Name: Nagetiermodell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung durch Verschluss der Arteria mesenterica superior (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Lernen Sie ein chirurgisches Nagetiermodell zur Induktion intestinaler Ischämie-Reperfusionsverletzungen durch Okklusion der Arteria mesenterica superior. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen und therapeutischer Ansätze.

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Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der Abteilung für intramurale Forschung des National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, bereitgestellt.
Wir möchten Dr. James Hawkins für seine Mentorenschaft und Unterstützung danken. Wir danken auch Dr. Mihai Oltean und Dr. Robert Linford für ihre Unterstützung bei der Lokalisierung der Arteria mesenterica superior. Wir möchten uns bei Dr. Patricia Carvalho Obeid Ellrich, Claudio Correa Natalini und George Howell III für ihre Expertise bei der Entwicklung dieses Protokolls bedanken. Abschließend möchten wir Stephen Wincovitch für seine Unterstützung bei der Beschaffung der schönen Mikrofotografien in dieser Arbeit und Dr. Alicia Olivier für ihre Hilfe bei der Beschriftung und Darstellung der endgültigen Zahlen danken.

Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom National Heart, Lung, and Blood Institute Animal Care and Use Committee der National Institutes of Health genehmigt und entsprechen den Richtlinien, die in der Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, dem Animal Welfare Act und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschrieben sind.
1. Chirurgischer Aufbau
<ol><li>Befolgen Sie aseptische Verfahren. Ziehen Sie eine Maske an, eine Haarbedeckung und einen sauberen Overall/Laborkittel/OP-Kittel.</li>
	<li>Bereiten Sie die folgenden sterilisierten Materialien vor: chirurgische Instrumente (siehe Materialtabelle), warme Kochsalzlösung, Wattestäbchen, Gaze, chirurgische Klammern, OP-Abdeckungen und Handschuhe. Besorgen Sie sich auch chirurgisches Klebeband, das nicht sterilisiert werden muss. Sterilisieren Sie die Materialien entweder mit Autoklaven- oder Ethylenoxid-Sterilisationstechniken.</li>
	<li>Legen Sie eine beheizte zirkulierende Wasserdecke in den Operationsbereich und decken Sie sie mit einem sterilen Handtuch oder Tuch ab.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Präzisions-Isofluran-Verdampfer, medizinische Druckluft (21% O2) und einen Bain-Kreislauf ohne Rückatmung mit einem Nasenkonus, der für Mäuse entwickelt wurde, um eine chirurgische Anästhesie zu ermöglichen.</li>
</ol>2. Tierische Vorbereitung
<ol><li>Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer, indem Sie 2%-4% Isofluran mit 21% O2 medizinischer Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min für jeden Liter Kammervolumen abgeben. HINWEIS: Es ist vorzuziehen, für dieses spezielle Modell 21 % O2 medizinische Luft über 100 % O2 zu verwenden, da die Sättigung des Blutes mit O2 die IRI beeinträchtigen kann.</li>
	<li>Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und bewegen Sie sie auf eine saubere Oberfläche, die vom Operationsbereich getrennt ist. Montieren Sie es mit einem Nasenkonus, der 1,5 % Isofluran mit 21 % O2 medizinischer Luft liefert.</li>
	<li>Injizieren Sie 1 mg/kg Buprenorphin subkutan in den dorsalen zervikothorakalen Bereich.</li>
	<li>Injizieren Sie 200-600 I.E./kg Heparin intraperitoneal, um die Thrombusbildung während der Okklusion zu verhindern.</li>
	<li>Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie Haare aus dem Bauchbauch mit einer Haarschneidemaschine.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus auf die beheizte Wasserdecke im Operationsbereich. Setzen Sie es wieder mit einem Nasenkonus ein, der 1,5 % Isofluran mit 21 % O2 medizinischer Luft liefert, um eine chirurgische Anästhesieebene zu erreichen.</li>
	<li>Positionieren Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband am Tisch.</li>
	<li>Überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres rektal mit einem nagetierspezifischen Thermometer. Halten Sie die Körpertemperatur während der gesamten Operationsdauer bei 36,5 ± 0,5 °C.</li>
	<li>Desinfizieren Sie den ventralen Bauch mit steriler Gaze, die entweder mit Chlorhexidin-Peeling oder Povidon-Jod-Peeling getränkt ist, gefolgt von 70% Alkohol. Wiederholen Sie diese Sequenz dreimal, abwechselnd zwischen dem Peeling und dem Alkohol. Jedes Mal sollte ein neuer Satz Peelings und Alkoholgaze verwendet werden.<ol><li>Tragen Sie das Peeling und den Alkohol in kreisenden Bewegungen auf, beginnend mit kleinen Kreisen in der Mitte der Operationsstelle und arbeiten Sie sich allmählich zu den Rändern vor, indem Sie die Kreise vergrößern. Entsorgen Sie die Gaze, sobald der Rand der Operationsstelle erreicht ist. Schrubben Sie nicht rückwärts von der Kante zur Mitte.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie einen Zehenquetschtest (Pedalreflex) durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist.</li>
	<li>Ziehen Sie sterile Handschuhe an. Aseptisches Abdecken der Operationsstelle.</li>
</ol>3. Operation und Ischämie
<ol><li>Machen Sie mit einer #15-Skalpellklinge einen 3-5 cm langen ventralen Mittellinienschnitt in der Haut, präparieren Sie ihn frei von der darunter liegenden Muskelfaszie und reflektieren Sie ihn seitlich. Setzen Sie den Schnitt durch die Bauchdecke entlang der Linea alba entweder mit einer Mikropräparierschere oder einer federbelasteten Mikroschere fort und bringen Sie einen Retraktor in Position.</li>
	<li>Legen Sie sterile Mullkissen, die mit warmer steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um den Operationsbereich.</li>
	<li>Entfernen Sie den Dünndarm aus der Bauchhöhle, drehen Sie ihn kranial und nach links und legen Sie ihn auf die angefeuchteten Pads. Legen Sie ein weiteres angefeuchtetes Mullkissen über das Gewebe, um ein Austrocknen zu verhindern. Tropfe regelmäßig warme, sterile Kochsalzlösung auf die Gaze, um das Gewebe feucht zu halten.</li>
	<li>Isolieren Sie die SMA, die sich ventral zur unteren Hohlvene, kaudal zur Arteria coeliacus und kranial zur Nierenarterie befindet. HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Position der SMA, an der sie während der Operation isoliert wird. Die SMA liegt normalerweise ventral zur unteren Hohlvene und erstreckt sich nach rechts. Wenn der Darm während der Operation nach außen gekehrt und nach links gedreht wird, liegt die SMA links von der unteren Hohlvene.</li>
	<li>Legen Sie einen atraumatischen mikrovaskulären Clip über die Basis der SMA, wo sie von der Bauchaorta abzweigt, und stellen Sie sicher, dass der Clip die obere Mesenterialvene nicht verschließt.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Ischämie des Dünndarms, indem Sie den Farbwechsel von rosa zu blassweiß und den Verlust der mesenterialen Pulsation notieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Eingeweide für die Dauer der ischämischen Periode in ihre ursprüngliche Position in der Bauchhöhle zurück. Entfernen Sie den Retraktor und decken Sie den Schnitt mit feuchter Gaze ab. Fügen Sie der Gaze regelmäßig warme, sterile Kochsalzlösung hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern und die Körpertemperatur zu halten.</li>
	<li>Entfernen Sie nach einer 45-minütigen Ischämieperiode (deren Beginn durch die erste Anwendung des Clips gekennzeichnet ist) den Okklusionsclip. Überprüfen Sie die Wiederherstellung des Blutflusses, indem Sie eine mesenteriale Pulsation und eine gerötete Farbe beobachten.</li>
	<li>Tragen Sie kurz vor dem endgültigen Verschluss warme, sterile Kochsalzlösung intraperitoneal auf, um eine angemessene Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Schließen Sie die Bauchmuskeln mit einer 6-0 Polyglactin 910 Naht. Verabreichen Sie Bupivacain (bis zu 2 mg/kg) entlang der Muskelschnittlinie zur Schmerzlinderung. Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern oder Wundclips.</li>
</ol>4. Erholung und Reperfusion
<ol><li>Bringen Sie die Maus in eine warme Kammer oder einen Käfig auf einer zirkulierenden Wasserdecke, einem Handwärmer oder einer anderen geeigneten Wärmequelle zurück. Liefern Sie 21 % O2 bei einer Durchflussrate von 0,5 l/min pro Liter Kammervolumen. Lassen Sie die Maus hier 90 Minuten lang erholen. Überwachen Sie die Maus alle 5-10 Minuten auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden, wie z. B. gebeugte Haltung, Schielen und Bewegungsunlust.</li>
</ol>5. Euthanasie und Blutentnahme
<ol><li>Am Ende der 90-minütigen Erholungsphase kehren Sie die Maus in die Induktionskammer zurück und geben Sie 2 % bis 4 % Isofluran mit 21 % O2 in einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min Kammervolumen ab, um die Vollnarkose wieder einzuleiten.</li>
	<li>Bringen Sie das Tier zurück in den Operationsbereich und setzen Sie es mit einem Nasenkonus ein, der 2%-4% Isofluran mit 21% O2 liefert, um eine tiefe Anästhesie zu erreichen. HINWEIS: CO2 ist keine geeignete Euthanasiemethode für dieses Verfahren, da es physiologische Veränderungen hervorruft, die ischämische Verletzungen oder Gewebeanalyten beeinträchtigen können13.</li>
	<li>Öffnen Sie den ventralen Mittellinienschnitt wieder und führen Sie eine terminale Blutung durch, indem Sie mit einer 23-G-Nadel und einer Spritze so viel Blut wie möglich aus der Bauchvene sammeln. Erwarten Sie, zwischen 0,3 und 0,5 ml Blut zu sammeln (weniger bei Mäusen, die sich einer IRI unterzogen haben, mehr bei denen, die eine Schein-Laparotomie erhalten haben). HINWEIS: Der Zweck der terminalen Blutung besteht darin, eine humane Euthanasie zu unterstützen und Blut für zukünftige Tests (z. B. Serumchemie, PCR, ELISA) zu sammeln und zu konservieren.</li>
	<li>Nach der Blutentnahme wird die Bauchschlagader durchtrennt, um eine vollständige Entblutung zu ermöglichen.</li>
	<li>Führen Sie entweder eine Zervixluxation oder eine Thorakotomie als sekundäre Maßnahme durch, um eine erfolgreiche Euthanasie zu gewährleisten.</li>
</ol>6. Gewebeaufbereitung für die Histologie
<ol><li>Sammeln Sie nach der Euthanasie das gewünschte Gewebe. Stellen Sie sicher, dass die Gewebeverarbeitung umgehend erfolgt, da die Autolyse unmittelbar nach dem Tod beginnt14,15.<ol><li>Darm: Sammeln Sie die gesamte Länge des Dünndarms und des Dickdarms. Entsorgen Sie den Blinddarm.</li>
		<li>Leber: Sammeln Sie den linken lateralen, linken Medianlappen und rechten Medianlappen.</li>
		<li>Nieren: Sammeln Sie beide Nieren. Gemäß der Konvention wird die linke Niere in Längsrichtung und die rechte Niere zum Zeitpunkt der Autopsie als Querschnitt geschnitten. HINWEIS: Der Dickdarm, die Leber und die Nieren können zur Beurteilung von Multiorganversagen oder anderen systemischen Wirkungen von IRI verwendet werden. Der Dünndarm wird verwendet, um die primäre Verletzung zu beurteilen. Es ist nicht notwendig, einzelne Abschnitte des Leberlappens und der Nieren im Auge zu behalten, da jedes Organ als eine Einheit analysiert und bewertet wird. Die Darmabschnitte sollten jedoch getrennt gehalten und dann einzeln beschriftet und bewertet werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Teilen Sie den Darm in vier Abschnitte: Zwölffingerdarm, Jejunum, Ileum und Dickdarm. Achten Sie darauf, dass die drei Dünndarmsegmente gleich lang sind. Falten Sie dazu den Dünndarm in eine "Z"-Form, wobei die obere Linie der Zwölffingerdarm, die mittlere Linie das Jejunum und die untere Linie das Ileum ist. Es ist wichtig, das proximale und das distale Ende im Auge zu behalten.</li>
	<li>Spülen Sie das Lumen der Darmsegmente mit Kochsalzlösung mit einer 10-ml-Spritze, die mit einem 20-G-Angiokatheter befestigt ist.</li>
	<li>Legen Sie vor dem Erstellen von Schnitten jedes Darmsegment flach mit der luminalen Seite nach oben. Verwenden Sie eine 3-ml-Spritze, die mit einer 27-g-Nadel befestigt ist, und tragen Sie großzügig 10% gepuffertes Formalin tropfenweise auf, um die gesamte Länge der Schleimhaut zu beschichten. Rollen Sie dann jedes Darmsegment einzeln und legen Sie es in separate, beschriftete Gewebekassetten.<ol><li>Legen Sie zum Rollen jedes Segment flach mit der luminalen Seite nach oben und rollen Sie es dann umlaufend um einen Zahnstocher. Der proximale Teil sollte den inneren Teil der Rolle bilden. Das Lumen sollte nach innen/mittig zeigen. Versuchen Sie, so sanft wie möglich zu rollen, um ein Zusammendrücken der Zotten zu vermeiden.</li>
		<li>Beim Rollen sollte der Darm wie ein Schweizer Brötchen aussehen. Legen Sie die Schweizer Rollenspirale mit der Vorderseite nach oben in die Kassette.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie die Gewebe in beschriftete Fläschchen, die mit 10% gepuffertem Formalin gefüllt sind, um sie bei Raumtemperatur zu fixieren. Überfixierung ist besser als Unterfixierung. Die Fläschchen sollten groß sein und viel Formalin enthalten - mindestens 20x mehr Fixiermittel als Gewebe.<ol><li>Darm: Legen Sie die vier Kassetten zusammen in einen Probenbecher. Fixieren für 24-48 h.</li>
		<li>Leber: Legen Sie die Leberlappen zusammen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fixieren für 24-48 h.</li>
		<li>Nieren: Legen Sie die Nieren zusammen in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Fix für 48-72 h. HINWEIS: Die Reparatur von nicht getrimmten Nieren dauert länger als die von getrimmten Nieren. Um die Fixierungszeit auf 24-48 h zu verkürzen, können die Nieren entlang der Medianebene, längs (linke Niere) und quer (rechte Niere) geschnitten und in Kassetten gelegt werden, bevor sie im Formalin abgelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem die Gewebe für die angegebene Zeit in Formalin fixiert wurden, spülen Sie sie mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder destilliertem Wasser ab und füllen Sie sie in markierte Fläschchen, die mit 70 % EtOH gefüllt sind. Das Gewebe kann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur im EtOH gelagert werden, während es auf die Histologie wartet.<ol><li>Darm: Legen Sie die vier Kassetten zusammen in einen Probenbecher.</li>
		<li>Leber: Legen Sie die Leberlappen zusammen in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Nieren: Legen Sie die Nieren zusammen in ein konisches 50-ml-Röhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, lassen Sie die Gewebe mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) auf Objektträger verarbeiten. Schneiden Sie das formalinfixierte Gewebe ab und betten Sie es dann in Paraffin ein. Montieren Sie Fünf-Mikron-Abschnitte auf den Objektträgern und färben Sie sie mit H&E.</li>
</ol>7. Gewebe-Scoring
<ol><li>Die Gewebebewertung sollte vorzugsweise von erfahrenem Personal durchgeführt werden, das für die Probengruppen verblindet ist.</li>
	<li>Die intestinale Ischämie wird mit dem Chiu/Park-Bewertungssystem17 bewertet.</li>
	<li>Nierenschäden werden nach dem Jablonski-Bewertungssystembewertet 18,19.</li>
	<li>Leberschäden werden nach dem Suzuki-Punktesystem20,21 bewertet. HINWEIS: Derzeit werden viele Bewertungssysteme zur Beurteilung von Gewebeschäden in Nagetiermodellen der intestinalen IRI verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Bewertungssysteme wurden ausgewählt, um willkürliche Schätzungen zu minimieren und die absichtliche qualitative Bewertung zu maximieren (Tabelle 1).</li>
</ol>

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Die Autoren dieses Papiers haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Trotz der weit verbreiteten Verwendung dieses intestinalen IRI-Modells ist es nicht ohne Grenzen. Zum Beispiel behindert der alleinige Verschluss nur der Basis des SMA den Blutfluss zum Darm nicht vollständig. Dies ist wahrscheinlich auf eine ausgedehnte Kollateralzirkulation im Mesenterium zurückzuführen, die Blut aus benachbarten Ästen der Bauchaorta entnehmen kann. In einer Studie an Katzen verringerte der SMA-Verschluss den Blutfluss im proximalen Zwölffingerdarm um 35 %, im distalen Zwölffingerdarm um 61 %, im Jejunum und Ileum um 71 % und im proximalen Dickdarm um 63 %. Der Blutfluss im mittleren und distalen Dickdarm, die einen Großteil ihrer Durchblutung von der Arteria mesenterica inferior erhalten, war nicht reduziert23. Bei Nagetieren werden das Jejunum und das Ileum am häufigsten als die Darmsegmente genannt, die nach einem SMA-Verschluss die größte Gewebeverletzung erleiden9.
In der Literatur wurde eine breite Palette von Ischämiezeiten nach SMA-Okklusion angegeben, von 1 bis 90 Minuten oder mehr. Unterschiedliche ischämische Zeiten führen zu unterschiedlichen Ausmaßen von Reperfusionsverletzungen; Park et al. beobachteten eine Reperfusionsverletzung, wenn das ischämische Intervall zwischen 40 und 60 Minuten lag, aber nicht, wenn das ischämische Intervall kürzer oder länger war24. Solche Ergebnisse deuten darauf hin, dass kürzere Zeiten nicht genug Ischämie erzeugen, um eine Reperfusionsverletzung auszulösen, während längere Zeiten das Gewebe so stark schädigen, dass es unmöglich ist, die folgende Reperfusionsverletzung nachzuweisen. Darüber hinaus bergen längere ischämische Zeiten das Risiko einer erhöhten Mortalität. Wie in unserer Studie zu sehen war, starben 50% (3/6) der anfänglichen Mäuse, die sich einer 60-minütigen Ischämie unterzogen, nach nur 90 Minuten Reperfusion. Die Verkürzung der Ischämiezeit auf 45 Minuten senkte die Mortalität auf 20% (1/5), ohne die Gewebeverletzungswerte zu verändern. Basierend auf unserer Studie scheint es, dass das ideale Fenster der ischämischen Schädigung durch SMA-Okklusion für etwa 45 Minuten erreicht werden kann.
Eine weitere Variable ist die Reperfusionszeit vor der Gewebeentnahme. Wie bei den Ischämiezeiten variieren die Reperfusionszeiten zwischen den Studien stark, von 60 Minuten bis über 24 Stunden. Mehrere Arbeiten haben berichtet, dass die Darmschleimhaut nach 2 bis 3 Stunden Reperfusion maximale morphologische Schäden erleidet, wobei eine vollständige Reparatur nach 24 Stunden erreicht wird 25,26,27. Die Entnahme von Gewebe vor diesem 2- bis 3-Stunden-Fenster birgt die Gefahr, dass das volle Ausmaß der Reperfusionsverletzung nicht erfasst wird, während Gewebe, das näher an 24 Stunden entnommen wurde, bereits mit dem Reparaturprozess begonnen hat. Wir entschieden uns zunächst für eine Reperfusionszeit von 120 Minuten, wechselten dann aber zu 90 Minuten, um die Sterblichkeit zu senken. Diese Änderung änderte nichts an den Ergebnissen der Gewebeverletzung, was darauf hindeutet, dass eine Abweichung von 30 Minuten vom 2- bis 3-Stunden-Fenster akzeptabel ist.
Auch die Sauerstoffkonzentration ist eine wichtige Variable bei der Entwicklung von IRI. Wilding et al. fanden heraus, dass im Vergleich zu Mäusen, die 21 % O2 erhielten, diejenigen, die mit Isofluran mit 100 % O2 betäubt wurden, aufgrund von Atelektasen eine Diskrepanz zwischen Ventilation und Perfusion aufwiesen. In derselben Studie entwickelten Ratten, die 100 % O2 erhielten, eine akute respiratorische Azidose und einen erhöhten mittleren arteriellen Druck28. Solche physiologischen Veränderungen werden am besten vermieden, wenn eine Verletzung wie IRI induziert wird, an der eine Reihe systemischer Faktoren beteiligt sind. Daher scheinen 21 %O2 als Trägergas für die Isofluranabgabe geeigneter zu sein als 100 %O2 .
Die Verwendung von Heparin in diesem Protokoll ist umstritten. Es ist bekannt, dass Heparin eine gerinnungshemmende und entzündungshemmende Wirkung hat29. Wir fanden heraus, dass der Wechsel von 60 min Ischämie und 120 min Reperfusion zu 45 min Ischämie und 90 min Reperfusion mit 400 IE/kg Heparin die mikroskopische Darmverletzung nicht veränderte, aber die Mortalität senkte. Eine mögliche Erklärung ist, dass Heparin tödliche Thromboembolien an entfernten Organen wie Lunge und Gehirn verhinderte, aber wir fanden keine Beweise dafür bei der Autopsie durch grobe oder mikroskopische Untersuchung der ersten beiden Mäuse, die starben. Die Verwendung kürzerer Ischämie- und Reperfusionszeiten ohne Heparin kann die Mortalität ebenso wirksam senken. Wenn dies der Fall wäre, wäre es ratsam, auf die Verwendung von Heparin zu verzichten, um die Interferenz mit IRI zu minimieren. Die Aufnahme von Heparin in das Protokoll kann jedoch für diejenigen geeignet sein, die chirurgische Ursachen von IRI modellieren möchten, da chirurgische Patienten Heparin häufig perioperativ erhalten.
Es wurde gezeigt, dass Isofluran bei Darmentzündungen und Ischämie gewebeschützende Wirkungen hat, und seine Verwendung kann ein klinisch relevantes IRI-Modell beeinträchtigen 30,31,32. Organofluor-Inhalationsmittel (d. h. Isofluran, Sevofluran) sind jedoch häufig verwendete Anästhetika sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin. Darüber hinaus überschreitet die für dieses Protokoll erforderliche Anästhesiedauer 120 Minuten, und daher ist ein Inhalationsmittel besser geeignet als ein kürzer wirkendes injizierbares Mittel, das erneut dosiert werden müsste.
Es waren keine mikroskopischen Läsionen im proximalen Dickdarm, in der Leber oder in der Niere vorhanden. Das Fehlen mikroskopischer Veränderungen war möglicherweise auf die relativ kurze Reperfusionszeit von 90 bis 120 Minuten zurückzuführen. Darüber hinaus wird der proximale Dickdarm von der Arteria mesenterica inferior durchblutet. Ein Mangel an sichtbaren Schäden schließt jedoch eine systemische Verletzung nicht aus. Die Reverse-Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) ist wahrscheinlich eine bessere Methode, um systemische Verletzungen durch Messung von entzündlichen Zytokinen wie TNF-α nachzuweisen.
Im Laufe der Jahre wurden mehrere Variationen dieses intestinalen IRI-Modells entwickelt. 1990 zeigten Megison et al., dass der Verschluss von Kollateralgefäßen zusätzlich zur SMA zu einer gleichmäßigeren Verringerung des mesenterialen Blutflusses, aber zu einem Anstieg der Mortalitätsrate führte33. Eine neuere Studie zeigte, dass anstelle des Verschlusses der SMA an ihrer Basis die Ligatur ihrer peripheren und kollateralen Äste zur Induktion einer Ischämie im distalen Ileum zu einer reproduzierbaren Verletzung ohne Mortalität führte34. Der Verschluss der lokalen arteriellen Äste gewährleistet eine maximale Ischämie und kann das Problem der multifokalen, segmentalen Verringerung des Blutflusses lösen, die bei der Ligatur der SMA direkt an ihrer Basis beobachtet wird. Während diese alternative Methode zur Modellierung der intestinalen IRI für die Erforschung der lokalen Gewebeeffekte der intestinalen IRI verwendet werden kann, ist nicht bekannt, ob sie die systemische Entzündung und das Multiorganversagen, die mit Darmverletzungen verbunden sein können, genau modellieren kann.
Der SMA-Verschluss ist nicht für alle Arten von intestinaler IRI geeignet. Die nicht-okklusive mesenteriale Ischämie ist beispielsweise durch eine splanchnische Hypoperfusion gekennzeichnet, die auf ein vermindertes Herzzeitvolumen zurückzuführen ist. Daher wäre diese Technik nicht optimal, um intestinale IRI zu untersuchen, die durch Myokardinfarkt, kongestive Herzinsuffizienz, Aorteninsuffizienz oder Nieren- oder Lebererkrankungen verursachtwird 35. Kozar et al. berichteten, dass der SMA-Verschluss jedoch ein klinisch relevantes Modell für die durch Schock induzierte Darm-IRI ist36. Obwohl weniger wirtschaftlich, kann die Verwendung anderer Arten wie Schweine Vorteile gegenüber Nagetieren haben, um bestimmte Darmverletzungszustände zu modellieren. Eine umfassende Übersichtsarbeit von Gonzalez et al. aus dem Jahr 2014 beschreibt Tiermodelle, die derzeit zur Untersuchung der intestinalen IRIverwendet werden 9.
Trotz ihrer Einschränkungen bleibt die Technik des Verschlusses der SMA an ihrer Basis eines der am häufigsten verwendeten Nagetiermodelle der Darmischämie9. Da nur eine Gefäßklemme und eine Grundausstattung erforderlich sind, ist die Operation selbst recht einfach. Es führt auch zu reproduzierbaren Schäden, wie die hier vorgelegten Daten belegen. Der SMA-Verschluss bei Nagetieren kann okklusive Ursachen der intestinalen IRI zuverlässig modellieren und sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin praktische Anwendung finden. Daher ist es wichtig, dass die hier beschriebenen Verfahren konsequent durchgeführt werden.

Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) können in jedem Organ auftreten und umfassen zwei aufeinanderfolgende Komponenten. Eine anfängliche Unterbrechung des Blutflusses führt dazu, dass das betroffene Gewebe ischämisch wird, und die anschließende Reperfusion führt zu weiteren Zellverletzungen. Schäden durch die Reperfusion übersteigen oft die durch Ischämieverursachten 1. Die Pathophysiologie der IRI beinhaltet eine komplexe Kaskade von Ereignissen, von denen das bemerkenswerteste die Bildung freier Radikale bei der Wiedereinführung von Sauerstoff ist, die während der Reperfusion auftritt2. Auch die Aktivierung der Entzündungszellen und Zytokine spielt eine Rolle2. Bei intestinaler IRI kann die bakterielle Translokation in den Blutkreislauf nach einer Endothelschädigung zu einem systemischen Entzündungsreaktionssyndromführen 2. Wenn der Schaden durch IRI schwerwiegend genug ist, können die daraus resultierenden systemischen Wirkungen zu Multiorganversagen führen3.
Fälle von intestinaler IRI sind mit einer hohen Morbidität und Mortalität verbunden 4,5,6. Die intestinale IRI wird sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin mit vielen pathologischen Erkrankungen und chirurgischen Eingriffen in Verbindung gebracht. In der Veterinärmedizin sind Tiere besonders anfällig für intestinale IRI-Erkrankungen wie Magendilatationsvolvulus (GDV), Mesenterialtorsion und Koliken 7,8. Beim Menschen ist IRI ein großes und häufig auftretendes Problem bei Bauchaortenaneurysmaoperationen, strangulierten Hernien, akuter mesenterialer Ischämie, Volvulus, Trauma, Schock, nekrotisierender Enterokolitis bei Neugeborenen und Dünndarmresektion oder -transplantation9.
Die meisten In-vivo-Nagetierstudien zur intestinalen IRI beinhalten einen Verschluss der Basis der Arteria mesenterica superior (SMA), des Astes der Bauchaorta, der den Großteil des Dünndarms und den proximalen Teil des Dickdarms mit Blut versorgt 10,11,12. Trotz der weit verbreiteten Verwendung und relativen Einfachheit dieses Modells wurde kein detailliertes Protokoll mit Inhalationsanästhesie in 21% O2 medizinischer Luft veröffentlicht. Das Fehlen eines Standardprotokolls stellt Forscher, die mit dem Verfahren nicht vertraut sind, vor Schwierigkeiten und verhindert die Konsistenz zwischen den Studien. Wir demonstrieren die Schritte, die notwendig sind, um das chirurgische Modell der intestinalen IRI in 8-14 Wochen alten männlichen und weiblichen Schweizer Webster-Mäusen durchzuführen. Dieses Modell der intestinalen IRI führt zu reproduzierbaren Verletzungen, wie eine konsistente Histopathologie zeigt.

<table><tbody><tr><td>Adson-Pinzette</td><td>Roboz</td><td>RS-5236</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Alm Retraktor</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>Aestiva 5</td><td></td></tr><tr><td>Anästhesie: Isofluran</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>Dosis: 1-4%, INH</td></tr><tr><td>Angiocath 20 g & nbsp; x 2</td><td>Smiths Medical</td><td>5057</td><td>Spülung des Darms mit Kochsalzlösung und Formalin</td></tr><tr><td>Atraumatischer mikrovaskulärer Clip</td><td>Teleflex</td><td>065100</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Gepuffertes Formalin 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245684</td><td>Gewebefixierung</td></tr><tr><td>Bupivicain 0,25%</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-1160-18</td><td>Dosis: bis zu 2 mg/kg tropfenweise</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Par Pharmaceutical</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>Dosis: 1 mg/kg, SQ</td></tr><tr><td>Chlorhexidin-Peeling 2%</td><td>Vet One</td><td>510083</td><td>Vorbereitung der Operationsstelle</td></tr><tr><td>Zirkulierende Wasserdecke</td><td>Cincinnati Sub Zero</td><td>Blanketrol 2</td><td>Körpertemperaturerhaltung</td></tr><tr><td>Haarschneidemaschinen - Wahl BravMini, Lila Haarschneider</td><td>Lambert Vet Supply</td><td>008WA-41590-0438</td><td>Vorbereitung der Operationsstelle</td></tr><tr><td>Konische Röhrchen 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Gewebefixierung und -lagerung</td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PCR-Gewebeproben</td></tr><tr><td>EtOH 200 proof</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>64-17-5</td><td>Gewebelagerung</td></tr><tr><td>Heparin (optional)</td><td>Meitheal Pharmaceuticals</td><td>NDC 71288-402-11</td><td>Dosis: 200-600 IE/kg</td></tr><tr><td>Induktionskammer</td><td>VetEquip</td><td>941456</td><td></td></tr><tr><td>Indus Instruments THM100 Nagetiermonitor</td><td>Indus Instruments</td><td>N/A</td><td>Zur Überwachung der Körpertemperatur von Nagetieren während der</td></tr><tr><td>Operation Isopropylalkohol 70%</td><td>Humco</td><td>NDC 0395-4202-28</td><td>Zum Schrubben von Operationsstellen</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen: 0,6 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>PCR-Gewebeproben. 8 pro Maus, Terminal Bleed Collection, Serumlagerung</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nasenkonus</td><td>N/A</td><td>N/A Kann</td><td>mit Spritzenschlauch oder Sprudelschlauch hausgemacht werden</td></tr><tr><td>O2 medizinische Luft 21%</td><td>Roberts Oxygen</td><td>N/A</td><td>Rate: 0,5 L/min für jedes L Kammervolumen</td></tr><tr><td>Ophthalmic Salbe</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>Chirurgische Vorbereitung</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-031</td><td>Zum Spülen des Gewebes und zur Herstellung von 70% EtOH-Probenbechern</td></tr><tr><td></td><td>Cardinal Healthcare</td><td>C13005</td><td>Zum Halten von Gewebekassetten in Formalin</td></tr><tr><td>Steriler Castroviejo-Nadelhalter</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Sterile Wattestäbchen</td><td>Medline</td><td></td><td></td>BXTA50002Z</tr><tr><td>Sterile Gaze</td><td>Medline</td><td>PRM21423Z</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Mikro-Präparierschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Sterile Mikro-Präparierfederschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5693</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Sterile Mikrozange</td><td>Roboz</td><td>RS-5264</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung (0,9%)</td><td>Braun</td><td>R5201-01</td><td>Muss erwärmt werden</td></tr><tr><td>Sterile Skalpellklinge #15</td><td>Cardinal Health (Allegiance)</td><td>32295-015</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Steriler Skalpellgriff</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Steriles OP-Tuch</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Sterile OP-Handschuhe</td><td>Medline</td><td>MSG2270</td><td></td></tr><tr><td>Steril chirurgisches Klammergerät</td><td>Roboz</td><td>RS-9260</td><td>Chirurgisches Instrument</td></tr><tr><td>Sterile chirurgische Klammern</td><td>Roboz</td><td>RS-9262</td><td>Verschluss der Bauchhaut</td></tr><tr><td>Steriles Nahtmaterial: Vicryl (Polyglactin 910) 6-0, 27" Taper RB-1 Nadel</td><td>Ethicon</td><td>J212G</td><td>Verschluss des Bauchmuskels</td></tr><tr><td>Chirurgisches Klebeband</td><td>Medline</td><td>MMM15271Z</td><td>Sicherung der Maus in der Rückenlage</td></tr><tr><td>Spritze 10 ml x 2</td><td>Medline</td><td>SYR110010</td><td>Darmspülung mit Kochsalzlösung und Formalin</td></tr><tr><td>Gewebekassetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-665</td><td>Gerollte Darmsegmente. 4 pro Maus.</td></tr><tr><td>Handtuch oder Drapierung</td><td>Medline</td><td>GEM2140</td><td>Wasserdeckenbezug</td></tr></tbody></table>

nagetiermodell der intestinalen ischämie-reperfusionsverletzung durch verschluss der arteria mesenterica superior

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinale Ischämie-Reperfusionsschäden (IRI) werden sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht. Darm-IRI-Erkrankungen wie Magendilatationsvolvulus (GDV), Mesenterialtorsion und Koliken werden bei Tieren wie Hunden und Pferden beobachtet. Eine anfängliche Unterbrechung des Blutflusses führt dazu, dass das Gewebe ischämisch wird. Obwohl es notwendig ist, lebensfähiges Gewebe zu retten, kann die anschließende Reperfusion weitere Verletzungen verursachen. Der Hauptmechanismus, der für IRI verantwortlich ist, ist die Bildung freier Radikale bei der Reperfusion und die Wiedereinführung von Sauerstoff in geschädigtes Gewebe, aber es sind viele andere Komponenten beteiligt. Die daraus resultierenden lokalen und systemischen Effekte führen oft zu einer schlechten Prognose. 
Die intestinale IRI war in den letzten 50 Jahren Gegenstand umfangreicher Forschung. Ein In-vivo-Nagetiermodell , bei dem die Basis der Arteria mesenterica superior (SMA) vorübergehend ligiert wird, ist derzeit die häufigste Methode zur Untersuchung der intestinalen IRI. Hier beschreiben wir ein Modell der intestinalen IRI unter Verwendung von Isofluran-Anästhesie in 21% O2 medizinischer Luft, die zu reproduzierbaren Verletzungen führt, wie eine konsistente Histopathologie des Dünndarms zeigt. Gewebeverletzungen wurden auch im Dickdarm, in der Leber und in den Nieren beurteilt.

Wir demonstrierten ein Modell der intestinalen IRI bei Mäusen, das konsistente und reproduzierbare Ergebnisse lieferte. Der Dünndarm, das proximale Dickdarm, die Nieren und die Leber wurden geschnitten und mit H&amp;E gefärbt. Ein Veterinärpathologe bewertete Gewebeverletzungen anhand der zuvor erwähnten Bewertungssysteme (Tabelle 1). Die statistische Analyse wurde unter Verwendung einer Einzelfaktor-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Vergleichen mit paarweisen Vergleichen, die bestimmten, ob es einen signifikanten Unterschied in den Daten innerhalb und zwischen den Gruppen gab oder nicht. Ein p-Wert kleiner oder gleich 0,05 wurde als Grenzwert für die Feststellung der statistischen Signifikanz angesehen. Alle statistischen Tests und Grafiken wurden in einer Tabellenkalkulationssoftware (z. B. Microsoft Excel) mit dem Add-on Real Statistics Resource Pack durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt.
Die mikroskopischen Läsionswerte der drei Dünndarmsegmente (Duodenum, Jejunum und Ileum) waren bei Tieren, die eine intestinale Ischämie-Reperfusionsverletzung erlitten (IRI; N = 7) im Vergleich zu denen, die sich einer Scheinlaparotomie unterzogen haben (Schein; n = 6) (Abbildung 2 und Abbildung 3). Der Standardfehler für diese Daten war gering und zeigte die Konsistenz der Ergebnisse innerhalb und zwischen den Gruppen. Jedes Darmsegment in der Sham-Gruppe ergab genau den gleichen durchschnittlichen Park/Chiu-Score von 0,83. Das SEM für den Zwölffingerdarm, das Jejunum und das Ileum in der Sham-Gruppe betrug 0,31, 0,40 bzw. 0,31. Die durchschnittlichen Park/Chiu-Werte für Duodenum, Jejunum und Ileum in der IRI-Gruppe betrugen 4,07 ± 0,44, 4,14 ± 0,46 bzw. 5,14 ± 0,40.
In dieser Studie starben 50% (3/6) der ersten Mäuse, die sich einer 60-minütigen Ischämie und einer 120-minütigen Reperfusion (60/120-Gruppe) unterzogen. Zwei der drei Mäuse wurden zur Autopsie eingereicht. Beide Mäuse hatten Epithelnekrose, Stauung und Blutung des Dünndarms. Darüber hinaus hatten die Mäuse eine Lymphozytolyse, eine unspezifische Veränderung, die mit physiologischem Stress einhergeht. Keine der Mäuse hatte Läsionen im Herzen, in der Lunge, in der Leber oder in den Nieren. Die Verkürzung der Zeiten auf 45 min Ischämie und 90 min Reperfusion und die Zugabe von 400 IE/kg Heparin (45/90/H-Gruppe) senkten die Mortalität auf 20% (1/5), ohne die Darmverletzungswerte zu verändern (Abbildung 4). Der mittlere Park/Chiu-Wert für die 60/120-Gruppe betrug 4,56 ± 0,38 (N = 3) und der mittlere Wert für die 45/90/H-Gruppe 4,375 ± 0,38 (N = 4).
Mikroskopische Befunde, die auf eine Verletzung des proximalen Dickdarms, der Leber und der Niere hindeuten, wurden weder bei den 60/120-Mäusen noch bei den 45/90/H-Mäusen beobachtet.
Tabelle 1: Bewertungssysteme für Darm, Nieren und Leber. Die Darmschädigung wurde nach dem Chiu/Park-System17 eingestuft. Nierenschäden wurden nach dem Jablonski-Bewertungssystem18,19 bewertet. Leberschäden wurden nach dem Suzuki-Bewertungssystem20,21 bewertet. Diese Tabelle wurde mit Genehmigungen von Bewertungssystemen angepasst, die in Quaedackers et al.17, Du et al.19 und Behrends et al.21 vorgestellt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/Table%201%20-%20Scoring%20Systems.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig01.jpg"> Abbildung 1: Lage und Isolierung der Arteria mesenterica superior (SMA). (A) Normalerweise liegt die SMA ventral zur unteren Hohlvene und erstreckt sich nach rechts des Tieres. Es befindet sich zwischen der Zöliakiearterie und der Nierenarterie. Diese Figur wurde mit Genehmigung von The Anatomy of the Laboratory Mouse von Margaret Cook (1965)22 adaptiert. (B) Bei diesem Verfahren wird der Darm nach außen gedreht und nach links gedreht (in diesem Bild mit angefeuchteter Gaze bedeckt), so dass die SMA (gelber Pfeil) links von der unteren Hohlvene (blauer Pfeil) liegt. Abkürzungen: RK = rechte Niere; D = Zwölffingerdarm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig02.jpg"> Abbildung 2: Mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Dünndarmsegmente. Abschnitte von Jejunum (A) und Ileum (B) von Mäusen in der Sham-Gruppe wiesen Zotten auf, die lang und dünn ohne Verzerrung waren. Abschnitte von Jejunum (C) und Ileum (D) von Mäusen in der IRI-Gruppe wiesen Bereiche mit Nekrose (Sternchen) und Blutungen mit Abstumpfung und Verzerrung der verbleibenden Zotten (Pfeile) auf. Die Fotos stammen von Mäusen, die sich einer 45-minütigen Ischämie und einer 90-minütigen Reperfusion unterzogen und 400 IE/kg Heparin erhielten. Die Fotos wurden mit 20-facher Vergrößerung und 10% Zoom aufgenommen. Maßstabsbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig03.jpg"> Abbildung 3: Park/Chiu-Werte für Dünndarmsegmente. Die mikroskopische Schädigung aller drei Darmsegmente (Zwölffingerdarm, Jejunum und Ileum) bei Tieren, die eine intestinale Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) erlitten, war im Vergleich zu Tieren, die sich einer Scheinlaparotomie (Schein) unterzogen, signifikant erhöht. * p &lt; 0,05 für IRI versus Sham. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig04.jpg"> Abbildung 4: Park/Chiu-Scores für Dünndarm mit 60 min Ischämie und 120 Reperfusion gegenüber 45 min Ischämie und 90 min Reperfusion mit 400 IE/kg Heparin. Die Verkürzung der Zeiten von 60 min Ischämie und 120 min Reperfusion (60/120) auf 45 min Ischämie und 90 min Reperfusion mit 400 IE/kg Heparin (45/90/H) führte nicht zu einem statistisch signifikanten Unterschied in den Park/Chiu-Verletzungswerten des Dünndarms von Mäusen in der IRI-Gruppe. Es reduzierte jedoch die Sterblichkeit von 50 % auf 20 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Wir beschreiben, wie ein weit verbreitetes chirurgisches Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) bei Nagetieren erstellt werden kann. Das Verfahren beinhaltet einen Verschluss der Arteria mesenterica superior, gefolgt von der Wiederherstellung des Blutflusses. Dieses Modell ist nützlich für Studien, die okklusive Ursachen der intestinalen IRI sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanmedizin untersuchen.

Nagetiermodell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung durch Verschluss der Arteria mesenterica superior

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

Beginnen Sie mit dem Tragen einer Maske, einer Haarbedeckung und einem sauberen Laborkittel oder Peeling. Als nächstes legen Sie die anästhesierte Maus auf eine saubere, vom Operationsbereich getrennte Oberfläche und setzen Sie sie mit einem Nasenkonus ein, der 1,5 % Isofluran mit 21 % Sauerstoff liefert. Injizieren Sie dann Buprenorphin subkutan in den dorsalen Hals-Thoraxbereich.Injizieren Sie Heparin auch intraperitoneal, um die Thrombusbildung während der Okklusionsphase zu verhindern. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden, und entfernen Sie Haare aus dem Bauchbauch mit einer Haarschneidemaschine. Bewegen Sie die Maus zur beheizten Wasserdecke im Operationsbereich.Setzen Sie es wieder mit einem Nasenkonus ein, der Isofluran liefert. Als nächstes positionieren Sie die Maus in dorsaler Liege und befestigen Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband am Tisch. Überwachen Sie die Körpertemperatur des Tieres mit einem nagetierspezifischen Rektalthermometer.Führen Sie nach gründlicher Desinfektion des Bauches einen Zehenquetschtest durch, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig betäubt ist. Tragen Sie zum Schluss sterile Handschuhe und drapieren Sie die Operationsstelle aseptisch. Machen Sie zunächst mit einer Skalpellklinge der Nummer 15 einen drei bis fünf Zentimeter langen Bauchschnitt in der ventralen Mittellinie in der Haut.Trennen Sie 0,5 Zentimeter des Hautrandes von der darunter liegenden Muskelfaszie, um eine spätere Platzierung der Klammer zu ermöglichen. Setzen Sie dann den Schnitt durch die Bauchdecke entlang der linearen Alba mit einer federbelasteten Mikroschere fort und platzieren Sie einen Retraktor. Legen Sie sterile Mullkissen, die mit warmer steriler Kochsalzlösung angefeuchtet sind, um den Operationsbereich.Entfernen Sie den Dünndarm aus der Bauchhöhle. Drehen Sie es kranial und nach links vom Tier und legen Sie es auf die angefeuchteten Pads. Legen Sie ein weiteres angefeuchtetes Mullkissen über das Gewebe, um ein Austrocknen zu verhindern.Lokalisieren Sie die Arteria mesenterica superior (SMA) ventral zur Vena cava inferior, kaudal zur Arteria coeliacus und kranial zur Arteria nieren. Präparieren Sie es vom umgebenden Bindegewebe weg. Platzieren Sie einen atraumatischen mikrovaskulären Clip entlang der Basis des SMA, wo er von der Bauchaorta abzweigt.Überprüfen Sie die Ischämie des Dünndarms, indem Sie den Farbwechsel von rosa zu blassweiß notieren. Bringen Sie die Eingeweide für die Dauer der ischämischen Periode in ihre ursprüngliche Position in der Bauchhöhle zurück. Entfernen Sie den Retraktor und decken Sie den Schnitt mit feuchter Gaze ab.Entfernen Sie nach einer 45-minütigen Ischämieperiode den Okklusionsclip. Überprüfen Sie die Wiederherstellung des Blutflusses, indem Sie eine mesenteriale Pulsation und eine gerötete Farbe beobachten. Tragen Sie warme, sterile Kochsalzlösung intraperitoneal auf, um eine angemessene Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten.Schließen Sie dann die Bauchmuskeln mit einer 6-0 Polyglactin 910 Naht. Verabreichen Sie Bupivacain topisch entlang der Muskelschnittlinie zur Schmerzlinderung. Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern oder Wundclips.Bringen Sie die Maus in eine warme Kammer auf einer zirkulierenden Wasserdecke zurück. Lassen Sie die Maus 90 Minuten lang erholen und überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden. Sammeln Sie nach der humanen Euthanasie das gewünschte Gewebe wie die Leberlappen, einschließlich des linken lateralen, linken Median- und rechten Medianlappens.Dann sammeln Sie beide Nieren. Schneiden Sie die linke Niere in Längsrichtung und die rechte Niere als Querschnitt. Sammeln Sie schließlich die gesamte Länge des Dünn- und Dickdarms.Um die Dünndarmsegmente in gleich lange Abschnitte zu unterteilen, falten Sie den Dünndarm in eine Z-Form, wobei die obere Linie der Zwölffingerdarm, die mittlere Linie das Jejunum und die untere Linie das Ileum ist. Der verbleibende Teil des Darms ist der Dickdarm. Spülen Sie das Lumen der Darmsegmente mit Kochsalzlösung mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit einem 20-Gauge-Angiokatheter befestigt ist.Schneiden Sie dann die Länge des Darms mit einer Mikro-Präparierschere ab und legen Sie jedes Darmsegment flach mit der luminalen Seite nach oben. Tragen Sie mit einer Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel befestigt ist, großzügig 10% gepuffertes Formalin tropfenweise auf, um die gesamte Länge der Schleimhaut zu beschichten. Rollen Sie dann jedes Segment umlaufend um einen Zahnstocher und achten Sie darauf, dass der proximale Teil den inneren Teil der Rolle bildet und das Lumen nach innen zeigt.Nach dem Rollen sollte der Darm wie ein Schweizer Brötchen aussehen. Legen Sie die Spirale der einzelnen Schweizer Rolle mit der Vorderseite nach oben in die separat beschrifteten Tissue-Kassetten. Legen Sie die Taschentücher schließlich in beschriftete Fläschchen, die mit 10% gepuffertem Formalin gefüllt sind, um sie bei Raumtemperatur zu fixieren.Nach intestinaler IRI zeigte die H&E-Färbung des Jejunums und Ileums von Mäusen in der Scheingruppe lange und dünne Zotten ohne Verzerrung. Während Schnitte der Mäuse in der IRI-Gruppe Bereiche mit Nekrose und Blutung mit Abstumpfung und Verzerrung der verbleibenden Zotten zeigten. Darüber hinaus war die mikroskopische Schädigung aller drei Dünndarmsegmente bei Tieren, die sich einer IRI unterzogen, im Vergleich zu denen, die sich einer Scheinlaparotomie unterzogen, signifikant erhöht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Hier beschreiben wir die Einzelheiten des Verfahrens der intestinalen Ischämie-Reperfusion bei Mäusen, die ohne Mortalität in reproduzierbarer Verletzungen führt die Standardisierung dieser Technik auf dem Gebiet zu fördern. Dieses Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusions-Verletzung kann die zellulären und molekularen Mechanismen der Schädigung und Regeneration zu studieren verwendet werden.

Murine Modell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschaden

Wir beschreiben ein Mausmodell für einen Schlaganfall, der durch den Verschluss der mittleren Hirnarterie mit einer silikonbeschichteten Naht induziert wird. Das Protokoll kann angewendet werden, um einen dauerhaften Verschluss oder eine vorübergehende Ischämie mit anschließender Reperfusion zu induzieren.

Die Induktion von ischämischem Schlaganfall und Ischämie-Reperfusion bei Mäusen die Mittel Artery Occlusion Technik und Visualisierung von Infarktbereich verwenden

Darm Hindernisse sind eine teilweise oder vollständige Blockierung des Darms, die starke Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen, und verhindert den Durchgang von Stuhl verursachen können. Dieses Verfahren zum Erstellen von Darm teilweise Obsructions bei Mäusen ist zuverlässig bei der Untersuchung der Mechanismen, die krankhaften Zellwachstum und Tod im Darm.

Ein Maus-Modell der teilweisen Darmverschluss

Dieses Protokoll ermöglicht Lesern erfolgreich etablieren ein porcinen Modell der segmentale intestinale Ischämie und anschließend isolieren und Kultur intestinale Stammzellen für das Studium der epithelialen Reparatur nach Verletzung.

Intestinale Stammzellen isoliert und Kultur in einem porcinen Modell der segmentalen kleinen intestinalen Ischämie

Ein Maus-Modell der zerebralen Ischämie-Reperfusion wird gegründet, um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu untersuchen. Wir nach distal verbinden rechts mittlere zerebrale Arterie und rechts gemeinsame Halsschlagader und Blutfluss nach 10 oder 40 min der Ischämie wiederherstellen.

Zwei-Schiff Okklusion Mausmodell der zerebralen Ischämie-reperfusion

Hier beschreiben wir ein Mausmodell der retinalen Ischämie durch vorübergehende bilaterale gemeinsame Karotisarterienverschluss mit einfachen Nähten und einer Klemme. Dieses Modell kann nützlich sein, um die pathologischen Mechanismen der retinalen Ischämie zu verstehen, die durch kardiovaskuläre Anomalien verursacht wird.

Ein murines Modell der ischämischen Netzhautverletzung induziert durch transiente bilaterale gemeinsame Carotis ArterieNverschluss

Das Myokardischämie-Reperfusionsmodell des Rattenherzens wird durch die Verwendung eines selbst hergestellten Retraktors, einer Polyvinylchloridröhre und einer einzigartigen Knotenmethode verbessert. Die Ergebnisse der Elektrokardiogramm-, Triphenyltetrazoliumchlorid- und histologischen Färbung sowie die Ergebnisse der prozentualen Überlebensanalyse zeigten, dass die verbesserte Modellgruppe höhere Erfolgs- und Überlebensraten aufweist als die bereits bestehende Modellgruppe.

Verbessertes Nagetiermodell der Myokardischämie und Reperfusionsverletzung

Das aktuelle Protokoll beschreibt ein Rattenmodell des Verschlusses/der Reperfusion der mittleren Hirnarterien, das die anatomische Struktur der Hirngefäße bewahrt, ohne Schäden zu verursachen.

Ein Rattenmodell für den Verschluss/die Reperfusion der mittleren Hirnarterie ohne Beschädigung der anatomischen Struktur der Hirngefäße

Diese Studie beschreibt ein Modell der akuten Lungenschädigung nach viszeraler Ischämie-Reperfusion während suprazöliakie-Aorten-Cross-Clamping mittels Laparotomie bei Ratten. Es ermöglicht die Untersuchung sowohl der klinischen und biologischen Auswirkungen des Aortenklemmens als auch des Einflusses der Ischämie-Reperfusion auf darunter liegende Organe und entfernte Lungenverletzungen.

Ein Modell der akuten Lungenschädigung nach viszeraler Ischämie-Reperfusion durch suprazöliakie-Aortenkreuzklemmung bei Ratten

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Induktion einer mesenterialen Ischämie-Reperfusionsverletzung und zur Visualisierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in mesenterialen Venolen mittels intravitaler Mikroskopie vor. Der Blutfluss in der Arteria mesenterica superior war für 1 h eingeschränkt, gefolgt von einer Reperfusion, was eine direkte Quantifizierung der Leukozytenadhäsion und NETose ermöglichte.

Visualisierung von neutrophilen extrazellulären Traps in mesenterialen Venolen nach mesenterialer Ischämie-Reperfusionsverletzung mittels intravitaler Mikroskopie

Lernen Sie ein chirurgisches Nagetiermodell zur Induktion intestinaler Ischämie-Reperfusionsverletzungen durch Okklusion der Arteria mesenterica superior. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen und therapeutischer Ansätze.

Nagetiermodell der intestinalen Ischämie-Reperfusionsverletzung durch Verschluss der Arteria mesenterica superior

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