Name: Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Lernen Sie hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurotoxizität. Diese Methode ermöglicht die Bewertung potenzieller anti-neuroinflammatorischer Wirkstoffe.

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Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Science and Technology Development Fund (FDCT) der Sonderverwaltungszone Macau unterstützt (Ref. FDCT0058/2019/A1 und 0016/2019/AKP), Forschungsausschuss, Universität Macau (MYRG2020-00183-ICMS und CPG2022-00023-ICMS) und National Natural Science Foundation of China (Nr. 81803398).

AB-Wildtyp-Zebrafische und transgene Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden vom Institute of Chinese Medical Sciences (ICMS) bezogen. Die ethische Genehmigung (UMARE-030-2017) für die Tierversuche wurde von der Ethikkommission für Tierforschung der Universität Macau erteilt, und das Protokoll folgt den Richtlinien der institutionellen Tierpflege.
1. Zebrafischembryonen- und Larvenhaltung
<ol><li>Erzeugung von Zebrafischembryonen (200-300 Embryonen pro Paarung) durch natürliche paarweise Paarung, wie bereits berichtet28.</li>
	<li>Eiwasser (E3) Medium (60×) durch Auflösen von 34,8 g NaCl, 1,6 g KCl, 5,8 g CaCl 2·2H2O und 9,78 g MgCl 2·6H2O inddH2Ozu einem Endvolumen von 2 L vorbereiten und denpH-Wert mit NaOH und HCl auf7,2 einstellen. Zur Herstellung der Arbeitskonzentration von E3-Medium (1×) wird die Brühe 60-mal in ddH2O verdünnt. Bei Nichtgebrauch bei 28,5 °C lagern.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Transferpipette aus Kunststoff, um die Zebrafischembryonen in eine Schale mit E3-Medium zu übertragen. Ziehen Sie die Embryonen bei 28,5 °C in einem Inkubator auf und überwachen Sie ihre Entwicklung und Gesundheit. Entfernen Sie täglich tote Embryonen und ersetzen Sie unreines E3-Medium durch frisches Medium.</li>
	<li>Verwenden Sie für Zebrafisch-Bildgebungsexperimente eine Kunststofftransferpipette, um 0-2 h nach der Befruchtung (hpf) Embryonen (etwa 200 Eier) in etwa 15 ml 1× E3-Medium zu sammeln, das 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) enthält. HINWEIS: PTU kann die Bildung von Melanophoren während der Embryogenesehemmen 29. Die Behandlung von Embryonen mit PTU während der Embryogenese kann die Signalerkennung in der Mikroskopie oder die Expression von Fluoreszenzverbessern 30.</li>
	<li>Halten Sie die Zebrafischembryonen unter den oben genannten Bedingungen aufrecht, bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungslarvenstadium erreichen.</li>
</ol>2. Vorbereitung für die Mikroinjektion
<ol><li>Bereiten Sie sich auf die Injektion vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher ziehen (siehe Materialtabelle) und befolgen Sie das fünfstufige Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarrohren (Tabelle 1).</li>
	<li>Öffnen Sie die Nadelspitze (dünnwandige Glaskapillaren [3,5 Zoll] mit Filament, AD 1,14 mm) mit einer Pinzette in einem Winkel auf die entsprechende Größe (Abbildung 2A).</li>
	<li>Füllen Sie die Nadel mit 0,1 ml Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind.</li>
	<li>Entfernen Sie den Schraubverschluss der Stahlnadel der Mikroinjektionsvorrichtung. Richten Sie das Glasnadelloch mit der Stahlnadel aus und ziehen Sie dann den Schraubverschluss fest. Montieren Sie die beladene Nadelmikroinjektionsvorrichtung in einem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Stellen Sie die Position der Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass der Mikromanipulator die Apparatur flexibel unter dem Mikroskop bewegen kann. Entladen Sie eine bestimmte Menge Paraffinöl, damit die Stahlnadel in das Kapillarglasrohr eintritt.</li>
	<li>Tropfen Sie die Injektionslösung (z. B. 1× PBS oder 5 mg/ml LPS) auf einen mit 70% Ethanol sterilisierten Glasobjektträger und stellen Sie die Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass die Spitze in den Flüssigkeitstropfen eingeführt wird. Laden Sie ~ 2 μL Injektionslösung in die Nadel.</li>
	<li>Stellen Sie den Mikromanipulator (Feineinstellung von oben, unten, links und rechts) so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsapparates bei starker Vergrößerung im gleichen Sichtfeld wie die Larven befindet (Abbildung 2B).</li>
</ol>3. Montage von Zebrafischen für Mikroinjektionen
HINWEIS: Die Entwicklung des Gehirns von Zebrafischen erfolgt innerhalb von 3 dpf und reift bei 5 dpf mit einem gut entwickelten zentralen Nervensystem31,32. Daher eignen sich bereits 5 dpf-Larven zur Untersuchung von LPS-vermittelten neuronalen Schäden sowie Verhaltens- und Entzündungsreaktionen.
<ol><li>Injizieren Sie die Zebrafischlarven innerhalb von ca. 30 Minuten nach Erreichen des interessierenden Stadiums, um die Konsistenz des Injektionszeitpunkts zu erhalten.</li>
	<li>Um die Zebrafischlarven zu betäuben, kombinieren Sie Tricain mit sauberem Aquarienwasser (Endkonzentration von 0,02% w/v Tricain).</li>
	<li>Eine Lösung von 2% Agarose inddH2Owird mit einer Mikrowelle geschmolzen. Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Die 2%ige Agarose-beschichtete Kunststoffschale kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um betäubte Larven in die Mitte der 2% agarosebeschichteten Kunststoffschale zu transportieren. Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Nadelzugang zu erhalten.</li>
</ol>4. Injektion des Hirnventrikels
<ol><li>Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die hirnventrikuläre Struktur von Zebrafischen im Sichtfeld deutlich dargestellt wird (Abbildung 2B).</li>
	<li>Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntectum (Abbildung 2C).</li>
	<li>Punktieren Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator.</li>
	<li>Drücken Sie das Fußpedal, um 1 nL 1x PBS oder unterschiedliche LPS-Konzentrationen (1,0, 2,5 und 5,0 mg/ml) auszustoßen (siehe Materialtabelle). Erfolgreiche Ventrikelinjektionsbilder, bei denen dem Hirnventrikel 1 nL 1% Evansblau-Farbstoff (verdünnt in PBS) injiziert wurde, sind als Beispiel gezeigt (Abbildung 2D). Die Larven werden unmittelbar nach der Injektion in ein sauberes E3-Medium überführt. Nach 24 h sammeln Sie die Larven für die mikroskopische Bildgebung, den Bewegungsverhaltenstest und die Bestimmung anderer Indikatoren.</li>
</ol>5. Bildgebung
<ol><li>Bereiten Sie 1,5% niedrigschmelzige Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitzen Sie sie in einer Mikrowelle, um eine klare Flüssigkeit zu bilden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine saubere Kunststoff-Transferpipette, um die Larven zu einem Glasobjektträger zu transportieren und so viel Wasser wie möglich zu entfernen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um den Larven einen Tropfen 1,5% niedrig schmelzende Agarose hinzuzufügen. HINWEIS: Kühlen Sie die niedrig schmelzende Agarose vor dem Hinzufügen eine Weile in der Pipette ab, um die Larven nicht zu verletzen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 1-ml-Spritzennadel, um die Larven zu orientieren. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist und sich verfestigt, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.</li>
	<li>Beobachten und fotografieren Sie die Neuronenregion im gesamten Gehirn von Tg(ETvmat2:EGFP) und Tg(elavl3:mCherry) Zebrafischen sowie die Rekrutierung von Neutrophilen im Tg(mpo:EGFP)-Zebrafischgehirn unter einem Fluoreszenzstereomikroskop (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Die Einstellungen des Fluoreszenzmikroskops, die für die Bildgebung verwendet werden, sind unten aufgeführt. Tg(ETvmat2:EGFP) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 450-490 nm, Emissionswellenlänge: 500-550 nm, visuelle Vergrößerung: 100x); Tg(elavl3:mCherry) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 541-551 nm, Emissionswellenlänge: 590 nm, visuelle Vergrößerung: 100x); Tg(mpo:EFGP) Zebrafischgehirn (Anregungswellenlänge: 450-490 nm, Emissionswellenlänge: 500-550 nm, visuelle Vergrößerung: 63x).</li>
	<li>Messen und analysieren Sie die Fluoreszenzintensität und -länge der Ra-Neuronenregion im Tg(ETvmat2:EGFP)-Zebrafisch und die Fluoreszenzintensität von Tg(elavl3:mCherry)-Zebrafisch-Gehirnneuronen mit der ImageJ-Software. Zählen Sie manuell die Neutrophilen in der Gehirnregion von Tg (mpo: EFGP) Zebrafisch.</li>
</ol>6. Bestimmung von Genexpressionsmarkern
<ol><li>Fahren Sie 24 h nach der ventrikulären LPS-Hirninjektion mit der Bestimmung der Genexpressionsmarker fort. Betäuben Sie dazu Zebrafischlarven mit 0,02% Tricain (wie in Schritt 3.2 erwähnt).</li>
	<li>Verwenden Sie zwei 1-ml-Spritzen, um die Kopfteile der Larven (40 Larven pro Gruppe) ohne Augen- und Dottersackregionen zu trennen (Abbildung 2E).</li>
	<li>Extrahieren Sie RNA aus den Larvenkopfabschnitten.<ol><li>Für die RNA-Extraktion homogenisieren Sie den Kopfteil mit 200 μL RNA-Extraktionsreagenz (siehe Materialtabelle) mit einem Gewebeschleifer (siehe Materialtabelle) bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 11.000 U/min für 5 s.</li>
		<li>Führen Sie die RNA-Extraktion mit der Chloroform-Isopropanol-Methode durch. Dazu 40 μL Chloroform zugeben, die Röhrchen kräftig schütteln und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.</li>
		<li>Die wässrige Phase wird in ein frisches Röhrchen (ca. 100 μL) überführt und 100 μL Isopropanol zugegeben. 10 min inkubieren und dann bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.</li>
		<li>Fügen Sie 200 μL 75% Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen. Die Proben kurz vortex und dann bei 7500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie das RNA-Pellet erneut.</li>
		<li>Trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft für 5-10 min, dann fügen Sie 30 μL RNase-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen. Überprüfen Sie die Reinheit (Absorptionsverhältnis bei 260 nm und 280 nm) und Integrität der RNA mit einem Mikrovolumen-Spektralphotometer (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
	<li>Synthetisieren Sie cDNA aus der in Schritt 6.3 extrahierten RNA unter Verwendung der reversen Transkriptase mit zufälligen Primern (siehe Materialtabelle).<ol><li>Geben Sie 1 μL zufällige Primer, 1 μL dNTPs, 1 μg RNA und destilliertes Wasser (Gesamtvolumen bis 12 μL) in ein nukleasefreies Röhrchen. Die Mischung 5 min auf 65 °C erhitzen und auf Eis schnell kalt stellen.</li>
		<li>Geben Sie 1 μL 0,1 M DTT, 1 μL RNase-Inhibitor, 4 μL 5× Erststrangpuffer und 1 μL M-MLV-Reverse-Transkriptase (Gesamtvolumen: 20 μL) in die Röhre. Mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie das Röhrchen bei 25 °C für 2 min, gefolgt von 42 °C für 50 min. Inaktivieren Sie die Reaktion durch Erhitzen bei 70 °C für 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Durchführung einer Echtzeit-PCR an einem qPCR-System (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RT-qPCR-Kits (siehe Materialtabelle), um die Expression der Zielgene (IL-1β, IL-6 und TNF-α) zu bestimmen. Das Reaktionsgemisch (20 μL) enthielt 10 μL SYBR-Grün, 0,4 μL ROX-Referenzfarbstoff, je 0,8 μL der Forward- und Reverse-Primer, 6 μLddH2Ound 2 μL Template-cDNA (1 μg). Die PCR-Amplifikation wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 5 s und 60 °C für 34 s und mit einer Dissoziationsstufe von 95 °C für 15 s, 60 °C für 60 s und 95 °C für 15 s.</li>
	<li>Normalisieren Sie die mRNA-Spiegel der Zielgene auf die eines Housekeeping-Gens, Elongationsfaktor 1 α (Ef1α). Die Expressionsniveaus für jedes Zielgen werden mit der 2−ΔΔCT-Methode33 berechnet. Die Primersequenzen jedes Gens sind in Tabelle 2 beschrieben.</li>
	<li>Zur Bestimmung von Stickstoffmonoxid homogenisieren Sie den Kopfteil (erhalten in Schritt 6.2) in 100 μL kaltem PBS mit einem Gewebeschleifer. Zentrifugieren Sie die resultierende PBS- und Kopfteilsuspension bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Sammeln Sie die Lysate und führen Sie den Nitritkonzentrationstest34 mit einem handelsüblichen Kit durch (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>7. Verhaltenstest der Zebrafisch-Lokomotive
<ol><li>24 h nach LPS-Hirnventrikelinjektion werden die Zebrafischlarven einzeln in die Vertiefungen einer quadratischen 96-Well-Mikroplatte überführt. Geben Sie 300 μL E3-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie dann die Larven für 4 Stunden, um sich an die Testplatte zu gewöhnen.</li>
	<li>Die mit Larven beladene Mikroplatte wird in die Zebrafisch-Trackingbox überführt (siehe Materialtabelle). Schalten Sie die Lichtquelle ein und inkubieren Sie dann die Larven in der Testbox für 30 Minuten, um die Umgebung zu akklimatisieren.</li>
	<li>Überwachen und zeichnen Sie das Verhalten des Zebrafischs mit einem automatisierten Video-Tracking-System auf. Nehmen Sie 12 Sitzungen (jeweils 5 Minuten, insgesamt 1 h) für jeden Zebrafisch auf. Definieren Sie die Gesamtdistanz (bestehend aus inaktiven, kleinen und großen Entfernungen) als die Entfernung (in mm), die jeder Fisch während eines 60-minütigen Tracking-Zeitraums zurückgelegt hat.</li>
</ol>8. Statistische Auswertung
<ol><li>Führen Sie statistische Analysen mit Standard-Analysesoftware durch (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie eine statistische Analyse der Unterschiede zwischen zwei Gruppen mit gewöhnlicher Einweg-ANOVA durch. Berechnen Sie den Korrelationskoeffizienten von Pearson, um die Stärke von Korrelationen zu bewerten. P < 0,05 wurde in allen Analysen als signifikant angesehen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären kein konkurrierendes finanzielles Interesse.

Immer mehr epidemiologische und experimentelle Daten implizieren chronische bakterielle und virale Infektionen als mögliche Risikofaktoren für neurodegenerative Erkrankungen36. Die Infektion löst die Aktivierung von Entzündungsprozessen und Immunantworten des Wirts aus37. Selbst wenn die Reaktion als Abwehrmechanismus wirkt, ist eine überaktivierte Entzündung schädlich für die Neurogenese, und die entzündliche Umgebung ermöglicht nicht das Überleben neugeborener Neuronen<su...

Neuroinflammation wurde als entscheidender antineurogener Faktor beschrieben, der an der Pathogenese mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) beteiligt ist1. Nach pathologischen Beleidigungen kann eine Neuroinflammation zu verschiedenen nachteiligen Folgen führen, einschließlich der Hemmung der Neurogenese und der Induktion des neuronalen Zelltods 2,3. In dem Prozess, der der Reaktion auf die Entzündungsinduktion zugrunde liegt, werden mehrere entzündliche Zytokine (wie TNF-α, IL-1β und IL-6) in den extrazellulären Raum sezerniert und wirken als entscheidende Komponenten beim Neuronentod und der Unterdrückung der Neurogenese 4,5,6.
Die Mikroinjektion von Entzündungsmediatoren (wie IL-1β, L-Arginin und Endotoxine) in das Gehirn kann eine neuronale Zellreduktion und Neuroinflammation verursachen 7,8,9. Lipopolysaccharid (LPS, Abbildung 1), ein pathogenes Endotoxin, das in der Zellwand gramnegativer Bakterien vorhanden ist, kann Neuroinflammation induzieren, Neurodegeneration verschlimmern und die Neurogenese bei Tieren reduzieren10. LPS-Injektion direkt in das ZNS des Mausgehirns erhöhte den Gehalt an Stickstoffmonoxid, entzündungsfördernden Zytokinen und anderen Regulatoren11. Darüber hinaus kann die stereotaktische Injektion von LPS in die lokale Gehirnumgebung eine übermäßige Produktion neurotoxischer Moleküle induzieren, was zu einer Beeinträchtigung der neuronalen Funktion und der anschließenden Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen führt 10,12,13,14,15. Im Bereich der Neurowissenschaften sind Live- und Zeitverlaufsmikroskopische Beobachtungen zellulärer und biologischer Prozesse in lebenden Organismen entscheidend für das Verständnis der Mechanismen, die der Pathogenese und der pharmakologischen Wirkung zugrunde liegen16. Die Live-Bildgebung von Mausmodellen der Neuroinflammation und Neurotoxizität wird jedoch grundlegend durch die begrenzte optische Eindringtiefe der Mikroskopie eingeschränkt, was funktionelle Bildgebung und Live-Beobachtung von Entwicklungsprozessen ausschließt17,18,19. Daher ist die Entwicklung alternativer Neuroinflammationsmodelle von großem Interesse, um die Untersuchung der pathologischen Entwicklung und des Mechanismus, der Neuroinflammation und Neurodegeneration zugrunde liegt, durch Live-Bildgebung zu erleichtern.
Zebrafisch (Danio rerio) hat sich aufgrund seines evolutionär konservierten angeborenen Immunsystems, der optischen Transparenz, der großen Embryonengelegegröße, der genetischen Traktierbarkeit und der Eignung für die In-vivo-Bildgebung als vielversprechendes Modell zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurodegeneration erwiesen 19,20,21,22,23 . Frühere Protokolle haben LPS entweder direkt in das Eigelb und den Hinterhirnventrikel von Zebrafischlarven ohne mechanistische Bewertung injiziert oder einfach LPS zu Fischwasser (Kulturmedium) hinzugefügt, um eine tödliche systemische Immunantwort zu induzieren24,25,26,27. Hier haben wir ein Protokoll für die Mikroinjektion von LPS in die Hirnventrikel entwickelt, um eine angeborene Immunantwort oder Neurotoxizität in den 5 Tagen nach der Befruchtung (DPF) Zebrafischlarven auszulösen. Diese Reaktion wird durch neuronalen Zellverlust, ein Defizit des Bewegungsverhaltens, eine erhöhte Nitritoxidfreisetzung, die Aktivierung der entzündlichen Genexpression und die Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn 24 Stunden nach der Injektion nachgewiesen.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6361</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject III Programmierbarer Nanoliter-Injektor</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Stereomikroskope</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Software</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 7.04</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide aus Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3024</td><td></td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P qPCR-System</td><td>Agilent Technologies</td><td>Mx3005P</td><td></td></tr><tr><td>Nanovue plus Spektralphotometer</td><td>Biochrom</td><td>80-2140-46</td><td></td></tr><tr><td>Nitritkonzentrations-Assay-Kit</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0021M</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Programmierbarer horizontaler Pipettenabzieher</td><td>World Precision Instruments</td><td>PMP-102</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-Phenylthioharnstoff)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Zufällige</td> <td>PrimerTakara</td><td>3802</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transkriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II Kit</td><td>Accurate Biology</td><td>AG11701</td><td></td></tr><tr><td>The 3rd Gen Tgrinder</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td></td></tr><tr><td>Dünnwandige Glaskapillaren (4") mit Filament, AD 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (3-Aminobenzoesäure-Ethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>TRNzol Universalreagenz</td><td>Tiangen</td><td>DP424</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch-Tracking-Box</td><td>ViewPoint Behavior Technology</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hirnventrikuläre mikroinjektionen von lipopolysaccharid in zebrafischlarven zur beurteilung von neuroinflammation und neurotoxizität

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation ist eine Schlüsselrolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, alternative in vivo Neuroinflammationsmodelle zu erforschen und zu entwickeln, um die Rolle der Neuroinflammation bei der Neurodegeneration zu verstehen. In dieser Studie wurde ein Larven-Zebrafisch-Modell der Neuroinflammation entwickelt und validiert, das durch ventrikuläre Mikroinjektion von Lipopolysaccharid (LPS) vermittelt wird, um eine Immunantwort und Neurotoxizität zu induzieren. Die transgenen Zebrafischlinien elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP und mpo:EGFP wurden zur Echtzeit-Quantifizierung der Lebensfähigkeit von Gehirnneuronen durch Fluoreszenz-Live-Bildgebung mit Fluoreszenzintensitätsanalyse verwendet. Das Bewegungsverhalten von Zebrafischlarven wurde automatisch mit einem Video-Tracking-Rekorder aufgezeichnet. Der Gehalt an Stickstoffmonoxid (NO) und die mRNA-Expressionsniveaus von entzündlichen Zytokinen einschließlich Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-1β (IL-1β) und humanem Tumornekrosefaktor α (TNF-α) wurden untersucht, um die LPS-induzierte Immunantwort im Larvenkopf des Zebrafisches zu beurteilen. 24 h nach der hirnventrikulären Injektion von LPS wurden bei Zebrafischlarven Neuronenverlust und Bewegungsmangel beobachtet. Darüber hinaus erhöhte die LPS-induzierte Neuroinflammation die NO-Freisetzung und die mRNA-Expression von IL-6, IL-1β und TNF-α im Kopf von 6 Tagen nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven und führte zur Rekrutierung von Neutrophilen im Zebrafischgehirn. In dieser Studie wurde die Injektion von Zebrafischen mit LPS in einer Konzentration von 2,5-5 mg/ml bei 5 dpf als optimale Bedingung für diesen pharmakologischen Neuroinflammationstest bestimmt. Dieses Protokoll stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik für die Mikroinjektion von LPS in Hirnventrikeln vor, um LPS-vermittelte Neuroinflammation und Neurotoxizität in einer Zebrafischlarve zu induzieren, die für die Untersuchung von Neuroinflammation nützlich ist und auch als Hochdurchsatz-In-vivo-Drogenscreening-Assay verwendet werden könnte.

Der hier beschriebene Workflow stellt eine neue, schnelle und effiziente Methodik zur Induktion von LPS-vermittelter Neuroinflammation und Neurotoxizität in Zebrafischlarven dar. In diesem beschriebenen Protokoll wurden 5 dpf Zebrafische mit LPS (Abbildung 1) in Hirnventrikel mit einem Mikroinjektor injiziert (Abbildung 2A-C). Die erfolgreiche Injektion in die Hirnventrikelstelle wurde anhand von 1% Evansblau-Färbung überprüft (...

Dieses Protokoll demonstriert die Mikroinjektion von Lipopolysaccharid in die ventrikuläre Hirnregion in einem Zebrafisch-Larvenmodell, um die resultierende neuroinflammatorische Reaktion und Neurotoxizität zu untersuchen.

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Neuroinflammation ist eine Schlüsselrolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, alternative in vivo Neuroinflammationsmodelle zu erforschen und zu entwickeln, um Studien der pathologischen Entwicklung zu erleichtern. Die hier beschriebene Technik ist ein hervorragendes Werkzeug, um krankhafte Veränderungen im Gehirn mittels In-vivo-Bildgebung besser zu verstehen und mögliche entzündungshemmende Medikamente schnell und effizient zu bewerten.Bereiten Sie sich auf die Injektion vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher nach dem fünfstufigen Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarrohren ziehen. Öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette schräg auf die entsprechende Größe. Füllen Sie die Nadel mit 0,1 Milliliter Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen.Entfernen Sie den Schraubverschluss der Stahlnadel der Mikroinjektionsvorrichtung. Richten Sie das Glasnadelloch mit der Stahlnadel aus und ziehen Sie dann den Schraubverschluss fest. Montieren Sie die beladene Nadelmikroinjektionsvorrichtung in einem Mikromanipulator.Stellen Sie die Position der Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass der Mikromanipulator die Apparatur flexibel unter dem Mikroskop bewegen kann. Entleeren Sie eine geeignete Menge Paraffinöl, die erforderlich ist, damit die Stahlnadel in das Kapillarglasrohr eintritt. Die Injektionslösung, bestehend aus PBS oder Lipopolysaccharid, wird auf einen mit 70% Ethanol sterilisierten Objektträger gegeben und die Mikroinjektionsvorrichtung so eingestellt, dass die Spitze in den Flüssigkeitstropfen eingeführt wird.Laden Sie etwa zwei Mikroliter Injektionslösung in die Nadel. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsapparates bei starker Vergrößerung im gleichen Sichtfeld wie die Larven befindet. Eine Lösung von 2%Agarose in doppelt destilliertem Wasser mit einer Mikrowelle schmelzen.Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um die betäubten Larven in die Mitte einer 2% agarosebeschichteten Kunststoffschale zu transportieren. Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Nadelzugang zu erhalten.Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die hirnventrikuläre Struktur von Zebrafischen im Sichtfeld deutlich dargestellt wird. Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntectum. Reinigen Sie den Gehirnbereich mit 70% Ethanol und punktieren Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator.Drücken Sie das Fußpedal, um einen Nanoliter 1X PBS oder verschiedene Konzentrationen von Lipopolysaccharid auszustoßen. Die Larven werden unmittelbar nach der Injektion in ein sauberes E3-Medium überführt. Nach 24 Stunden sammeln Sie die Larven für die mikroskopische Bildgebung, den Bewegungsverhaltenstest und die Bestimmung anderer Indikatoren.Bereiten Sie 1,5% niedrig schmelzende Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitzen Sie sie in einer Mikrowelle, um eine klare Flüssigkeit zu bilden. Verwenden Sie eine saubere Kunststoff-Transferpipette, um die Larven zu einem Glasobjektträger zu transportieren und so viel Wasser wie möglich zu entfernen. Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um den Larven einen Tropfen 1,5% Low-Melt-Agarose hinzuzufügen.Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Larven zu orientieren. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist und sich verfestigt, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen. Fahren Sie 24 Stunden nach der ventrikulären Injektion des Lipopolysaccharids im Gehirn mit der Bestimmung der Genexpressionsmarker fort.Verwenden Sie zwei Ein-Milliliter-Spritzen, um die Kopfteile der Larven ohne Augen- und Dottersackregionen zu trennen. Homogenisieren Sie den Kopfteil mit 200 Mikrolitern RNA-Extraktionsreagenz mit einem Gewebemahlwerk bei 11.000 Umdrehungen pro Minute für fünf Sekunden und führen Sie dann die RNA-Extraktion mit der Chloroform-Isopropanol-Methode durch. Trocknen Sie das RNA-Pellet fünf bis 10 Minuten an der Luft und fügen Sie dann 30 Mikroliter RNAse-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen.Synthetisieren Sie cDNA unter Verwendung der reversen Transkriptase mit zufälligen Primern, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes führen Sie eine real-time PCR auf einem qPCR-System mit einem kommerziell erhältlichen RT-qPCR-Kit durch, um die Expression der Zielgene zu bestimmen. 24 Stunden nach der ventrikulären Injektion des Lipopolysaccharids des Gehirns werden die Zebrafischlarven einzeln in die Vertiefungen einer quadratischen Mikroplatte mit 96 Vertiefungen überführt.Fügen Sie 300 Mikroliter E3-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie dann die Larven für vier Stunden, um sich an die Testplatte zu akklimatisieren. Übertragen Sie die mit Larven beladene Mikroplatte in die Zebrafisch-Trackingbox. Schalten Sie die Lichtquelle ein und inkubieren Sie die Larven in der Testbox für 30 Minuten, um sich an die Umgebung zu gewöhnen.Überwachen und zeichnen Sie das Verhalten des Zebrafischs mit einem automatisierten Video-Tracking-System auf. Nehmen Sie 12 Sitzungen à fünf Minuten für einzelne Zebrafischlarven auf und definieren Sie die Gesamtdistanz wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der Behandlung über 24 Stunden induzierten ein bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid-ventrikuläre Hirninjektion einen signifikanten Verlust von RA-Neuronen im Gehirn von TgEtvmat2:GFP-Larvenzebrafischen im Vergleich zu den Kontroll- und Scheingruppen.Die transgene Linie elavl3:mCherry Zebrafisch zeigte signifikante Veränderungen in der fluoreszenzintegrierten Dichte von Larvenhirnneuronen, wenn 2,5 bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid injiziert wurden, während die Injektion von einem Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid keine Wirkung zeigte. Darüber hinaus induzierten fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid einen Fortbewegungsmangel und verringerten die Gesamtdistanz der Zebrafischbewegung über einen 60-minütigen Tracking-Zeitraum. Die Lachgasproduktion und mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine im Kopf von Zebrafischlarven war bei einer Behandlung mit 2,5 bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid im Vergleich zur Expression in der Kontroll- und Scheingruppe erhöht.Die Injektion von ein bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid zeigte die Rekrutierung von Neutrophilen in das Larvengehirn von Zebrafischen, was zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von Neutrophilen in der Tgmpo:eGFP-Zebrafischhirnregion führte. Die Öffnungsgröße der Nadeln und die Höhe der Injektionskraft für die Mikroinjektion sowie die Kopftrennung von Augen und Körper des Zebrafisches sind für dieses Verfahren entscheidend.

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Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

Dieses Video zeigt eine Methode zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven. Pilzsporen werden in den Ventrikel des Hinterhirns der Larve mikroinjiziert, und die Larven werden inkubiert, um die Entwicklung einer Infektion zu ermöglichen. Infizierte Larven werden in definierten Intervallen geerntet, und der Infektionsfortschritt wird durch die Aufzählung koloniebildender Einheiten bewertet.

Eine Technik zur Quantifizierung von Pilzinfektionen bei Zebrafischlarven

Das Video demonstriert eine Technik zum Verletzen und Einfangen von Zebrafischen zur Beobachtung von fluoreszenzmarkierten Pilzerregerinfektionen in Zebrafischlarven. Die Erstinfektion zieht Makrophagen an, und wenn die Infektion anhält, schreitet die Rekrutierung von Neutrophilen an der Injektionsstelle fort.

Eine zWEDGI-Technik zur Visualisierung von mit Pilzerregern infizierten Zebrafischlarven

Das Video zeigt die Mikroinjektion von Lipopolysacchariden (LPS) in das Gehirn von Zebrafischlarven, um Neuroinflammation zu induzieren. Die Larven werden auf eine mit Agarose ausgekleidete Schale gelegt, die Nadel wird in die Hirnventrikel eingeführt und das LPS injiziert. Das injizierte LPS löst eine Immunantwort aus, die zu Neuroinflammation führt.

Induktion von Neuroinflammation bei Zebrafischlarven mit einer Lipopolysaccharid-Injektion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erzeugung und Bildgebung einer lokalisierten bakteriellen Infektion im otischen Vesikel des Zebrafisches.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung von Hirnverletzungen, Bewegungsdefiziten und Neuroentzündungen nach Blutungen im Gehirn in Zebrafisch-Larven vor, im Zusammenhang mit der menschlichen intrazerebralen Blutung (ICH).

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Hier beschreiben wir die Synthese von medikamentenbelasteten Liposomen und deren Mikroinjektion in Larvenzebrafische zum Zweck der gezielten Medikamentenabgabe an Makrophagen-Linienzellen.

Targeting Drogen zu Larval Zebrafish Makrophagen durch Injektion von Drogen-geladenen Liposomen

Um zu modellieren, wie entzündliche Signale die Neuroentwicklung bei genetisch anfälligen Organismen beeinflussen, präsentieren wir ein Protokoll zur Mikroinjektion von IL-6 in den Gang des Cuvier (kardinalisten) von Zebrafischlarven, was eine kontrollierte Entzündungsinduktion und die Bewertung ihrer Entwicklungsauswirkungen im Kontext des tuberösen Sklerosekomplexes (TSC) ermöglicht.

Mikroinjektion von Interleukin-6 in den Blutkreislauf der TSC-Zebrafischlarven zur Untersuchung neuropsychiatrischer störungsähnlicher Verhaltensweisen

Lernen Sie hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Untersuchung von Neuroinflammation und Neurotoxizität. Diese Methode ermöglicht die Bewertung potenzieller anti-neuroinflammatorischer Wirkstoffe.

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität (Video) | JoVE Journal

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

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