Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung und Analyse von Myokard-B-Zellen

Die Literatur berichtet von widersprüchlichen Daten zur Prävalenz von Myokard-B-Zellen. Dies ist wahrscheinlich auf die Variabilität der Perfusions- und Verdauungstechniken zurückzuführen. Unser Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Myokard-B-Zellen.

Diese Technik maximiert die Ausbeute an B-Zellen und reduziert die Variabilität der Durchflusszytometrie-Zahlen zwischen B-Zellen und anderen Populationen aus Herzproben. Diese optimierte Verdauungs- und Isolierungsmethode kann leicht modifiziert werden, um ein erweitertes Antikörperpanel zu implementieren, um verschiedene Immunzelltypen im Herzen zu untersuchen. Das Protokoll kann auch auf andere Organe wie Lunge oder Leber angewendet werden, um B-Zellen zu untersuchen, die mit diesen Organen assoziiert sind.

Wiegen Sie zunächst eine 12 Wochen alte männliche Maus. Beladen Sie eine 310-cm³-Insulinspritze mit 100 Mikrolitern der B220-Antikörperlösung. Injizieren Sie den verdünnten B220-Antikörper durch retroorbitale Injektion und fahren Sie sofort mit der Organentnahme und Perfusion fort.

Halten Sie nach der Euthanasie die Haut der Maus mit einer Pinzette im Oberbauchbereich. Machen Sie mit einer Schere eine zwei Millimeter große Öffnung in der Haut und ziehen Sie die Haut mit der Pinzette ab, um die Faszienschicht freizulegen. Schneiden Sie am Epigastrium durch die Faszie und das Peritoneum.

Klemmen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer hämostatischen Pinzette. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Brustwand auf Höhe der Mittelklavikularlinie auf jeder Seite und heben Sie die vordere Brustwand an, um den Mediastinuminhalt freizulegen. Halten Sie die Aorta mit einer Pinzette sicher von hinten.

Führen Sie die Spritzennadel in die Herzspitze ein. Perfundiert mit drei Millilitern HBSS mit einer Geschwindigkeit von drei Millilitern pro Minute. Schneiden Sie die Aorta und entfernen Sie das Herz.

Waschen Sie das Herz in der Petrischale mit HBSS. Wiegen Sie das isolierte Herz und notieren Sie das Gewicht in Milligramm. Zerkleinern Sie das Herz bei Raumtemperatur mit einer Klinge in kleine Stücke.

Die Herzstücke sollten etwa 1,5 Millimeter groß sein. Messen Sie die Masse des Herzgewebes mit einer Waage und geben Sie 60 Milligramm des zu verdauenden Hackfleisches in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern HBSS auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine Maus, die die B220-Antikörperinjektion nicht erhalten hat, und legen Sie sie in das Röhrchen mit drei Millilitern HBSS-markiertem Referenzkontrollgewebe.

Fügen Sie Enzyme zu jedem Röhrchen hinzu, das Hackgewebe enthält. Fügen Sie 0,5 Mikroliter pro Milligramm DNase I, 0,5 Mikroliter pro Milligramm Kollagenase II und 0,2 Mikroliter pro Milligramm Hyaluronidase hinzu. Legen Sie die Verdauungsreaktion für 30 Minuten mit 300 Umdrehungen pro Minute in den Schüttler.

Die Rohre werden in einem kleinen Winkel von etwa 25 Grad Neigung in den Shaker gelegt. In jedes der 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen sieben Milliliter HBSS geben und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 250 g zentrifugieren. Nach dem Dekantieren des Überstands wird jedes Pellet in fünf Milliliter ACK-Lysepuffer resuspendiert.

Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem Sie 10 Milliliter PBS in jedes Röhrchen gegeben haben, mischen und filtrieren Sie es in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit einem 40-Mikrometer-Sieb. Zertrümmern Sie alle Schmutzpartikel auf dem Filter mit einem Spritzenkolben, um sicherzustellen, dass das gesamte Material durch den Filter gelangt.

Nach der Zugabe von PBS durch den Filter, bis das Volumen 25 Milliliter pro Herz erreicht, fügen Sie weitere 25 Milliliter PBS in das Referenzkontrollgeweberöhrchen hinzu und teilen Sie das Volumen in zwei verschiedene Röhrchen auf. Beschriften Sie eine der Röhrchen als unbefleckt und die andere als lebend / tot. Nach dem Zentrifugieren bei 250 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius dekantiert der Überstand und resuspendiert das ungefärbte Röhrchen in 100 Mikroliter PBS und jedes der anderen Pellets in 100 Mikroliter der lebenden/toten Fleckenlösung.

30 Minuten im Dunkeln auf Eis brüten. Nachdem Sie jeder Probe 500 Mikroliter FACS-Puffer zugesetzt haben, geben Sie sie durch einen 40-Mikrometer-Filter in ein FACS-Röhrchen. Nachdem Sie die FACS-Röhrchen bei 250 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius abgelehnt und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikroliter FACS-Puffer.

Fügen Sie 50 Mikroliter FC-Blockierungslösung zu jedem Röhrchen hinzu, mit Ausnahme der ungefärbten und lebenden/toten Röhrchen. Mischen und fünf Minuten lang inkubieren. Nach Zugabe von 50 Mikrolitern Antikörper-Mischlösung zu jedem Röhrchen, mit Ausnahme der ungefärbten und lebenden/toten Röhrchen, inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln und bedecken Sie den Eiskübel mit Aluminiumfolie.

Wie beim lebenden/toten Fleck erneut mit 500 Mikrolitern FACS-Puffer waschen und in 300 bis 500 Mikrolitern FACS-Puffer resuspendieren. Öffnen Sie die Instrumentensteuerungssoftware. Wählen Sie oben im Fenster die Registerkarte Akquisition und klicken Sie auf Neu.

Geben Sie im Bibliotheksbereich im Feld Zu filternden Typ PE, PerCP-Cy5.5, Brillantviolett 421, Alexa Fluor 700 und Zombie Aqua ein, wählen Sie das Fluoro-4 aus und klicken Sie nach der Eingabe auf Hinzufügen. Klicken Sie dann auf Weiter, um zur Registerkarte Gruppen zu gelangen. Klicken Sie nun auf das Symbol mit einer Röhre, um das Herz für die Analyse hinzuzufügen.

Klicken Sie auf die Referenzgruppe und es öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie in der Spalte fluoreszierende Tags Zombie Aqua als fluoreszierendes Tag aus und löschen Sie alle anderen, indem Sie auf das rote Papierkorbsymbol daneben klicken. Wählen Sie dann im Symbol "Steuerelementtyp" die Option "Zellen" aus.

Klicken Sie dann auf Speichern. Klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Marker.

Eine Tabelle wird angezeigt. Geben Sie die entsprechende Zellmarkierung in die erste Zeile jeder Fluor-4-Spalte ein und drücken Sie die Eingabetaste. Klicken Sie zweimal auf Weiter, um zur Registerkarte Erfassung zu gelangen.

Geben Sie im Feld Ereignisse zur Aufzeichnung der experimentellen Stichproben 10 Millionen und im selben Feld für die Referenzgruppenzeile 200.000 ein. Klicken Sie auf Speichern und öffnen. Klicken Sie unten links auf Instrument Control.

Stellen Sie die Spannung auf FSC 50, SSC 175, SSC-B 175 ein. Wählen Sie das Erfassungssteuerelement aus. Wählen Sie für die Option "Durchflussrate" im Dropdown-Menü die Option "Hoch" aus.

Wirbeln Sie den ungefärbten Herzschlauch vor und legen Sie ihn sicher auf die Probeninjektionsöffnung. Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Stichprobe zeigt. Klicken Sie dann auf Aufzeichnen und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet wurden.

Machen Sie dasselbe für das lebende/tote gefärbte Herzgewebe. Wählen Sie das Menü "Unmix" und legen Sie die Steuerelemente fest. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Autofluoreszenz als fluoreszierendes Tag.

Klicken Sie dann auf Weiter, um zur Registerkarte Positive/Negative Populationen identifizieren zu gelangen. Auf dieser Registerkarte wird ein Diagramm des Forward-Scatter-Bereichs im Vergleich zum Side-Scatter-Bereich angezeigt. Klicken Sie auf die Punkte des Polygons, und ziehen Sie sie, um einen Bereich zwischen 1 und 4 Millionen auf der Achse des vorderen Punktbereichs und zwischen 0,2 und 3 Millionen auf der Achse des seitlichen Punktbereichs auszuwählen.

Im nächsten Diagramm rechts wird V5-A auf der X-Achse angezeigt. Verschieben Sie die Tore, um die Hälfte des Gipfels ganz rechts als positiv und einen Bereich auf der linken Seite des Diagramms als negativ auszuwählen. Wählen Sie im Diagramm mit dem Titel "Referenzgruppe-Ungefärbt" eine Grundgesamtheit in einem ähnlichen Bereich aus.

Für die Ungefärbten muss kein Positiv/Negativ ausgewählt werden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Live Unmixing". Erfassen Sie nun die experimentellen Proben, wirbeln Sie das Röhrchen und legen Sie es sicher auf das SIP.

Stellen Sie sicher, dass der grüne Indikatorpfeil auf die richtige Stichprobe zeigt. Klicken Sie dann im Bereich "Erfassungssteuerung" der Zytometersoftware auf "Aufzeichnen" und warten Sie, bis die Ereignisse aufgezeichnet wurden. Wählen Sie die Registerkarte Ungemischtes Standardarbeitsblatt aus.

Erstellen Sie ein FCS-A- und SSC-A-Diagramm mit dem Punktdiagramm-Werkzeug oben. Wählen Sie Ereignisse mit mehr als 0,4 Millionen auf der FSC-A-Achse und mehr als 0,8 Millionen auf der SSC-A-Achse mit dem Polygonauswahlwerkzeug aus. Erstellen Sie ein neues Diagramm, indem Sie auf die Auswahl doppelklicken, und klicken Sie in diesem neuen Diagramm mit der rechten Maustaste auf die Y-Achsenbeschriftung und wählen Sie lebenden/toten Fleck aus.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Beschriftung der X-Achse und wählen Sie Autofluoreszenz A. Wählen Sie alle Ereignisse unter 10 bis zum fünften auf der Lebend-/Tot-Achse aus. Dies sind die lebenden Zellen. Doppelklicken Sie in diese Auswahl.

Wählen Sie im neuen Diagramm PerCP-Cy5.5A für die X-Achse und SSC-A für die Y-Achse aus. Wählen Sie die Populationen auf der rechten Seite des PerCP-Cy5.5A aus. Das sind die Immunzellen.

Doppelklicken Sie auf die Auswahl. Wählen Sie im neuen Diagramm FSC-A für die X-Achse und Vorwärtsstreuhöhe für die Y-Achse aus. Wählen Sie die Ereignisse aus, die einem Trend folgen, bei dem der FSC-A-Wert und der SSC-A-Wert identisch sind.

Dadurch werden einzelne Zellen selektiert und Dubletten eliminiert. Doppelklicken Sie auf diese Auswahl, um ein neues Diagramm in der CD45-positiven Einzelzellpopulation anzuzeigen. Wählen Sie aus dem CD45-positiven Einzelzellpopulationsdiagramm brillantes Violett 421 auf der X-Achse gegenüber SSC-A auf der Y-Achse aus.

Wählen Sie die Grundgesamtheit rechts auf der leuchtend violetten 421-Achse aus. Dies ist die B-Zell-Population. Doppelklicken Sie zweimal auf diese Grundgesamtheit, um zwei neue Diagramme mit der B-Zell-Grundgesamtheit zu erstellen.

Richten Sie das erste B-Zell-Diagramm mit PEA auf der X-Achse und brillantem Violett 421A auf der Y-Achse ein. Die Population auf der rechten Seite entspricht den intervaskulären B-Zellen und die Population auf der linken Seite repräsentiert die interstitiellen B-Zellen. Wählen Sie beides aus.

Richten Sie das zweite B-Zell-Diagramm mit Alexa Fluor 700A auf der X-Achse und SSC-A auf der Y-Achse ein. Die Population auf der linken Seite entspricht den CD11b-negativen Zellen, und die Ereignisse auf der rechten Seite entsprechen den CD11b-positiven Zellen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die einzelnen Abschnitte, und klicken Sie dann auf Gate-Eigenschaften.

Klicken Sie auf Anzahl und Eltern, um die Anzahl der Ereignisse und Prozentsätze der übergeordneten Populationen anzuzeigen. Zeichnen Sie die Anzahl der Ereignisse und Prozentsätze für die weitere Datenanalyse auf. Nach der Entfernung von Dubletten in einem naiven unverletzten Herzen wird erwartet, dass etwa 20% der CD45-positiven Zellen CD19-positive B-Zellen sein werden.

Von diesen Zellen befinden sich durchschnittlich 5,5% im interstitiellen Raum. 94,5% befinden sich im intravaskulären Raum. Von der gesamten B-Zell-Population im Herzen entsprechen nur etwa 1,6 % B1-Zellen, basierend auf dem Oberflächenmarker CD11b, und die anderen 98,4 % entsprechen B2-Zellen.

Bei der Analyse von Myokard-B-Zellen mittels Durchflusszytometrie ist es entscheidend, das Herz gemäß dem Protokoll richtig zu perfundiert und zu zerkleinern. Die richtige Filtration des verdauten Herzens ist ebenfalls wichtig, um die Erholung der Immunzellen zu maximieren.