Fäkalisolierung der Maus und Mikrobiota-Transplantation

Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das andere bei der Untersuchung der Mechanismen der Dysbiose bei Krankheiten anleiten soll, von der Entnahme von Kotproben bis hin zur Verwendung der Swiss-Roll-Methode zur Untersuchung von Veränderungen im Darm. Besprühen Sie zunächst die Brust und die Seiten der euthanasierten Maus mit 70%igem Ethanol und öffnen Sie vorsichtig die Haut und die Bauchhöhle, um den Magen-Darm-Trakt freizulegen. Isolieren Sie den Blinddarm und schneiden Sie ihn mit einer sterilen chirurgischen Schere in zwei Hälften.

Legen Sie den Blinddarm kurz frei und schneiden Sie 0,5 Zentimeter proximal vom Ileum und 0,5 Zentimeter distal an seinem Übergang zum Dickdarm ab. Übertragen Sie den isolierten Blinddarm in eine sterile Petrischale. Verwenden Sie einen sterilen Spatel, um den Blinddarminhalt in sterile Röhrchen umzufüllen, und bewahren Sie die Aliquots in einem Gefrierschrank bei 80 Grad Celsius auf.

Frische oder zuvor gefrorene Kotpellets in steriler Kochsalzlösung im Verhältnis 1 bis 20 erneut suspendieren und bis zur Homogenisierung vortexen. Führen Sie das Homogenat durch einen Nylonfilter mit 30 Mikrometerporen, um große Partikel zu entfernen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 79 G und sammeln Sie den Überstand, um ihn für die Transplantation zu verwenden.

Orale Sonde 100 Mikroliter der Aufschlämmung pro keimfreier Empfängermaus an drei aufeinanderfolgenden Tagen, gefolgt von Sonde alle drei Tage für zwei Wochen. Legen Sie die Maus vorsichtig in Fesseln auf den vorgeheizten Maushalter und lassen Sie den Schwanz draußen. Kleben Sie die Oberseite vorsichtig ab, ohne sie einzuklemmen, um die Maus nicht zu belasten.

Lassen Sie die Maus in der Halterung ruhen und legen Sie sie drei bis fünf Minuten lang auf die Plattform der Schwanzmanschettenmaschine, die zur Akklimatisierung mit einem Laken bedeckt ist. Sammeln Sie mindestens drei Runden systolischer Druckmessungen mit Hilfe der Schwanzmanschettenplethysmographie und mitteln Sie die Messungen aus allen Runden für einen durchschnittlichen systolischen Druck für jedes Tier. Sammeln Sie den Blinddarminhalt der euthanasierten Maus aseptisch.

Um den Darm und andere Gewebe zu entnehmen, lokalisieren Sie das Gewebe in der Maus und schneiden Sie es mit einer Schere heraus, um die Rolle der Darmmikrobiota für die kardiometabolische Gesundheit zu untersuchen. Präparieren Sie am ersten Tag den Mäusedarm von der Analseite bis zur Magenseite. Und legen Sie den gesamten isolierten Magen-Darm-Trakt in eine Petrischale, die PBS enthält.

Ziehen Sie das proximale Ende vorsichtig vom Magenende ab und entfernen Sie das umgebende Fett und Bindegewebe von Hand. Isolieren Sie den Dünndarm und machen Sie mit jeder Länge ein Zickzack vom Typ Z. Schneiden Sie dann, um den Zwölffingerdarm, das Jejunum und das Ileum zu erhalten.

Isolieren Sie den Dickdarm, indem Sie den Darmabschnitt unterhalb des Blinddarms durchtrennen. Schneiden Sie den Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den Dickdarm durch. Verwenden Sie eine Spritze und eine Nadel mit Kugelspitze, um den Darm vorsichtig zu spülen und mit PBS zu waschen, ohne den Darm zu zerreißen.

Legen Sie den Darm auf Filterpapier und beschriften Sie das Papier mit dem Namen des Abschnitts und dann P in der oberen linken Ecke für proximal oder D für distal in der unteren linken Ecke. Schneiden Sie den Darm mit einer Kugelschere in Längsrichtung durch. Öffnen Sie den Darm auf dem Filterpapier und waschen Sie ihn nach Bedarf mit mehr PBS.

Klemmen Sie den Darm zwischen zwei Filterpapiere und heften Sie die Filterpapiere an vier Punkten oder Ecken in der Nähe des Darms. In 10%iger Formalin-Neutralpufferlösung einweichen und mit einer Plattformwippe über Nacht bei Raumtemperatur bei fünf Umdrehungen pro Minute schütteln. Am zweiten Tag die vorbereiteten 2%Agarose in destilliertem Wasser mit einem Rührstab in einem mit Alufolie abgedeckten Becherglas erhitzen.

Um das Gewebe zu entnehmen, ziehen Sie das obere Filterpapier ab und rollen Sie den Darm von der proximalen Seite, so dass die proximale Seite zuerst nach innen geht, und rollen Sie ihn nach innen, so dass sich das Lumen auch auf dem Objektträger befindet. Stiften Sie je nach Bedarf mit einer oder zwei 30-Gauge-Nadeln. Aspirieren Sie einen Milliliter Agarose mit Einweg-Transferpipetten und gießen Sie die Agarose auf einen gerollten Darmabschnitt auf einer ebenen Oberfläche, wobei Luftblasen im Gewebe vermieden werden.

Nachdem die Agarose abgekühlt und erstarrt ist, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die überschüssige Agarose um den Gewebeabschnitt herum zu kürzen. Zum Schluss werden die Darmabschnitte in Gewebeverarbeitungs- oder Einbettkassetten gelegt und bei vier Grad Celsius in 70%igem Ethanol eingeweicht. Die Abschätzung der Artenbiodiversität im Blinddarmgehalt von Mäusen mit normaler Salzdiät und salzreicher Diät wird hier gezeigt.

Zu den Veränderungen der Darmmikrobiota als Reaktion auf den hohen Salzgehalt gehörte eine Abnahme der bakteriellen Artenvielfalt. Eine nicht-metrische mehrdimensionale Skalierung zeigt, dass die Bakterien von Mäusen mit normalem Salz und salzreicher Diät separate Cluster bilden. Ein hoher Salzgehalt ist mit einem erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes verbunden.

Die fäkale Mikrobiota-Transplantation von Mäusen, die mit hohem Salzgehalt gefüttert wurden, prädisponiert keimfreie Mäuse für Angiotensin II-induzierte Hypertonie. Die Übertragung einer durch hohes Salz induzierten dysbiotischen Darmmikrobiota war bei keimfreien Mäusen mit einem signifikant erhöhten systolischen Druck im Vergleich zu Mäusen verbunden, die eine normale Salzdarmmikrobiota erhielten. Die repräsentativen Bilder zeigen eine Apolipoprotein-A-I-Färbung in Darmbein, die von Mäusen mit Hyperlipidämie ohne oder mit Proteinurie gewonnen wurde.

Dieses Protokoll stimmt die Schritte zur Erzielung einer erfolgreichen FMT in wichtigen experimentellen Überlegungen sowohl für menschliche als auch für Nagetierspender ab.