Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Neuroinflammation ist eine Schlüsselrolle bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen. Daher ist es von großem Interesse, alternative in vivo Neuroinflammationsmodelle zu erforschen und zu entwickeln, um Studien der pathologischen Entwicklung zu erleichtern. Die hier beschriebene Technik ist ein hervorragendes Werkzeug, um krankhafte Veränderungen im Gehirn mittels In-vivo-Bildgebung besser zu verstehen und mögliche entzündungshemmende Medikamente schnell und effizient zu bewerten.

Bereiten Sie sich auf die Injektion vor, indem Sie Glaskapillaren mit einem Mikropipettenzieher nach dem fünfstufigen Protokoll für das Ziehen von Glaskapillarrohren ziehen. Öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette schräg auf die entsprechende Größe. Füllen Sie die Nadel mit 0,1 Milliliter Mineralöl, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen.

Entfernen Sie den Schraubverschluss der Stahlnadel der Mikroinjektionsvorrichtung. Richten Sie das Glasnadelloch mit der Stahlnadel aus und ziehen Sie dann den Schraubverschluss fest. Montieren Sie die beladene Nadelmikroinjektionsvorrichtung in einem Mikromanipulator.

Stellen Sie die Position der Mikroinjektionsvorrichtung so ein, dass der Mikromanipulator die Apparatur flexibel unter dem Mikroskop bewegen kann. Entleeren Sie eine geeignete Menge Paraffinöl, die erforderlich ist, damit die Stahlnadel in das Kapillarglasrohr eintritt. Die Injektionslösung, bestehend aus PBS oder Lipopolysaccharid, wird auf einen mit 70% Ethanol sterilisierten Objektträger gegeben und die Mikroinjektionsvorrichtung so eingestellt, dass die Spitze in den Flüssigkeitstropfen eingeführt wird.

Laden Sie etwa zwei Mikroliter Injektionslösung in die Nadel. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass sich die Nadelspitze des Mikroinjektionsapparates bei starker Vergrößerung im gleichen Sichtfeld wie die Larven befindet. Eine Lösung von 2%Agarose in doppelt destilliertem Wasser mit einer Mikrowelle schmelzen.

Gießen Sie die geschmolzene Agarose in eine Plastikschale. Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um die betäubten Larven in die Mitte einer 2% agarosebeschichteten Kunststoffschale zu transportieren. Richten Sie die montierten Larven mit der Gehirnseite nach oben aus, um den Nadelzugang zu erhalten.

Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops so ein, dass die hirnventrikuläre Struktur von Zebrafischen im Sichtfeld deutlich dargestellt wird. Platzieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Hirntectum. Reinigen Sie den Gehirnbereich mit 70% Ethanol und punktieren Sie die Haut des Zebrafischgehirns mit der Nadelspitze langsam mit dem Mikromanipulator.

Drücken Sie das Fußpedal, um einen Nanoliter 1X PBS oder verschiedene Konzentrationen von Lipopolysaccharid auszustoßen. Die Larven werden unmittelbar nach der Injektion in ein sauberes E3-Medium überführt. Nach 24 Stunden sammeln Sie die Larven für die mikroskopische Bildgebung, den Bewegungsverhaltenstest und die Bestimmung anderer Indikatoren.

Bereiten Sie 1,5% niedrig schmelzende Agaroselösung in E3-Medium vor und erhitzen Sie sie in einer Mikrowelle, um eine klare Flüssigkeit zu bilden. Verwenden Sie eine saubere Kunststoff-Transferpipette, um die Larven zu einem Glasobjektträger zu transportieren und so viel Wasser wie möglich zu entfernen. Verwenden Sie eine Kunststofftransferpipette, um den Larven einen Tropfen 1,5% Low-Melt-Agarose hinzuzufügen.

Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritzennadel, um die Larven zu orientieren. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist und sich verfestigt, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen. Fahren Sie 24 Stunden nach der ventrikulären Injektion des Lipopolysaccharids im Gehirn mit der Bestimmung der Genexpressionsmarker fort.

Verwenden Sie zwei Ein-Milliliter-Spritzen, um die Kopfteile der Larven ohne Augen- und Dottersackregionen zu trennen. Homogenisieren Sie den Kopfteil mit 200 Mikrolitern RNA-Extraktionsreagenz mit einem Gewebemahlwerk bei 11.000 Umdrehungen pro Minute für fünf Sekunden und führen Sie dann die RNA-Extraktion mit der Chloroform-Isopropanol-Methode durch. Trocknen Sie das RNA-Pellet fünf bis 10 Minuten an der Luft und fügen Sie dann 30 Mikroliter RNAse-freies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet aufzulösen.

Synthetisieren Sie cDNA unter Verwendung der reversen Transkriptase mit zufälligen Primern, wie im Textmanuskript beschrieben. Als nächstes führen Sie eine real-time PCR auf einem qPCR-System mit einem kommerziell erhältlichen RT-qPCR-Kit durch, um die Expression der Zielgene zu bestimmen. 24 Stunden nach der ventrikulären Injektion des Lipopolysaccharids des Gehirns werden die Zebrafischlarven einzeln in die Vertiefungen einer quadratischen Mikroplatte mit 96 Vertiefungen überführt.

Fügen Sie 300 Mikroliter E3-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie dann die Larven für vier Stunden, um sich an die Testplatte zu akklimatisieren. Übertragen Sie die mit Larven beladene Mikroplatte in die Zebrafisch-Trackingbox. Schalten Sie die Lichtquelle ein und inkubieren Sie die Larven in der Testbox für 30 Minuten, um sich an die Umgebung zu gewöhnen.

Überwachen und zeichnen Sie das Verhalten des Zebrafischs mit einem automatisierten Video-Tracking-System auf. Nehmen Sie 12 Sitzungen à fünf Minuten für einzelne Zebrafischlarven auf und definieren Sie die Gesamtdistanz wie im Textmanuskript beschrieben. Nach der Behandlung über 24 Stunden induzierten ein bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid-ventrikuläre Hirninjektion einen signifikanten Verlust von RA-Neuronen im Gehirn von TgEtvmat2:GFP-Larvenzebrafischen im Vergleich zu den Kontroll- und Scheingruppen.

Die transgene Linie elavl3:mCherry Zebrafisch zeigte signifikante Veränderungen in der fluoreszenzintegrierten Dichte von Larvenhirnneuronen, wenn 2,5 bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid injiziert wurden, während die Injektion von einem Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid keine Wirkung zeigte. Darüber hinaus induzierten fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid einen Fortbewegungsmangel und verringerten die Gesamtdistanz der Zebrafischbewegung über einen 60-minütigen Tracking-Zeitraum. Die Lachgasproduktion und mRNA-Expression proinflammatorischer Zytokine im Kopf von Zebrafischlarven war bei einer Behandlung mit 2,5 bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid im Vergleich zur Expression in der Kontroll- und Scheingruppe erhöht.

Die Injektion von ein bis fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid zeigte die Rekrutierung von Neutrophilen in das Larvengehirn von Zebrafischen, was zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl von Neutrophilen in der Tgmpo:eGFP-Zebrafischhirnregion führte. Die Öffnungsgröße der Nadeln und die Höhe der Injektionskraft für die Mikroinjektion sowie die Kopftrennung von Augen und Körper des Zebrafisches sind für dieses Verfahren entscheidend.