Name: Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Lernen Sie die Optimierung der Durchflusszytometriesortierung zur schnellen Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel. Diese Methode ermöglicht präzise Größenseparation für Zellbiologie-Studien.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Wissenschaftlichen Forschungsfonds der Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), das Basic Public Welfare Research Project der Provinz Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), das Projekt des Bildungsministeriums der Provinz Zhejiang (Y202147028) und das Projekt für experimentelle Technologie der Laborabteilung der Zhejiang University (SJS201712, SYB202130).

1. Zellkultur
<ol><li>Bereiten Sie ein Nährmedium aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) vor, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt wird. Die menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebszelle PANC-1 wird in einem 75cm2 Kulturkolben mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml kultiviert. Inkubation der Kultur bei 37 °C mit 5% CO2.</li>
	<li>Subkultur der Zellen, wenn die Zelldichte unter mikroskopischer Beobachtung 75%-80% erreicht. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie es 2x mit 3-5 ml Phosphatpufferkochsalzlösung (PBS; 0,01 M, pH 7,2-7,4) ab.</li>
	<li>Verwerfen Sie die Lösung, fügen Sie 1-2 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und lassen Sie die Zellen ablösen, bis sie rund und im Medium unter dem Mikroskop suspendiert sind. Fügen Sie frisches Medium hinzu, saugen Sie es ab und verteilen Sie es in 75 cm 2-Kulturflaschen mit 15 ml Nährmedium. Verwenden Sie ein Teilkultivierungsverhältnis von 1:2 bis 1:4 (empfohlen). HINWEIS: Alle Vorgänge werden in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt, um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.</li>
</ol>2. Sammlung von Kulturmedien
<ol><li>Inkubation der Zellen für 48 h bei 37 °C mit 5% CO2. Der Zellüberstand (90 ml) wird in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen aufgefangen und bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Der Überstand wird in neue sterile Röhrchen überführt und nacheinander bei 2.000 x g für 20 min, 10 000 x g für 30 min und 12.000 x g für 70 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und spülen Sie das Pellet mit 10 ml PBS durch vorsichtiges Pipettieren aus. Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g für 70 min bei 4 °C erneut und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml PBS-Puffer, um eine Mischung aus EVs zu erhalten.</li>
	<li>Führen Sie eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) durch, um das EV-Gemisch zu quantifizieren und zu dimensionieren. Führen Sie die NTA-Analyse gemäß dem Referenzhandbuch für den Gerätebetrieb und der Referenz21 durch.</li>
</ol>3. Sortierung der Zellen
<ol><li>Führen Sie den Standard-Startvorgang des Durchflusszellensortierers durch. Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Starttaste drücken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Laserleistung auf dem Bedienfeld des Lasers . Drücken Sie die Taste "Tanks wechseln " im Untermenü des intelligenten Probenehmers, um die Fluidik unter Druck zu setzen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Fäkalientank leer und der Manteltank voll ist, bevor Sie ihn in Betrieb nehmen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine ultraschallgereinigte 50-μm-Jet-in-Air-Düse und installieren Sie sie auf der Düsenbaugruppe. Stellen Sie den Druck auf 80 psi für die Mantelflüssigkeit und 80,3 psi für den Probenfluss an der Druckkonsole ein.</li>
	<li>Drücken Sie die Taste Start Sheath Flow , um den Mantelstrom zu starten. Klicken Sie im Untermenü des Smart Samplers auf die Schaltfläche "Bubble ", um die Blase automatisch für 10 Minuten zu entleeren und dann auszuschalten. HINWEIS: Für die Zellsortierung erfordern unterschiedliche Größen von Luftsprühdüsen unterschiedliche Mantelflüssigkeitsdrücke, um die Stabilität des Flüssigkeitsflusses aufrechtzuerhalten. Bei diesem Verfahren wurde eine Düse von 50 μm verwendet, und nur ein Mantelflüssigkeitsdruck größer oder gleich 80 psi konnte stabile Seitenströme erzeugen. Die Druckdifferenz zwischen dem Probenstrom und der Mantelflüssigkeit bestimmt die Ladegeschwindigkeit der Sortierung. Unter den Einstellbedingungen des Verfahrens (die Druckdifferenz zwischen dem Probenstrom und der Mantelflüssigkeit beträgt 0,3 bis 0,6 psi) war der Flüssigkeitsfluss relativ stabil, und die Ladegeschwindigkeit ermöglichte es, die Sortiereffizienz von 50 % auf 80 % für eine Druckdifferenz von weniger als 0,3 bis 0,6 psi zu erhöhen.</li>
	<li>Richten Sie den Strom aus und bestimmen Sie den Laserpunkt. Schalten Sie das Licht der Beleuchtungskammer ein, um den Strom über die Nadellöcher zu sehen. Passen Sie die Mikrometer nach oben und unten, links und rechts sowie vorne und hinten an, um den Stream auf der Lochblende zu zentrieren und den Stream zu fokussieren.</li>
	<li>Wählen Sie die Registerkarte Laser- und Stream-Abfangen aus. Drücken Sie die grüne Pfeiltaste kontinuierlich, wenn Sie dazu aufgefordert werden, um den Kalibrierungsprozess für den Laserabschnitt und die Düsenausrichtung abzuschließen.</li>
	<li>Greifen Sie auf den Bildschirm für die Feinlaserausrichtung zu. Wählen Sie den Kanal 640-722/44 (H) als Parameter für die X-Achse und den Kanal 405-448/59 (H) als Parameter für die Y-Achse. Drücken Sie den Triggerparameter-Selektor und wählen Sie den SSC-Parameter des 488-nm-Lasers. Öffnen Sie alle Laser-Shutter. HINWEIS: Die gewählten Parameter für die X- und Y-Achse hängen von der Laserkonfiguration des Systems ab. Andere Parameter sind zulässig, wenn das System nicht über einen 640-nm- oder 405-nm-Laser verfügt. Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie Laser mit dem größten räumlichen Abstand auf dem Lochstreifen auswählen (ohne den 355-nm-Laser).</li>
	<li>Verdünnen Sie die regenbogenfluoreszierenden Partikel, indem Sie einen Tropfen in 1 ml doppelt destilliertes Wasser geben, um eine Endkonzentration von 1 x 106 Kügelchen pro ml zu erreichen. Öffnen Sie die Tür der Probenkammer und laden Sie ein Röhrchen mit den vorbereiteten fluoreszierenden Regenbogenpartikeln.</li>
	<li>Drücken Sie die Taste Start Sample . Passen Sie die Auf- und Ab-Mikrometer an, um die Fluoreszenzintensität zu optimieren und jedes Signal so intensiv wie möglich zu gestalten. Drücken Sie die Taste Start Quality Control (QC) auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um die Qualitätskontrolle automatisch durchzuführen.</li>
	<li>Führen Sie eine Drop-Verzögerung durch. Rufen Sie den Sortier-Setup-Bildschirm auf und wählen Sie die Schaltfläche für die Drop-Verzögerung. Klicken Sie auf die Schaltfläche IntelliSort-Initialisierung . Das Instrument passt automatisch die Frequenz und Amplitude der Tröpfchenschwingung an, um die Tropfenverzögerung von 25 ± 5 zu erhalten und den Abbruchpunkt des Tropfens klar visualisieren zu können. Drücken Sie die Schaltfläche Pflegen .</li>
	<li>Wählen Sie Tube als Sortierausgabetyp aus. Legen Sie einen 15-ml-Röhrchenhalter in die Sortierkammer. Schalten Sie die Plattenspannung ein und stellen Sie die Plattenspannung auf ca. 4000 V ein.</li>
	<li>Aktivieren Sie das Testmuster, indem Sie auf die Schaltfläche Stream-Setup klicken. Stellen Sie den Schieberegler für die Ladephase und den Schieberegler für die Ablenkung ein, um sicherzustellen, dass das Bild des Stroms mit dem Sammelrohr ausgerichtet ist. Wählen Sie die Schaltfläche Häkchen aus.</li>
	<li>Melden Sie sich bei der Summit-Workstation auf dem Computer an. Erstellen Sie ein neues Protokoll über das Hauptmenü Datei. Erstellen Sie ein Punktdiagramm, indem Sie in der Systemsteuerung der Summit-Software die Registerkarte Histogramm auswählen.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Achsen des neuen Punktdiagramms im Arbeitsbereich, und wählen Sie FSC als Parameter für die X-Achse und SSC als Parameter für die Y-Achse aus. Stellen Sie FSC und SSC in logarithmischer Form dar.</li>
	<li>Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und suchen Sie den Bereich " Erfassungsparameter". Aktivieren Sie alle Signale im Untermenü der Parameter aktivieren. Wählen Sie FSC als Triggerparameter und legen Sie den Schwellenwert auf 0,01 fest. Stellen Sie die Spannung und Verstärkung von FSC und SSC auf 250 und 0,6 ein, um sicherzustellen, dass Ereignisse innerhalb des FSC- und SSC-Diagramms und der Populationen getrennt sind. HINWEIS: Die Einstellung des Schwellenwerts entspricht der Einstellung der Partikelgröße, die durch Durchflusszytometrie nachgewiesen werden kann. Je größer der Schwellenwert ist, desto größer sind die detektierten Partikel, und die kleinen Partikel werden durch den Schwellenwert abgeschnitten und können nicht erkannt werden. Bei dieser Methode wird der Schwellenwert auf 0,01 festgelegt, sodass alle Partikel, die größer als elektronisches Rauschen sind, erkannt werden können.</li>
</ol>4. Isolierung von sEV
<ol><li>Die fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln werden auf Suspensionen von 100 nm, 200 nm und 300 nm verdünnt. 1 μl Mikrokugeln zu 1 ml doppelt destilliertem Wasser geben.</li>
	<li>Laden Sie die Mikrokugelaufhängung nacheinander. Wählen Sie im Erfassungsmenü der Summit-Software die Option Start aus, um 20.000 Ereignisse aufzuzeichnen. HINWEIS: Die Anzahl der Ereignisse ist optional. Es werden nicht weniger als 5.000 Ereignisse empfohlen, um die statistische Signifikanz zu erreichen.</li>
	<li>Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das FSC- vs. SSC-Punktdiagramm, um Rechtecke zu erstellen, und ziehen Sie, um die Größe und Positionierung der Bereiche des elektronischen Rauschens und der 100-nm-Mikrosphärenpopulation zu ändern. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Regionen, um sie in R7 bzw. R4 umzubenennen. Wiederholen Sie die obigen Schritte, um die 200-nm- und 300-nm-Mikrokugeln nacheinander mit Rechtecken einzurahmen und sie in R5 bzw. R6 umzubenennen.</li>
	<li>Bestimmen Sie schließlich den Sortierbereich von 50 bis 200 nm basierend auf dem elektronischen Rauschen und der Position von 200 nm-Partikeln, die als R8 definiert sind. HINWEIS: Die untere Nachweisgrenze von 50 nm liegt knapp über dem elektronischen Rauschen des Durchflusszellensortierers. Der Bereich zwischen dem Rauschen und der 200-nm-Mikrosphärenpopulation kann daher als zwischen 50-200 nm definiert werden.</li>
	<li>Bearbeiten Sie Sortierentscheidungen im Bereich Sortierlogik und Statistik. Doppelklicken Sie auf das leere Feld des linken Streams (L1). Wählen Sie den Bereich mit dem Namen R8 aus, um die Sortierlogik zu erstellen. Wählen Sie den Abbruchmodus der Reinheit und wählen Sie eine Tröpfchenhülle von 1 Tropfen für den L1-Stream.</li>
	<li>Laden Sie eine 500-μl-Probe des EV-Gemisches aus Schritt 2.3. Drücken Sie die Start-Taste unter dem Erfassungsmenü in Summit, um Daten zu erfassen, und drücken Sie dann Start im Sortiermenü, um 50-200 nm sEV in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln. HINWEIS: Eine sterile Umgebung ist notwendig, um die Kontamination während eines Verfahrens zu minimieren.</li>
	<li>Beobachten Sie das Vorhandensein von sEV durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und überprüfen Sie die Partikelgröße von sEV mit NTA. Führen Sie eine Western-Blot-Analyse (WB) durch, um die Expression der CD9-, CD63- und CD81-Marker weiter zu bestätigen18.</li>
</ol>

<ol><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+exosomes%2C+microvesicles%2C+and+friends%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li>
<li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+ectosomes+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and ectosomes in intercellular communication.</a> Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).</li>
<li>Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li>
<li>Smith, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+exosome+study+reveals+subpopulations+distributed+among+cell+lines+with+variability+related+to+membrane+content%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533(2015).</li>
<li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li>
<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+extracellular+vesicles%2C+their+origin%2C+composition%2C+purpose%2C+and+methods+for+exosome+isolation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis.</a> Cells. 8 (7), 727(2019).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111(2014).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically-active+exosomes+from+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically-active exosomes from human plasma.</a> Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).</li>
<li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li>
<li>Coughlan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+by+ultracentrifugation+and+precipitation+and+techniques+for+downstream+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses.</a> Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110(2020).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+analysis+of+exosomal+mRNA+mediating+drug+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma.</a> Nature Communications. 6, 6999(2015).</li>
<li>Zarovni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+isolation+and+quantitative+analysis+of+exosome+shuttled+proteins+and+nucleic+acids+using+immunocapture+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches.</a> Methods. 87, 46-58 (2015).</li>
<li>Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+exosomal+isolation+methods%3A+is+size+exclusion+chromatography+the+best+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466(2020).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, 8545347(2018).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).</li>
<li>Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+exosome+proteins+by+on-bead+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry.</a> Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).</li>
<li>Nolan, J. P., Duggan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+individual+extracellular+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).</li>
<li>Nolan, J. P., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+platelet+vesicles+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Detection of platelet vesicles by flow cytometry.</a> Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).</li>
<li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).</li>
<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+strategy+for+jet-in-air+cell+sorting+with+high+purity%2C+yield%2C+viability%2C+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability.</a> FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).</li>
<li>Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+sensitivity+of+the+Ortho+analytical+cytofluorograph+by+modifying+the+fluid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system.</a> Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Isolierung und Aufreinigung von sEV mit der spezifizierten Partikelgröße von 50-200 nm unter Verwendung eines Durchflusszellensortierers, der von NTA validiert wurde. Die Methode löste das Engpassproblem, sEV mit einheitlicher Partikelgröße und hoher Reinheit zu erhalten, und verhinderte Interferenzen durch nicht verwandte biologische Moleküle, die in großformatige EVseingewickelt sind 22. Schnelle Hochdurchsatzanalysen sind mit der Durchflus...

Eine Zelle setzt extrazelluläre Vesikel (EVs) unterschiedlicher Größe frei, die zu Signalmolekülen und Membraneinschlüssen führen, die für die interzelluläre Kommunikation wichtig sind1. EVs unterschiedlicher Größe spielen auch unterschiedliche biologische Rollen, wobei 50-200 nm sEV in der Lage sind, RNA, DNA und Proteine präzise an die richtige extrazelluläre Stelle zu verteilen. Die sEV hilft auch bei der Bestimmung ihrer Sekretionsmechanismen, die nicht nur die Regulierung normaler physiologischer Prozesse wie Immunüberwachung, Stammzellerhaltung, Blutgerinnung und Gewebereparatur umfassen, sondern auch die Pathologie, die verschiedenen Krankheiten wie Tumorprogression und Metastasierung zugrunde liegt 2,3. Eine effektive Isolierung und Analyse von sEV ist entscheidend für die Identifizierung von Biomarkern und die Entwicklung zukünftiger medikamentöser Interventionen.
Mit kontinuierlicher Forschung zur klinischen Anwendung von sEV haben die Isolationsmethoden von sEV höhere Anforderungen gestellt. Aufgrund der Heterogenität von sEV in Größe, Quelle und Gehalt sowie ihrer Ähnlichkeit mit anderen EVs in Bezug auf physikalisch-chemische und biochemische Eigenschaften gibt es keine Standardmethode für die sEV-Isolierung 4,5. Derzeit sind Ultrazentrifugation, Größenausschlusschromatographie (SEC), Polymerfällung und Immunaffinitätserfassung die gebräuchlichsten sEV-Isolationsmethoden6. Die Ultrazentrifugation ist nach wie vor der Goldstandard für die sEV-Isolierung in der Forschung, obwohl sie zeitaufwändig ist, was zu einer geringen Reinheit mit einer breiten Größenverteilung von 40-500 nm und einer signifikanten mechanischen Schädigung des sEV nach Langzeitzentrifugation führt 7,8,9. Die Polymerfällung, bei der üblicherweise Polyethylenglykol (PEG) verwendet wird, weist eine inakzeptable Reinheit für die anschließende Funktionsanalyse mit gleichzeitiger Ausfällung extrazellulärer Proteinaggregate und Polymerkontaminationauf 10,11. Immunaffinitäts-Capture-basierte Methoden erfordern teure Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität sowie Probleme mit geringem Verarbeitungsvolumen und Ausbeuten12,13,14. Die Partikelgröße ist einer der Hauptindikatoren zur Bewertung der Reinheit von isoliertem sEV. Obwohl die Reinheit von sEV nach wie vor ein unerreichbares Ziel ist, entfernt SEC eine beträchtliche Menge an Medienkomponenten, und die mit der SEC-Methode extrahierten sEV-Partikel liegen hauptsächlich im Bereich von 50-200 nm15. Die bestehenden Techniken weisen einige Nachteile auf, darunter Zeitaufwand, geringe Reinheit, geringe Ausbeute, schlechte Reproduzierbarkeit, geringer Probendurchsatz und potenzielle Schädigung von sEV, was sie mit der klinischen Anwendung unvereinbar macht16. Daher ist eine schnelle, kostengünstige und größenspezifische sEV-Isolationsmethode, die auf verschiedene Biofluide anwendbar ist, ein wesentlicher Bedarf in verschiedenen Forschungs- und klinischen Situationen.
In der Durchflusszytometrie werden einzelne Partikel multiparametrisch mit hohem Durchsatz analysiert und Teilmengen aussortiert17. Aufgrund der Heterogenität von EVs wäre eine durchflusszytometrische Einzelpartikelmessung ideal, die zur Untersuchung von EVs nach den Paradigmen der Zellanalyse verwendet wurde, wobei Lichtstreu- und Fluoreszenzmarkierungen verwendet wurden, um physiologische Merkmale und Proteinkomponenten zu identifizieren18,19,20. Nichtsdestotrotz wird die konventionelle Durchflusszytometrie durch die geringe Größe von sEV und die geringe Häufigkeit von Oberflächenbiomarkern herausgefordert. Die Sensitivität der Durchflusszytometrie könnte verbessert werden, indem die Detektionsparameter optimiert werden, um Hintergrundrauschen und sEV zu unterscheiden, unabhängig davon, ob Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) oder Fluoreszenzschwellen-Auslöseparameter19 verwendet werden.
Mit dem vorliegenden Protokoll wurden hochauflösende durchflusszytometrische Sortiereinstellungen unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen als Standard optimiert. Durch die Auswahl der richtigen Düsengröße, des Mantelflüssigkeitsdrucks, des Schwellenwert-Auslöseparameters und der Spannungen, die die Streulichtintensität steuern, konnten wir eine bestimmte Teilmenge von sEV aus einem komplexen Gemisch isolieren.

<table><tbody><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Kulturkolben</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430641</tr><tr><td>Dulbecco" s modifiziertes Eagle-Medium</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>SUER</td><td>SUER050QY</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>Moflo Astrios EQ</td><td></td></tr><tr><td>Humane Pankreaskrebszelle, PANC-1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>PANC-1-Zellen wurden von Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University gespendet</td></tr><tr><td>Laser-Partikelgröße und Zetapotenzial Analysator&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS 90</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>C20012500BT</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Beckman Coulter</td><td>6602336</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskopie</td><td>JEOL</td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Gibco</td><td>1713949</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Regenbogen-Fluoreszenzpartikel</td><td>Beckman Coulter</td><td>B28479</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima-L80XP</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW32TI</td><td></td></tr></tbody></table>

optimierung der durchflusszytometrischen sortierparameter für die hochdurchsatzisolierung und aufreinigung kleiner extrazellulärer vesikel

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV) können aus allen Zelltypen freigesetzt werden und Proteine, DNA und RNA tragen. Signalmoleküle dienen als Indikatoren für den physiologischen und pathologischen Zustand einer Zelle. Es gibt jedoch keine Standardmethode für die sEV-Isolierung, die nachgeschaltete Biomarker-Identifizierungs- und Arzneimittelinterventionsstudien verhindert. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Reinigung von 50-200 nm sEV durch einen Durchflusszellensortierer zur Verfügung. Zu diesem Zweck wurden eine 50-μm-Düse und ein Mantelflüssigkeitsdruck von 80 psi gewählt, um eine gute Sortierrate und einen stabilen Seitenstrom zu erzielen. Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße wurden verwendet, um Populationen von 100-, 200- und 300-nm-Partikeln zu lokalisieren. Durch eine zusätzliche Optimierung der Auslöseschwelle für Spannung, Verstärkung und Vorwärtsstreuung (FSC) konnte das sEV-Signal vom Hintergrundrauschen getrennt werden. Diese Optimierungen bieten einen Bereich kritischer Sortiereinstellungen, der es ermöglicht, eine repräsentative Population von sEV nur mit FSC vs. Side Scatter (SSC) zu erhalten. Die auf Durchflusszytometrie basierende Isolationsmethode ermöglicht nicht nur eine Hochdurchsatzanalyse, sondern auch eine synchrone Klassifizierung oder Proteomanalyse von sEV basierend auf der Biomarkerexpression, was zahlreiche nachgelagerte Forschungsanwendungen eröffnet.

Das Flussdiagramm für das experimentelle Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Bei diesem Verfahren wurden Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße als Referenzstandards für die Partikelgrößenverteilung verwendet. Unter der spezifischen instrumentellen Parameterbedingung konnte das Partikelsignal mit Hilfe der logarithmischen Form klar vom Hintergrundrauschen im FSC- vs. SSC-Diagramm unterschieden werden. Gating-Strategien sind in Abbildung 2 dargestellt. R4,...

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Isolationsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel, indem die Größe der Luftsprühdüse, der Mantelflüssigkeitsdruck, der Probenflussdruck, die Spannung, die Verstärkung und die Auslöseschwellenparameter optimiert werden.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und größenspezifische Lösungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel durch Optimierung der Sortierparameter der Durchflusszytometrie. Diese Optimierungen bieten eine Reihe kritischer Sortiereinstellungen, die es ermöglichen, repräsentative Populationen kleiner extrazellulärer Vesikel nur mit Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Größenstreuung zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Standard-Startvorgang des Durchflusszellensortierers.Schalten Sie das Gerät ein, indem Sie die Starttaste drücken, und klicken Sie dann auf die Laser-Power-Taste auf dem Laser-Bedienfeld. Drücken Sie die Taste zum Wechseln der Tanks im Untermenü Smart Sampler, um die Fluidik unter Druck zu setzen. Verwenden Sie einen ultraschallgereinigten 50-Mikrometer-Strahl und eine Luftdüse und installieren Sie sie bis zur Düsenanordnung.Stellen Sie den Druck auf 80 SI für die Mantelflüssigkeit und 80,3 SI für den Probenfluss an der Druckkonsole ein. Drücken Sie die Taste zum Starten des Mantelflusses, um den Mantelstrom zu starten. Klicken Sie im Untermenü Smart Sampler auf die Blasenschaltfläche, um die Blase automatisch für 10 Minuten zu entblasen und dann auszuschalten.Um den Strahl auszurichten und den Laserspot zu bestimmen, schalten Sie das Licht der Beleuchtungskammer ein, um den Strahl über die Nadellöcher zu sehen. Stellen Sie die Mikrometer nach oben und unten, links und rechts sowie vorne und hinten ein, um den Stream auf der Lochblende zu zentrieren und den Stream zu fokussieren. Öffnen Sie alle Laserverschlüsse, wählen Sie die Registerkarte Laser- und Stream-Intercept aus und drücken Sie dann kontinuierlich die grüne Pfeiltaste, um den Kalibrierungsprozess für den Laserabfang und die Düsenausrichtung abzuschließen.Greifen Sie auf den Bildschirm für die Feinlaserausrichtung zu. Wählen Sie den 640-Nanometer-Laser und den 772-bar-44-Bandpasskanal als Parameter für die x-Achse und den 405-Nanometer-Laser und den 448-bar-59-Bandpasskanal als Parameter für die y-Achse. Drücken Sie den Triggerparameter-Selektor und wählen Sie den Vorwärtsstreuparameter des 488-Nanometer-Lasers.Als nächstes verdünnen Sie die regenbogenfluoreszierenden Partikel, indem Sie einen Tropfen in einen Milliliter doppelt destilliertes Wasser bis zu einer Endkonzentration von eins mal 10 bis zu den sechsten Kügelchen pro Milliliter geben. Öffnen Sie die Tür der Probenkammer und laden Sie ein Röhrchen mit vorbereiteten fluoreszierenden Regenbogenpartikeln. Drücken Sie die Starttaste und passen Sie die Mikrometer nach oben und unten an, um die Fluoreszenzintensität zu optimieren und jedes Signal so intensiv wie möglich zu machen.Drücken Sie die Taste "Qualitätskontrolle starten" oder "QC" auf dem Touchscreen-Bedienfeld, um die Qualitätskontrolle automatisch durchzuführen. Drücken Sie dann die IntelliSort-Initialisierungstaste. Das Gerät passt automatisch die Frequenz und Amplitude der Tröpfchenschwingung an, um die Fallverzögerung von ca. 25 zu erhalten und den Abbruchpunkt des Tropfens klar zu visualisieren.Drücken Sie als Nächstes die Drop-Delay-Taste und die Maintain-Taste. Wählen Sie Tube als Sortierausgabetyp aus. Legen Sie einen 15-Milliliter-Röhrchenhalter in die Sortierkammer.Schalten Sie die Plattenspannung ein und stellen Sie die Plattenspannung auf ca. 4.000 Volt ein. Schalten Sie als Nächstes das Testmuster ein, indem Sie auf die Schaltfläche Stream-Setup klicken. Stellen Sie den Schieberegler für die Ladephase und den Schieberegler für die Ablenkung ein, um sicherzustellen, dass das Bild des Stroms mit dem Sammelrohr übereinstimmt.Wählen Sie dann die Schaltfläche mit dem Häkchen aus. Melden Sie sich bei der Summit-Workstation auf dem Computer an. Erstellen Sie ein neues Protokoll aus dem Hauptmenü der Datei.Erstellen Sie dann ein Punktdiagramm, indem Sie die Registerkarte Histogramm in der Systemsteuerung der Summit-Software auswählen. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Parameter für die x-Achse und Seitenstreuung als Parameter für die y-Achse. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die Achse des neuen Punktdiagramms im Arbeitsbereich und stellen Sie die Vorwärtsstreuung und die Seitenstreuung in logarithmischer Form dar.Wählen Sie die Registerkarte "Erfassung" und suchen Sie den Bereich "Erfassungsparameter". Aktivieren Sie alle Signale im Untermenü der Parameter aktivieren. Wählen Sie Vorwärtsstreuung als Auslöseparameter und legen Sie den Schwellenwert auf 0,01 fest.Stellen Sie die Spannung und Verstärkung der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung auf 250 und 0,6 ein, um sicherzustellen, dass Ereignisse innerhalb des Vorwärtsstreudiagramms und der Seitenstreuung getrennt sind. Verdünnen Sie die fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokugeln in 100-, 200- und 300-Nanometer-Suspensionen, indem Sie einen Mikroliter Mikrokugeln zu einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser hinzufügen. Laden Sie dann die Mikrokugelaufhängung nacheinander.Wählen Sie im Erfassungsmenü von Summit Software die Option Start aus, um 20.000 Ereignisse aufzuzeichnen, und klicken Sie dann nach der Aufzeichnung der Ereignisse auf Stopp. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Diagramm des Vorwärtsstreu- und Seitenstreupunkts, um Rechtecke zu erstellen, und ziehen Sie, um die Größe zu ändern. Positionieren Sie die Bereiche des elektronischen Rauschens und der 100-Nanometer-Mikrosphärenpopulation neu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Regionen klicken, um sie in R7 bzw. R4 umzubenennen.Wiederholen Sie die Schritte, um die 200- und 300-Nanometer-Mikrokugeln nacheinander mit Rechtecken einzurahmen, und benennen Sie sie in R5 bzw. R6 um. Bestimmen Sie schließlich den Sortierbereich von 50 bis 200 Nanometern basierend auf dem elektronischen Rauschen und der Position von 200-Nanometer-Partikeln, um ihn als R8 zu definieren. Bearbeiten Sie Sortierentscheidungen im Bereich Sortierlogik und Statistik, indem Sie auf das leere Feld des linken oder L1-Streams doppelklicken und den Bereich mit dem Namen R8 auswählen, um die Sortierlogik zu erstellen. Wählen Sie den Abbruchmodus der Reinheit und wählen Sie eine Tröpfchenhülle über einem Tropfen für den L1-Stream.Laden Sie eine 500-Mikroliter-Probe einer zuvor hergestellten extrazellulären Vesikel oder EVs-Mischung. Drücken Sie die Schaltfläche Start unter dem Erfassungsmenü in Summit, um die Daten zu erfassen, und klicken Sie dann auf Stopp. Drücken Sie anschließend im Sortiermenü auf Start, um 50 bis 200 Nanometer große kleine extrazelluläre Vesikel oder sEV in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.Die durchflusszytometrische Analyse von Polystyrol-Mikrokugeln in Standardgröße, um den Größenbereich von 50 bis 200 Nanometern im Vorwärtsstreu- und Seitenstreudiagramm zu lokalisieren, ergab unterscheidbare Partikelsignale. R4, R5 und R6 beziehen sich auf die Positionen von 100-, 200- bzw. 300-Nanometer-Partikeln. R7 ist das elektronische Rauschen als Nachweisgrenze für 50-Nanometer-Partikel und R8 steht für den Positionsbereich von 50 bis 200 Nanometer-Partikeln.Die Partikelgrößenverteilung der EVs-Mischung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) aus Pankreas-One-Zellen gewonnen wurde, lag nach der Ultrazentrifugation im weiten Bereich von 40 bis 400 Nanometern. Eine durchflusszytometrische Sortierung wurde durchgeführt, um die 50 bis 200 Nanometer sEV innerhalb der R8-Region zu isolieren und zu reinigen. Die Qualität der Isolierung wurde von NTA verifiziert und es wurde festgestellt, dass der Partikelgrößenbereich von sEV nach der Sortierung zwischen 50 und 200 Nanometern lag.Das Vorhandensein von sEV wurde weiter durch TEM beobachtet und die isolierten sEVs wurden durch Western-Blot-Analyse bestätigt, dass sie Marker von CD6, CD63 und CD81 enthielten. Diese Methode ermöglicht die Trennung kleiner extrazellulärer Vesikel und die Klassifizierung oder Analyse der Genexpression kleiner extrazellulärer Vesikel, was zahlreiche nachgeschaltete Forschungsanwendungen eröffnet.

optimization-flow-cytometric-sorting-parameters-for-high-throughput

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video demonstriert die auf Dichtegradienten-Ultrazentrifugation basierende Aufreinigungsmethode zur Isolierung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel, die für Charakterisierungsstudien geeignet sind.

Reinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel: Eine Technik zur Aufreinigung von Subpopulationen extrazellulärer Vesikel mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation

In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die durchflusszytometrische Sortierung von naiven B-Zell-, Gedächtnis-B-Zell- und Plasmablasten-Plasmazell-Subpopulationen aus menschlichen peripheren Blut-B-Zellen. Die verschiedenen B-Zell-Subpopulationen können anhand einer Fluorophor-basierten Antikörperbindung an die CD19-, CD27- und CD38-Rezeptoren unterschieden werden, die auf den B-Zell-Oberflächen exprimiert wird, gefolgt von einer Zellsortierung.

Durchflusszytometrische Zellsortierung für verschiedene zirkulatorische B-Zellpopulationen

Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Dieses Protokoll isoliert extrazelluläre Vesikel (EVs) von Virionen mit hoher Effizienz und Ausbeute, indem EV-Fällung, Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Partikelerfassung integriert werden, um einen optimierten Workflow und eine Reduzierung des Startens zu ermöglichen. Mengenanforderungen, die zu reproduzierbaren Präparaten für den Einsatz in allen EV-Forschungen führen.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Extrazelluläre Vesikel sind für biomedizinische Anwendungen sehr vielversprechend, aber die derzeitigen Isolierungsmethoden sind zeitaufwändig und für den klinischen Einsatz unpraktisch. In dieser Studie stellen wir ein mikrofluidisches Gerät vor, das die direkte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großen Mengen von Bioflüssigkeiten in einer kontinuierlichen Weise mit minimalen Schritten ermöglicht.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Ein Protokoll für die Produktion, Reinigung und Verwendung von enzymverpackten äußeren Membranvesikeln (OMV), das eine verbesserte Enzymstabilität für den Einsatz in verschiedenen Anwendungen bietet, wird vorgestellt.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

Lernen Sie die Optimierung der Durchflusszytometriesortierung zur schnellen Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel. Diese Methode ermöglicht präzise Größenseparation für Zellbiologie-Studien.

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel (Video) | JoVE Journal

Optimierung der durchflusszytometrischen Sortierparameter für die Hochdurchsatzisolierung und Aufreinigung kleiner extrazellulärer Vesikel

Weitere Videos entdecken