzer Gene oder Exons und kleine Insertionen im Bereich von 100-200 bp, um LoxP oder kurze Tags wie FLAG, HA oder V5 einzufügen. Während es ständig verbessert wird, präsentieren wir hier den aktuellen Stand von CRISPR-EZ in einem Protokoll, das die sgRNA-Produktion durch In-vitro-Transkription , Embryo-Prozessierung, RNP-Assemblierung, Elektroporation und die Genotypisierung von Präimplantationsembryonen umfasst. Ein Forscher mit minimaler Erfahrung in der Manipulation von Embryonen kann mit diesem Protokoll in weniger als 1 Woche genetisch veränderte Embryonen erhalten. Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige, effiziente und leistungsfähige Methode an, die mit Mausembryonen verwendet werden könnte.

Diese Methode erzeugt mehr als 100 μg sgRNA (20 μL bei &gt;6.000 ng/L Konzentration) für eine effiziente Cas9/sgRNA-RNP-Assemblierung. Die hier beschriebene routinemäßige Superovulationsmethode produziert typischerweise 10-20 lebensfähige Embryonen pro verstopftem Weibchen. Aufgrund von Handhabungsfehlern und typischen Verlusten, die mit der Manipulation von Embryonen verbunden sind, sind voraussichtlich 80% der Embryonen befruchtet, lebensfähig und in ausgezeichnetem Zustand nach der Elektroporation. Um den Forschern be...

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

With exceptional efficiency, accuracy, and ease, the CRISPR/Cas9 system has significantly improved genome editing in cell culture and lab animal ...

Diese Methode könnte Leit-RNAs in Embryonen überprüfen, frühe Entwicklungsfragen testen oder bearbeitete Mäuse erzeugen. Alle Fortschritte in CRISPR Cas9 könnten mit dieser Methode genutzt werden. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass sie leicht zu erlernen ist und Reagenzien verwendet, die Laboren mit Zugang zu Mäusen zur Verfügung stehen.In Zukunft wäre diese Technik nützlich, um eine Krankheit oder Mutation bei den Nachkommen eines Haustieres oder eines landwirtschaftlich wichtigen Tieres zu korrigieren. Diese Methode eignet sich am besten für die Generierung von Mausmodellen. In unserem Labor haben wir Variationen dieser Methode verwendet, um die Ereignisse rund um die Befruchtung und die frühe Präimplantationsentwicklung zu untersuchen, insbesondere die Genregulation in der Potenz des Embryos.Der schwierigste Teil ist die Verwendung der Glasnadel, um Embryonen von Platte zu Platte zu bewegen. Chantal Diallo, eine Forschungsspezialistin in meinem Labor, wird dieses Verfahren demonstrieren. Um mit der Embryoentnahme und -verarbeitung zu beginnen, legen Sie die eingeschläferte weibliche Maus auf den Rücken und sprühen Sie 70% Ethanol auf den Bauch, um ihn chirurgisc

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Designer-Nukleasen wie Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) und Transkriptionsaktivator-Effektor wie Nukleasen (Talens) kann verwendet werden, um das Genom der Maus Präimplantationsembryonen durch Auslösen sowohl die nicht-homologe Ende (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) Wege ändern. Diese Fortschritte ermöglichen die schnelle Generierung von Mäusen, die mit präzisen genetischen Veränderungen.

Maus-Genom-Engineering mit Designer Nukleasen

Die Mikroinjektion von Maus-Oozyten wird üblicherweise sowohl für die klassische Transgenese ( dh die zufällige Integration von Transgenen) als auch für das CRISPR-vermittelte Gen-Targeting verwendet. Dieses Protokoll überprüft die neuesten Entwicklungen in der Mikroinjektion, mit einem besonderen Schwerpunkt auf Qualitätskontrolle und Genotypisierung Strategien.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Mikroinjektion von CRISPR-Cas9 und Spender-DNA durch Zygoten, um effizient Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Mäuse zu produzieren.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Dieses Protokoll beschreibt die Mikroinjektion und In-vivo-Elektroporation für die regional eingeschränkte CRISPR-vermittelte Genom-Editierung im Eileiter der Maus.

Somatic Genom-Engineered Mausmodelle mit In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation

Dieses Protokoll stellt einen optimierten Ansatz zur Herstellung genetisch veränderter Rattenmodelle dar. Das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wird verwendet, um eine DNA-Reparaturvorlage zu liefern, und die Elektroporation wird verwendet, um CRISPR-Cas9-Reagenzien zu verabreichen, um den Genom-Editierungsprozess im 2-Zell-Embryo abzuschließen.

CRISPR-Cas9 Genom-Editierung von Rattenembryonen mit Hilfe des Adeno-assoziierten Virus (AAV) und der Elektroporation von 2-Zell-Embryonen

Die Effizienz der I-GONAD-Methode (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) ist vergleichbar mit der herkömmlichen Mikroinjektion, bei der Zygotenentnahme von Spenderinnen und die Übertragung auf pseudoschwangere Frauen erforderlich ist. Dieses Protokoll demonstriert seine Wirksamkeit durch die Einführung von CRISPR/Cas9-induzierten Mutationen in den ROSA26-Locus auf Chromosom 6.

Verbesserte Genom-Editierung durch die Verabreichung von eiduktalen Nukleinsäuren In-vivo-Elektroporationstechnik für die Erzeugung von Knockout-Mäusen

Die Abgabe von Genomeditoren als RNAs ist ein besonders wirkungsvolles Mittel zur Modifikation der Genome primärer Säugetierzellen und -zelllinien. Ziel dieses Protokolls ist es, Genom-Editoren als mRNA in primäre Säugetierzellen und -zelllinien zu liefern, gefolgt von gezielter Illumina-Sequenzierung und Analyse zur Quantifizierung der Editierergebnisse.

Genom-Editierung in primären Säugetierzellen mittels Elektroporation von Editor-RNA

Erfahren Sie die CRISPR-EZ-Methode zur effizienten Genom-Editierung von Mäusezygoten durch Elektroporation. Diese Technik erreicht nahezu 100% Effizienz bei der Erzeugung genetisch modifizierter Mäusemodelle.

Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

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