Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

Dieses Protokoll wird Forschern, die neu in der Arbeit mit Aptameren sind, helfen, sie in ihren Projekten zu verwenden und auch die einzelnen kleinen Schritte zu verstehen, die erforderlich sind, um das Protokoll zu vervollständigen. Aptamere sind sehr vielseitig, und dieses Protokoll zeigt, wie einfach und einfach sie in einem Immunphänotypisierungsassay sind. Aptamere können sowohl für diagnostische als auch für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.

Dieses Protokoll ist der erste Schritt, der unternommen wird, um ihre Spezifität und Sensitivität zu bestätigen. Während dieser spezielle Assay die Färbung eines Zelloberflächenrezeptors zeigt, können Aptamere sehr einfach für die multiparametrische Durchflusszytometrie verwendet werden, was ein hohes Maß an phänotypischem Wissen bietet. Die wichtigen Aspekte bei der Arbeit mit Aptameren sind sicherzustellen, dass sie vor der Verwendung korrekt gefaltet werden und dass die Puffer- und Ionenstärkebedingungen die gleichen sind wie bei der Auswahl.

Nach dem Sammeln und Entsorgen der Medien im Kolben drei Milliliter PBS hinzufügen und über die Zellen verteilen. Nach Zugabe von einem Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA in jeden Kolben fünf bis 10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und die Ablösung der Zellen unter einem Mikroskop visualisieren. Als nächstes fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium zu den Zellen hinzu und pipetten die Zellen nach oben und unten, um eine Einzelzellsuspension herzustellen.

Die Zellen in ein geeignetes Röhrchen pipettieren und bei 200 G fünf Minuten lang zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Medium und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Färbung, indem Sie ein bestimmtes Volumen der Zellsuspension mit Trypanblau verdünnen. Verteilen Sie etwa 15 Mikroliter der Mischung zwischen einem Hämozytometer und einem Deckglas, um die Zellen zu zählen.

Sammeln Sie die erforderliche Anzahl von Zellen und stellen Sie sicher, dass Sie hunderttausend Zellen pro Testprobe haben. Dann inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden, um die Stabilisierung des interessierenden Proteins auf der Zellmembran nach enzymatischer Ablösung zu ermöglichen. Nach der zweistündigen Inkubation die Zellen fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugieren.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern blockierendem Puffer. Inkubieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius für 30 Minuten mit intermittierendem Mischen. Führen Sie während dieser 30-minütigen Inkubation eine Aptamerfaltung durch, indem Sie die doppelten Konzentrationen von Aptameren wie im Manuskript beschrieben vorbereiten.

Dann mischen und inkubieren Sie die Aptamere mit der Thermocycler-Maschine entsprechend den erforderlichen Faltbedingungen, wobei Sie sicherstellen, dass die Aptamere vor Licht geschützt werden. Nach der 30-minütigen Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen wie zuvor demonstriert und entfernen Sie den Überstand. Dann einen Milliliter Waschpuffer hinzufügen und die Zellen erneut zentrifugieren.

Nach dem Entfernen des Überstands resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen des Bindungspuffers. Als nächstes pipettieren Sie 50 Mikroliter der resuspendierten Zellen in jede Vertiefung einer eiskalten 96 Well-schwarzen Platte. Dann 50 Mikroliter der Aptamere auf ein 50 Mikroliter großes Zellvolumen pipettieren, mischen und bei Dunkelheit bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren.

Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands das Pellet vorsichtig im Waschpuffer resuspendieren und erneut fünf Minuten bei 500 G zentrifugieren. Anschließend in 100 Mikroliter Waschpuffer für die durchflusszytometrische Analyse resuspendieren, während der Waschschritt zweimal wiederholt wird. Schalten Sie zuerst das Durchflusszytometer und dann den Computer ein.

Öffnen Sie als Nächstes die Durchflusszytometrie-Analysesoftware, melden Sie sich beim Programm an und führen Sie auf der Registerkarte Zytometer den Flüssigkeitsstart aus. Um ein neues Experiment zu erstellen, klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neuer Ordner, und benennen Sie den Ordner entsprechend Schrägstrichexperiment. Klicken Sie auf den neuen Ordner, um ihn zu markieren.

Klicken Sie dann erneut auf der Registerkarte Experiment auf Neues Experiment, und benennen Sie das Experiment entsprechend. Um die erste Probenschrägstrichprobe hinzuzufügen, klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neue Probe und benennen Sie die Probe entsprechend. Um eine Röhrchenprobe hinzuzufügen, markieren Sie die Probe, und klicken Sie auf der Registerkarte Experiment auf Neues Röhrchen.

Fügen Sie dann die entsprechende Anzahl von Röhren und den Namen hinzu. Um die erforderlichen Diagramme vorzubereiten, öffnen Sie auf einer Arbeitsblattregisterkarte ein neues Arbeitsblatt. Sobald das neue Arbeitsblattfenster angezeigt wird, bereiten Sie ein Punktfleckdiagramm der Seitenstreuung im Vergleich zur Vorwärtsstreuung vor, um die gewünschte Grundgesamtheit auszuwählen.

Bereiten Sie ein Punkt-Blot-Diagramm der Vorwärtsstreuhöhe im Vergleich zum Vorwärtsstreubereich vor, um die einzelne Zellpopulation auszuwählen. Als nächstes bereiten Sie ein Histogramm der Anzahl der Ereignisse gegen das interessierende Fluorophor vor. Stellen Sie sicher, dass das Erfassungs-Dashboard zur Steuerung der Probenaufnahme, des Inspektors und des Zytometers zur Anpassung der Spannungsparameter sowie das Arbeitsblatt mit allen Diagrammen geöffnet ist, bevor Sie mit der Durchflusszytometrie beginnen.

Führen Sie zuerst die unbehandelten Zellen aus. Stellen Sie sicher, dass der Pfeil, der auf die Röhre zeigt, grün ist. Wenn dieser Pfeil nicht grün ist, klicken Sie auf den Pfeil, um ihn grün zu machen.

Übertragen Sie mit der Pipette jede Probe von der 96 Well-Black-Platte in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Wählen Sie im Erfassungsdashboard eine geeignete Anzahl von Ereignissen aus, die aufgezeichnet werden sollen, ändern Sie die Durchflussrate in niedrig, und klicken Sie auf Daten erfassen. Passen Sie die Spannung für die FSC- und SCC-Parameter an, um sicherzustellen, dass die Zellpopulation innerhalb des Punktdiagramms zentralisiert ist und dass keine Zellen eine der beiden Achsen des Diagramms berühren, um den Verlust der interessierenden Zellen zu vermeiden.

Definieren Sie das erste Gatter, indem Sie die gewünschte Grundgesamtheit in einem Vorwärts- und Seitenstreudichtediagramm identifizieren und auswählen, während Sie die Trümmer ausschließen, die die Grundgesamtheit mit dem niedrigsten Vorwärtsstreusignal darstellen. Definieren Sie das zweite Tor, indem Sie Dublettenzellpopulationen ausschließen, da Dublettenzellen die Ergebnisse und Schlussfolgerungen erheblich beeinflussen. Erhöhen Sie die Erfassungsgeschwindigkeit auf mittel oder hoch, um die Proben schneller zu analysieren, überschreiten Sie jedoch nicht mehr als 200 bis 300 Ereignisse pro Sekunde.

Klicken Sie dann auf Daten aufzeichnen. Nachdem Sie die Spannung angepasst und die Daten angegessen und aufgezeichnet haben, nehmen Sie die Probe heraus und klicken Sie auf Next Tube. Legen Sie die nächste Probe ein und wiederholen Sie die Aufzeichnungsdaten für alle Kontroll- und Testproben.

Sobald alle Daten gesammelt sind, waschen Sie das Durchflusszytometer, indem Sie drei Röhrchen mit 50% Bleichmittel, FACSRinse und Reinstwasser jeweils fünf Minuten lang mit einer hohen Durchflussrate laufen lassen. Klicken Sie dann im Dropdown-Menü des Zytometers auf Fluidics Herunterfahren. Exportieren Sie das Ergebnis als fsc-Dateien auf ein USB-Laufwerk, um es zu übertragen.

Analysieren Sie sie mit der Analysesoftware, indem Sie auf die Schaltfläche "Neu" klicken, um ein neues Dokument und ein neues Fenster für die Analyse zu erstellen, und ziehen Sie die Beispieldateien in das neue Fenster. Doppelklicken Sie, um die ungefärbte Probe zu öffnen. Um die einzelne Zellpopulation zu gatesen, wählen Sie die P1-Population und doppelklicken Sie auf die P1-Population, um ein FSCH- versus FSCA-Diagramm zu erstellen.

Doppelklicken Sie auf die umzäunten Einzelzellen, um ein Histogramm der Ereignisse gegen das verwendete Fluorochrom zu erstellen. Wählen Sie im Originalfenster P1 und einzelne Zellen aus und ziehen Sie sie auf alle Proben, so dass alle Proben nun den gleichen Gating enthalten. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche des Layout-Editors, um das Layoutfenster zu öffnen, und ziehen Sie zwei Beispiele übereinander, um ein Overlay-Histogramm zu erstellen.

In EpCAM-positiven MDA-MB-231-Zellen zeigt die Überlagerung der Histogramme, die mit TEPP und TENN behandelte Zellen darstellen, dass die TEPP-behandelten Zellen im Vergleich zu den mit TENN behandelten Zellen nach rechts verschoben sind, was zeigt, dass die Bindung des TEPP-Aptamers an das interessierende Protein erfolgt. Bei der Negativkontrolle spiegeln HEK 293T-Zellen, die Histogramme von TEPP und TENN überlagern, keine Verschiebung wider, was darauf hindeutet, dass TEPP in EpCAM-exprimierenden Zellen der EpCAM-Aptamer ist, der an seinen Rezeptor gebunden ist. Darüber hinaus wurde keine Bindung in EpCAM-negativen Zellen beobachtet, was die Selektivität und Spezifität des entwickelten Aptamers bestätigt.

Stellen Sie sicher, dass die Aptamere vor Licht geschützt sind, die Aptamere und Zellen auf der Platte gemischt sind und die richtigen Spannungen auf dem Durchflusszytometer eingestellt sind. Dies hängt stark von zukünftigen Anwendungen der Aptamere ab. Zum Beispiel konzentrieren wir uns auf die Medikamentenabgabe.

Der nächste Schritt für uns wäre also, mittels Fluoreszenzmikroskopie zu beurteilen, ob die Aptamere internalisiert werden. Dieses Protokoll hat gezeigt, wie einfach es für Aptamere ist, monoklonale und polyklonale Antikörper in Immunphänotypisierungsassays zu ersetzen.