Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Dieses nanobar-gestützte Lipiddoppelschichtsystem kann verwendet werden, um die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Dynamik und Verteilung von Proteinen und Lipiden während der Zellaktivitäten zu untersuchen. Diese Technik bietet sowohl eine hohe Subwurzel als auch eine schlechte Membrankrümmung durch Bildung einer kontinuierlichen Lipiddoppelschicht auf offensichtlichen Nanobarfehlern mit Membrankrümmung, die durch hochauflösende Nanofabrikation vordefiniert ist. Legen Sie den Nanochip zunächst mit der Musterseite nach oben in ein 10-Milliliter-Becherglas.

Geben Sie vorsichtig einen Milliliter 98% Schwefelsäure in das Becherglas und stellen Sie sicher, dass die Säure die Vorder- und Rückseite des Chips vollständig bedeckt. Drehen Sie das Becherglas langsam und fügen Sie 200 Mikroliter 30% Wasserstoffperoxid Tropfen für Tropfen hinzu, bis das ganze Becherglas heiß wird. Stellen Sie sicher, dass Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid gut gemischt sind, um Piranha-Lösung zur Entfernung organischer Moleküle aus dem Nanochip zu bilden.

Stellen Sie das Becherglas in einen sekundären Glasbehälter und lassen Sie den Nanochip über Nacht in die Piranha-Lösung eintauchen, um die Verunreinigungen gründlich zu reinigen. Nehmen Sie das Becherglas heraus und pipetten Sie die Piranha-Lösung vorsichtig in einen sauren Abfallbehälter. Laden Sie fünf Milliliter entionisiertes Wasser in das Becherglas, um die Restsäure zu verdünnen und in den sauren Abfall zu werfen.

Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal. Nehmen Sie den Chip mit einer Pinzette und waschen Sie ihn mit einem kontinuierlichen Strom von entionisiertem Wasser, um Restsäure gründlich zu entfernen. Föhnen Sie den Chip mit 99,9% Stickstoffgas für die SLB-Bildung.

Die Lipidmischung für 30 Minuten beschallen. Das Lipidgemisch in flüssigem Stickstoff für 20 Sekunden einfrieren und dann bei 42 Grad Celsius für zwei Minuten in einem Wasserbad auftauen. Wiederholen Sie die Gefrier-/Auftauzyklen 30 Mal.

Danach sieht die Lipidmischung wie eine klare Flüssigkeit aus. Die Lipidmischung durch den Mini-Extruder leiten und 20 Mal hin und her extrudieren. Sammeln Sie die SUVs von der Spritze auf der anderen Seite, um die Kontamination mit größeren Partikeln oder Fremdmaterial zu reduzieren, und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Nehmen Sie den gereinigten Nanochip vorsichtig mit einer Pinzette aus entionisiertem Wasser heraus und föhnen Sie ihn mit 99,9% Stickstoffgas trocken. Führen Sie die Oberflächenreinigung des Nanochips mit Luftplasmabehandlung für eine Stunde durch. Montieren Sie den Nanochip in einer PDMS-Kammer.

Beginnen Sie damit, den Chip mit dem Muster nach oben auf eine saubere Oberfläche zu legen. Decken Sie das mittlere PDMS vorsichtig mit dem Chip ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Muster dem zentralen Bereich der großen ovalen Öffnung im mittleren PDMS ausgesetzt ist. Decken Sie das obere PDMS mit dem mittleren PDMS ab und halten Sie seine beiden kleinen Löcher im Bereich des großen ovalen Lochs des mittleren PDMS.

Dann wird die PDMS-Kammer zusammengebaut. Laden Sie die SUVs aus einem der beiden kleinen Löcher im oberen PDMS mit einer Pipette in den PDMS-Kanal und inkubieren Sie 15 Minuten bei Raumtemperatur, um den SLB zu bilden. Pipettieren Sie den PBS-Puffer vorsichtig von einer Seite des kleinen Lochs in den PDMS-Kanal und entfernen Sie den Abfall mit einem Wattestäbchen aus dem anderen Loch, um die ungebundenen SUVs wegzuwaschen.

Dann erfassen Sie das SLB, das auf dem Nanochip gebildet wird. Richten Sie die konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit einem 100-fach-Ölobjektiv ein. Öffnen Sie die Zen-Software, um die Anregungslaserleistung auszuwählen, die die Fluoreszenz des Lipids und des Proteins anregen kann.

Wählen Sie Erfassungsmodus. Klicken Sie dann auf Smart Setup, gefolgt von Texas Red. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein, um die Nanobalken auf dem Chip zu lokalisieren, bis die Nanobalkenkanten unter dem Lipidkanal scharf sind.

Stellen Sie die Scanparameter ein, um ein Kontrollbild des Lipidkanals zu erhalten, bevor Sie Protein hinzufügen. Führen Sie den FRAP-Assay durch, indem Sie mit fluoreszierend markierter Lipiddoppelschicht auf einem zufälligen einzelnen Nanobarbereich bleichen. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Experimentbereiche und Bleichen.

Zeichnen Sie eine kreisförmige Fläche von fünf Mikrometern Durchmesser, die den gesamten Nanobalken in der Mitte umfassen kann, und fügen Sie den Experimentregionen hinzu. Geben Sie TimeLapse-Bildgebungsparameter ein. Wählen Sie Zeitreihe aus.

Klicken Sie dann auf Dauer. Wählen Sie 100 Zyklen und ein Intervall gleich zwei Sekunden. Eingabe von Bleichparametern.

Aktivieren Sie die Laserkontrollkästchen, die FRAP ausführen, und ändern Sie die Leistung auf 100%Klicken Sie auf Test starten für das FRAP-Experiment. Laden Sie die Proteinlösung in den PDMS-Kanal und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, um die Bindung des Proteins an das SLB zu ermöglichen. Fokussieren Sie die Nanobalken neu und stellen Sie die Scanparameter ein, um Bilder von Lipid- und Proteinkanälen für die Erkennung von Proteinkrümmungen aufzunehmen.

Wählen Sie Experimentregionen aus und führen Sie den FRAP-Assay sowohl auf Lipid- als auch auf Proteinkanälen durch und führen Sie TimeLapse-Bildgebung durch, um die Mobilität des Krümmungssensorproteins zu charakterisieren. Beide zeigen eine erhöhte Akkumulation am Ende von SLB-beschichteten einzelnen Nanobarren mit 300 Nanometern Breite. Hier enthält der SLB 10%PS, um die Proteinbindung elektrostatisch zu verstärken.

Beide Proteine haben ein höheres End-zu-Mitte-Verhältnis als Lipide, was etwa eins ist. Beim Vergleich von IDR FBP17 und F-Bar deutet das höhere End-zu-Mitte-Verhältnis von IDR FBP17 auf eine stärkere Krümmungserfassung als F-Bar hin. Alle drei Proteine zeigten eine bevorzugte Akkumulation an den gekrümmten Membranstellen des Nanobarendes, wenn die Krümmung unter 400 Nanometer im Durchmesser abnahm.

Unter diesen drei Proteindomänen liefert IDR FBP17 den höchsten Nano-Balken und die höchste Dichte, was auf seine stärkste Krümmungserfassungsfähigkeit hinweist, während F-Bar den niedrigsten Wert aufweist. Die Proteinbindungskurve kann durch allmähliche Erhöhung der Proteinkonzentration aufgezeichnet werden, was zeigt, dass IDR FBP17 eine starke kooperative Krümmungserfassungsfähigkeit aufweist. Im Vergleich zur schnellen Wiederherstellung von Lipidsignalen auf Nanobarren kann sich der F-Bar nicht innerhalb von zwei Minuten erholen, was auf eine signifikant verminderte Membranmobilität und Assoziationsdynamik an den gekrümmten Membranstellen hindeutet.

Überraschenderweise zeigten IDR FBP17-Signale, die sich vom Verhalten von F-Bar unterschieden, eine offensichtliche Erholung innerhalb desselben Zeitrahmens, was auf die dynamische Natur von IDR FBP17 hinweist, das sich an den gekrümmten Membranen angesammelt hat. Nach dem Wegspülen des ungebundenen IDR FBP17 in der Lösung konnte jedoch nicht die gleiche Erholung im IDR FBP17-Kanal beobachtet werden wie zuvor. Die SLB-Qualität ist sehr wichtig, wenn die Wechselwirkung zwischen gekrümmter Membran und Protein untersucht wird.

Daher ist der FRAP-Test in unserem Experiment notwendig, um die Membranbeweglichkeit zu validieren. Dieses System wird den Forschern helfen, verschiedene Parameter zu untersuchen, die die Proteininteraktion mit der gekrümmten Membran beeinflussen, wie die Krümmungssensordomänen und die Lipidzusammensetzung, sowie die dynamischen Studien an gekrümmten Membranen wie das Verhalten der Gesichtstrennung durchzuführen.