Name: Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Blutproben. Diese Methode minimiert Kontaminationen und ermöglicht hochreine Extraktionen für Krebsgenomik-Forschung.

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Dieses Manuskript wurde teilweise vom Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) und dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020) unterstützt.

Alle Vollblutproben wurden von Lungenkrebspatienten gewonnen. Die Forschung und Analyse bei Clinomics wird vom Cancer Genomics Research Institute durchgeführt, und die IRB-Forschungsgenehmigung durch die Regierung wird vom Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB Nr. 2021-0802) geleitet, wobei die IRB-Nummer für die Forschung bei Clinomics registriert ist.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie 9 ml Vollblut in einem EDTA- oder cfDNA-stabilen Blutentnahmeröhrchen.</li>
	<li>Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen ca. 10 Mal auf und ab drehen.</li>
	<li>Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur (RT; für Kurzzeitlagerung) oder 4 °C (für Langzeitlagerung). Nicht einfrieren und auftauen.</li>
</ol>2. Gerätevorbereitung
<ol><li>Drücken Sie den Netzschalter, um das Gerät einzuschalten. HINWEIS: Auf dem Touchpad wird ein Ladebildschirm angezeigt, und das Gerät wird initialisiert. Halten Sie während der Initialisierung die Hände vom Gerät fern. Nach Abschluss der Geräteinitialisierung wird der Bildschirm zur Auswahl der Kartusche angezeigt.</li>
	<li>Wählen Sie den zu verwendenden Beispielmodus aus. Ändern Sie die Anzahl der Stichproben, indem Sie auf den Pfeil drücken.</li>
</ol>3. Gerätebetrieb und Probenentnahme
<ol><li>Einlegen der LBx-1-Kassette<ol><li>Wählen Sie den Kassettentyp auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.</li>
		<li>Öffnen Sie die Klappe des Instruments und setzen Sie alle zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass Sie die Patrone und den Patronenhalter richtig einsetzen. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.</li>
		<li>Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.</li>
		<li>Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.</li>
		<li>Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an den Kartuschen, was ca. 30 s dauert.</li>
		<li>Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie maximal 10 ml Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette. VORSICHT: Gefahren beim Umgang mit Blut. Während des gesamten Verfahrens des Umgangs mit Blutproben und Reagenzien ist es wichtig, einen Laborkittel und Laborhandschuhe zu tragen. Das bereitgestellte Sicherheitsdatenblatt sollte von den Labormitarbeitern gründlich untersucht werden.</li>
		<li>Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe. HINWEIS Bei der Verwendung von mindestens 9 ml Vollblutprobe ist keine Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erforderlich. Wenn Sie weniger als 9 ml Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 9 ml zu erhöhen. Wenn Sie beispielsweise 7,2 ml Vollblut verwenden, geben Sie bitte 1,8 mL PBS in den Probeneinlass. Für die Injektion von Vollblut und PBS kann eine serologische Pipette oder eine Pipettenspitze verwendet werden. Bei Verwendung von weniger als 8 ml Vollblutprobe kann der Buffycoat auch durch Zugabe von 1 ml PBS nicht wiederhergestellt werden. Für die gDNA-Vorbereitung verwenden Sie 200 μL Vollblut, das vor diesem Schritt abgetrennt wurde.</li>
		<li>Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK . HINWEIS: Plasma und Buffy Coat werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert. ACHTUNG Gefahr während des Betriebs. Das Öffnen der Tür oder das Berühren des Instruments bei Hochgeschwindigkeitsdrehvorgängen kann zu schweren Verletzungen führen. Zudem besteht Verletzungsgefahr durch asymmetrische Belastung des Rotors. Wenn ungewöhnliche Vibrationen und Geräusche auftreten, wenn das Gerät im assistierten Zellanreicherungs- oder Expertenmodus startet, kann die Platzierung der Kartuschen asymmetrisch sein. Drücken Sie sofort die Ein-/Aus-Taste, um die Patrone zu stoppen und ordnungsgemäß einzusetzen.</li>
		<li>Suchen Sie nach der Meldung auf dem Bildschirm, begleitet von einem Alarmton, der erscheint, wenn die Trennung von Plasma und Buffy Coat abgeschlossen ist.</li>
		<li>Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.</li>
		<li>Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie den Buffy Coat von 3 ml aus dem Buffy Coat-Auslass mit einer 1 ml Pipettenspitze.</li>
	</ol></li>
	<li>Einlegen der LBx-2-Kassette<ol><li>Wählen Sie den Namen der Patrone auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.</li>
		<li>Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein.</li>
		<li>Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.</li>
		<li>Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Patrone korrekt in den Patronenhalter eingesetzt wird. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.</li>
		<li>Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.</li>
		<li>Befolgen Sie die Anweisungen, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen, die mit dem Ventil geschlossene Kartusche aus dem Patronenhalter zu entfernen und auf den Tisch zu legen.</li>
		<li>Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Dichtegradientenlösung und der Vollblutprobe vor. Das Volumen der zu injizierenden Dichtegradientenlösung und des zu injizierenden PBS ist in Abhängigkeit vom Volumen der Vollblutprobe zu überprüfen (Zusatztabelle 1).</li>
		<li>Die Dichtegradientenlösung wird mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Dichtegradientenlösung.</li>
		<li>Nach der Injektion der Dichtegradientenlösung wird die Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe. HINWEIS: Wenn Sie weniger als 9 ml der Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS gemäß dieser Tabelle hinzu (Zusatztabelle 1).</li>
		<li>Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der richtigen Reihenfolge ein, wie sie auf dem Patronenhalter angegeben sind. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .</li>
		<li>Plasma und PBMC werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert. Suchen Sie nach der Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Trennung von Plasma und PBMC abgeschlossen ist.</li>
		<li>Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.</li>
		<li>Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie 3 ml PBMC aus dem PBMC-Auslass mit einer 1-ml-Pipettenspitze.</li>
	</ol></li>
	<li>Einlegen der FAST-Auto-Patrone<ol><li>Wählen Sie die Kassette auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Instruments aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.</li>
		<li>Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.</li>
		<li>Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.</li>
		<li>Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.</li>
		<li>Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der PBS-Lösung und der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie 6 ml PBS-Lösung mit einer serologischen Pipette. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den PBS-Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam 6 ml der PBS-Lösung.</li>
		<li>Nach der Injektion der PBS-Lösung werden 3 ml Vollblut oder PBMC-Probe aus LBx-2 mit einer serologischen Pipette pipettiert, die zuvor mit 1% BSA gespült wurde, um ein Anhaften des Rückstands zu verhindern. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.</li>
		<li>Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .</li>
		<li>CTCs werden automatisch aus Vollblut angereichert, was ca. 15 Minuten dauert. Suchen Sie nach einer Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Anreicherung der CTCs abgeschlossen ist. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken.</li>
		<li>Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch. Führen Sie den hinteren Plattenentferner (BPR) in die vier Löcher an der Vorderseite der Patrone ein. Drücken Sie den dunkelblauen Flügel mit den Daumen beider Hände und drücken Sie dann auf den hellblauen Körper, bis er klickt.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig das Kartuschengehäuse, indem Sie es anheben. Nehmen Sie die Filtermembran mit einer Pinzette ganz vorsichtig am Rand auf. Bitte achten Sie darauf, den äußeren Rand (den 1 mm breiten Randteil) der Filtermembran zu verwenden, um die Filtermembran einzuklemmen und zu halten.</li>
		<li>Legen Sie die Filtermembran (auf der sich angereicherte CTCs befinden) vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zur Nukleinsäurepräparation. Falls erforderlich, das gefilterte Blut mit einer 1-ml-Pipettenspitze in den Blutauslass zurückgewinnen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Wartung des Systems
<ol><li>Vorbereitung für die Reinigung und Desinfektion des Instruments<ol><li>Reinigen Sie alle zugänglichen Oberflächen des Instruments und des Zubehörs einmal pro Woche mit Ethanol und getrocknetem Gewebe und auch sofort, wenn es kontaminiert ist.</li>
		<li>Reinigen Sie die Trommel und die Rotorwelle regelmäßig mit Alkohol (Ethanol und Isopropanol) oder Desinfektionsmitteln auf Alkoholbasis.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung und Desinfektion des Instruments HINWEIS: Allgemeine Hinweise zur Fehlerbehebung und andere Hinweise zum System finden Sie in der Zusatztabelle 2.<ol><li>Schalten Sie das Gerät mit dem Hauptnetzschalter aus. Trennen Sie den Netzstecker von der Stromversorgung.</li>
		<li>Öffnen Sie die Tür und reinigen und desinfizieren Sie alle zugänglichen Oberflächen des Geräts, einschließlich des Netzkabels, mit einem feuchten Tuch und den empfohlenen Reinigungsmitteln.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Rotorwelle auf Beschädigungen. Untersuchen Sie das Gerät auf Korrosion und Beschädigungen.</li>
		<li>Schließen Sie das Gerät nur dann an die Stromversorgung an, wenn es innen und außen vollständig trocken ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Ziehen Sie den Netzstecker ab und entfernen Sie den Sicherungshalter. Der Sicherungshalter befindet sich über der Steckdose. Ersetzen Sie die gebrauchte Sicherung durch eine Ersatzsicherung aus dem Behälter.</li>
</ol>

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<li>Bardelli, A., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsies%2C+what+we+do+not+know+%28yet%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsies, what we do not know (yet).</a> Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).</li>
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<li>Scudellari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myths+that+will+not+die%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myths that will not die.</a> Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).</li>
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<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+isolation%2C+culture%2C+and+downstream+molecular+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+advances%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis.</a> Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Die Menge und Konzentration von cfDNA und CTC hängt vom Individuum, dem Stadium und der Art des Krebses ab. Es hängt auch vom Zustand des Patientenab 2,4,5,10,20. Insbesondere in den frühen oder präkanzerösen Stadien von Krebs sind die Konzentrationen krebsrelevanter Substanzen sehr gering, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie nicht nachgewie...

Die frühzeitige und genaue Erkennung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, ist der wichtigste Faktor bei der Festlegung einer Behandlungsstrategie 1,2,3,4. Insbesondere die Früherkennung von Krebs steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Überlebenschancen für den Patienten 5,6,7,8. In jüngster Zeit stehen Flüssigbiopsien für die Früherkennung von Krebs im Rampenlicht. Solide Tumoren durchlaufen eine Angiogenese und setzen verschiedene Substanzen in das Blut frei. Insbesondere zirkulierende DNA (ctDNAs), zirkulierende RNAs (ctRNAs), Proteine, Vesikel wie Exosomen und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) wurden im Blut von Krebspatienten gefunden 2,9. Obwohl es Unterschiede in der Menge dieser Substanzen gibt, werden sie nicht nur in den frühen Stadien, sondern auch in den späteren Stadien konsequent beobachtet 6,10. Diese individuellen Unterschiede sind jedoch sehr hoch; Zum Beispiel beträgt die Menge an zellfreier DNA (cfDNA), die ctDNA enthält, weniger als 1.000 ng und die Anzahl der CTCs weniger als 100 in 10 ml Vollblut von Krebspatienten11,12,13. Viele Studien haben Krebs mit diesen Substanzen charakterisiert, die in geringeren Mengen vorhanden sind (d.h. cfDNA, ctDNA und CTCs). Um genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, kleine Mengen von Substanzen mit hoher Reinheit13,14 genau zu trennen. Konventionelle Zentrifugationsmethoden werden häufig verwendet, aber sie sind schwierig zu handhaben und haben je nach Geschicklichkeit des Benutzers eine geringe Reinheit. Seit der Entdeckung von CTCs wurden verschiedene Trenntechniken entwickelt, wie z. B. Zentrifugation oder Dichtegradtrennung, Immunbead und mikrofluidische Methoden. Seit der Entdeckung von CTCs wurden mehrere Containment-Techniken entwickelt. Diese Techniken sind jedoch oft begrenzt, wenn es notwendig ist, Zellen aus den verschiedenen Chips und Membranen zu isolieren, die verwendet werden, um sie zu isolieren15. Außerdem erfordern die Kennzeichnungsmethoden Geräte wie FACS, und dem nachgelagerten Prozess sind aufgrund der Markierungskontamination Grenzen gesetzt.
In letzter Zeit hat der Einsatz von Flüssigbiopsien zugenommen, und es werden verschiedene Studien zur Früherkennung von Krebs durchgeführt. Obwohl diese Methode einfach ist, gibt es immer noch Schwierigkeiten bei der nachgelagerten Analyse, und verschiedene Studien versuchen, diese Schwierigkeiten zu überwinden16,17. Darüber hinaus benötigen viele Standorte, einschließlich Krankenhäuser, automatisierte, reproduzierbare und hochreine Methoden, die bequem zu bedienen sind. Hier haben wir ein Lab-on-a-Disc für die automatisierte Trennung von Substanzen aus Blutproben nach einer Flüssigbiopsie entwickelt. Diese Geräte basieren auf dem Prinzip der Zentrifugation, Mikrofluidik und porengroßen Zellerfassung. Es gibt drei Arten von Bandscheiben: LBx-1 kann Plasma und Buffy-Coat aufnehmen, während LBx-2 Plasma und PBMC aus Vollblut mit einem Volumen von weniger als 10 ml aufnehmen kann. FAST-auto kann CTCs auch mit einer Membran erfassen, die von der Scheibe abnehmbar ist. Bis zu vier Stück pro Disc können in einem Durchlauf verwendet werden. Der Vorteil dieses Geräts und dieser Methode besteht vor allem darin, dass sie mit einer geringen Menge Blut eine Vielzahl von krebserregenden Substanzen aus derselben Probe gewinnen kann. Das bedeutet, dass dem Patienten nur einmal Blut abgenommen werden muss. Darüber hinaus hat es den Vorteil, dass Fehler aufgrund von Unterschieden in der Blutentnahmezeit ausgeschlossen werden. Diese Plattform ist einfach zu bedienen und liefert genaue Ergebnisse für Flüssigbiopsien und nachgelagerte Anwendungen. In diesem Protokoll wird die Verwendung des Geräts und der Patrone eingeführt.

<table><tbody><tr><td>1 % BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konisches Röhrchen</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>4150 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td>Zellfreies DNA-Siebband (Agilent, 5067-5630), Zellfreier DNA-Probenpuffer (Agilent, 5067-5633)</td></tr><tr><td>Apostle MiniMax Hocheffizientes zellfreies DNA-Isolationskit&nbsp;</td><td>Apostle</td><td>A17622-250</td> 5 <td>ml x 50 Vorbereitungsversion</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blutentnahmeröhrchen</td><td>BD</td><td>367525</td><td>EDTA Blutentnahmeröhrchen (10 ml)</td></tr><tr><td>BioViewCCBS</td><td>Clinomics</td><td></td><td>BioView Clinomics-kundenspezifisches Bioview System. Allegro Plus mikroskopgestützte Anpassungsausrüstung</td></tr><tr><td>CD45 Monoklonaler Antikörper (HI30), PE-Alexa Fluor 610</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD4522</td><td></td></tr><tr><td>FAST Auto Kartusche</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M3001</td><td></td></tr><tr><td>LBx-1 Kartusche</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4101</td><td></td></tr><tr><td>LBx-2 Kartusche</td><td>Clinomics</td><td>CLX-M4201</td><td></td></tr><tr><td>OPR-2000 Instrument</td><td>Clinomics</td><td>CLX-I2001</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0101040</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 2 Magnetständer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Solution</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Dichtegradientenlösung</td></tr><tr><td>Filterspitze, 10 & micro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-10</td><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Filterspitze, 200 & Mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-200</td><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Filterspitze, 100 & Mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-100</td><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarrieren werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>Filterspitze, 1000 & Mikro; L</td><td>Axygen</td><td>AX-TF-1000</td><td>Pipettenspitzen mit Aerosolbarrieren werden empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.</td></tr><tr><td>FITC Anti-Human-CD326 (EpCAM) Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>324204</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human-Cytokeratin</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehydlösung (35 Gew.-% in H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>433284</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Wipers</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41117</td><td></td></tr><tr><td>Latexhandschuh</td><td>Microflex</td><td>63-754</td><td></td></tr><tr><td>Magnetisches Perlentrenngestell</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 772F2M-2</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Pipettieren&nbsp; (0,5-10 &Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000020</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Pipettieren&nbsp; (2-20 &Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000038</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Pipettieren&nbsp; (10-100 &Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000046</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Pipettieren&nbsp; (20-200 &Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>Manuelles Pipettieren&nbsp; (100-1000 &Mikro; L)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI&nbsp;- wässrig, Fluoroshield</td><td>abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Normales humanes IgG-Kontrollmedium</td><td>R& D Systems</td><td>1-001-A</td><td></td></tr><tr><td>OLYMPUS BX-UCB</td><td>Olympus</td><td>9217316</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin Monoklonaler Antikörper (AE1/AE3), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53-9003-82</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-040CVC</td><td></td></tr><tr><td>Tragbares Pipettierhilfe</td><td>Drummond</td><td>4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerglas</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-1000612</td><td></td></tr><tr><td>StainTray Färbebox</td><td>Simport</td><td>M920</td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipette (10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100 Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN&nbsp; 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Vollblut</td><td></td><td></td><td>gelagert bei 4-8 &deg; C durch Sammeln in einem EDTA- oder cfDNA-stabilen Röhrchen : Wenn das Vollblut in 9 ml nicht ausreicht, fügen Sie PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) so viel wie nötig hinzu.</td></tr><tr><td>X-Cite 120Q (Leuchtstofflampen-Beleuchtung)</td><td>Excelitas</td><td>010-00157</td><td></td></tr></tbody></table>

automatische trennung und sammlung von krebsrelevanten substanzen aus klinischen proben

Automatic Separation and Collection of Cancer-Related Substances from Clinical Samples

In jüngster Zeit wurden Flüssigbiopsien verwendet, um verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Körperflüssigkeiten enthalten viele Substanzen, einschließlich Zellen, Proteine und Nukleinsäuren, die aus normalem Gewebe stammen, aber einige dieser Substanzen stammen auch aus dem erkrankten Bereich. Die Untersuchung und Analyse dieser Substanzen in den Körperflüssigkeiten spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose verschiedener Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die erforderlichen Substanzen genau zu trennen, und es werden mehrere Techniken entwickelt, die zu diesem Zweck verwendet werden können.
Wir haben ein Lab-on-a-Disc-Gerät und eine Plattform namens CD-PRIME entwickelt. Dieses Gerät ist automatisiert und hat gute Ergebnisse für die Probenkontamination und Probenstabilität. Darüber hinaus hat es die Vorteile einer guten Erfassungsausbeute, einer kurzen Betriebszeit und einer hohen Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus können je nach Art der zu montierenden Scheibe Plasma mit zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen, peripheren mononukleären Blutzellen oder Buffy-Coats getrennt werden. So kann die Erfassung einer Vielzahl von Materialien, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Omics, erfolgen.

Ziel dieser Technik ist es, krebsassoziierte Substanzen einfach und automatisch aus dem Vollblut zu isolieren. Insbesondere kann jeder diese Technik in allen geeigneten Forschungs- und Analysebereichen einsetzen. Die gleichzeitige und reproduzierbare Trennung mehrerer Substanzen in einer einzigen Blutprobe ist bei Flüssigbiopsien von Bedeutung. Die LBx-1- und LBx-2-Scheiben werden zur Isolierung von Plasma und Buffy Coat oder PBMC aus Vollblut verwendet. Abbildung 1 zeigt die Materialien, di...

Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.

Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

Recently, liquid biopsies have been used to diagnose various diseases, including cancer. Body fluids contain many substances, including cells, proteins, ...

Unser Protokoll ist benutzerfreundlich. Mit dieser Technik kann jeder leicht Komponenten aus dem Blut isolieren. Verunreinigungen können minimiert und Materialien genau getrennt werden.Mit der Automatisierung und der Etablierung dieses Protokolls können Forscher leicht krebsrelevante Substanzen mit hoher Reinheit erhalten, was für verschiedene nachgelagerte Studien hilfreich ist. Insbesondere wird erwartet, dass es wichtige Vorteile für die Endnutzerforschung bietet. Jay Jeong, ein leitender Forscher und stellvertretender Manager am Cancer Genomics Research Institute, wird ihr Verfahren demonstrieren.Legen Sie zunächst die LBx 1-Kassette ein, indem Sie den Kassettentyp auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts auswählen. Drücken Sie die Pfeiltaste, um die Anzahl der Proben zu ändern. Öffnen Sie dann die Instrumentenklappe und setzen Sie alle zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein.Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Run-Taste auf dem Touchscreen.Das Gerät schließt die Ventile an den Kartuschen, was ca. 30 Sekunden dauert. Folgen Sie der Nachricht, um die Tür zu öffnen. Entfernen Sie das Stützrad, und entfernen Sie die mit dem Ventil verschlossene Kartusche aus der Kartuschenhalterung.Pipettieren Sie maximal 10 Milliliter einer Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe. Nachdem Sie die Patronen in das Gerät eingesetzt haben, schließen Sie die Klappe des Instruments und drücken Sie die OK-Taste.Plasma- und Buffy-Mäntel werden automatisch vom Vollblut getrennt, was etwa 30 Minuten dauert. Sobald das Plasma und der Buffy-Coat getrennt sind, erscheint eine Meldung auf dem Bildschirm mit einem Alarmton. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die Stopp-Taste drücken.Öffnen Sie die Tür. Entfernen Sie die Patrone und legen Sie sie auf den Tisch. Gewinnen Sie drei Milliliter Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze.Gewinnen Sie dann drei Milliliter des Buffy-Mantels aus dem Buffy-Mantel-Auslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze. Legen Sie als Nächstes die LBx 2-Kassette ein, indem Sie den Namen der Patrone auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts auswählen. Drücken Sie die Pfeiltaste, um die Anzahl der Proben zu ändern, und befolgen Sie das gleiche Verfahren wie bei der LBx 1-Kassette, um die Patrone in den Patronenhalter einzusetzen.Drücken Sie nach dem Einsetzen der Patrone und dem Schließen der Klappe die Run-Taste auf dem Touchscreen. Befolgen Sie die oben gezeigte Vorgehensweise, um die mit dem Ventil geschlossene Kartusche aus dem Kartuschenhalter zu entfernen und auf den Tisch zu legen. Die Dichtegradientenlösung wird mit einer serologischen Pipette pipettiert.Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Lösung. Dann pipettieren Sie die Vollblutprobe und injizieren Sie sie langsam in den Probeneinlass. Schließen Sie nach dem Einsetzen und Sichern der Patrone die Klappe, und drücken Sie die Taste OK.Sobald das Plasma und PBMC automatisch vom Vollblut getrennt werden, erscheint eine Nachricht mit einem Alarmton. Öffnen Sie die Klappe und entfernen Sie die Patrone. Gewinnen Sie drei Milliliter Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze und gewinnen Sie dann drei Milliliter des PBMC aus dem PBMC-Auslass.In ähnlicher Weise injizieren Sie bei der FAST-Auto-Kartusche nach dem Entfernen der ventilverschlossenen Kartusche aus dem Kartuschenhalter sechs Milliliter der PBS-Lösung in den PBS-Einlass der Kartusche. Dann pipettieren Sie drei Milliliter Vollblut oder Buffy-Coat, das aus LBx 1 oder PBMC-Probe aus LBx 2 gewonnen wurde, und injizieren Sie die Probe langsam in den Probeneinlass der Patrone. Nachdem Sie die Patrone eingesetzt und gesichert haben, schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK.Sobald die automatische Anreicherung der CTCs abgeschlossen ist, stoppen Sie den Alarm. Entfernen Sie die Patrone und setzen Sie den Backplate-Entferner (BPR) in die vier Löcher an der Vorderseite der Patrone ein. Drücken Sie den dunkelblauen Flügel mit den Daumen beider Hände und drücken Sie dann auf den hellblauen Körper, bis er klickt.Entfernen Sie vorsichtig das Kartuschengehäuse, indem Sie es anheben. Nehmen Sie die Filtermembran mit einer Pinzette ganz vorsichtig am Rand auf und legen Sie die Membran zur Nukleinsäurepräparation in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen oder für die Färbung auf ein Objektträgerglas. Falls erforderlich, das gefilterte Blut mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in den Blutauslass zurückgewinnen.Die extrahierten cfDNAs wurden mit einem Bioanalysator ausgewertet, und cfDNA-Screen-Bänder wurden zusammen mit einer elektronischen Leiter verwendet. Die grüne Linie wurde verwendet, um die Leiter und die Probe auszurichten. Die Dreiecksmarkierungen zeigen die DNA-Bande an.Die meisten cfDNA haben eine Länge von 166 Basenpaaren und einige existieren in ganzzahligen Vielfachen der Länge. In der Regel misst die Konzentration von cfDNA bis zu einer Größe von 50 bis 700 Basenpaaren. Obwohl es einen Unterschied in der Menge gibt, die aus jeder einzelnen Probe gewonnen wird, wie 8,47 Nanogramm pro Milliliter und 5,2 Nanogramm pro Milliliter, waren die Ergebnisse der cfDNA-Extraktion in allen Fällen sowohl für die Konzentration als auch für die Größenverteilung gut.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die LBx-1-Methode cfDNA-haltiges Plasma genau separiert. Bei FAST-auto wurde die Membran entfernt und mit fluoreszierenden Antikörpern gefärbt, um CTCs und weiße Blutkörperchen nachzuweisen. Die gefärbte Membran, die auf Objektträgern platziert wurde, wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.Nach der Membranfärbung zeigen die Zellen DAPI- oder nuklear-positive Signale in blau, während EpCAM und CK- oder CTC-positive in grün und CD45- oder WBC-positive in rot hervorgehoben sind. Es ist nicht schwer, die Membran zu entfernen. Es ist jedoch notwendig, auf den Verlust und die Kontamination von CTCs zu achten.Vollblut, PBMC und Buffy Coat sind alle verfügbar. Stattdessen müssen Sie nur die gesamte Lautstärke einstellen. Es können auch andere Flüssigkeiten verwendet werden, obwohl Tests erforderlich sind.Diese Technik kann direkt in Krankenhäusern betrieben werden und die Substanz kann schnell gewonnen werden.

automatic-separation-collection-cancer-related-substances-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

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Automatische Trennung und Sammlung von krebsrelevanten Substanzen aus klinischen Proben

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