Name: 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 hiPSC 유래 심장 스페로이드 생성 및 고처리량 스크리닝 방법을. 냉동보존 기술로 장기 저장이 가능하며 약물 발굴과 질병 모델링에 활용됩니다.

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심장 약물 발견은 판독을 정확하게 수행하기 위해 부적절한 처리량과 생리학적 충실도를 가진 비인간 동물 및 세포 모델에 의존하기 때문에 방해를 받습니다. HT 기기 및 생리학적 프로브와 결합된 hiPSC-CM 생물학은 심장 질환 모델링 및 약물 발견의 초기 단계에 인간 모델을 다시 도입할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 최적의 심장질환 모델링 및 약물 스크리닝 플랫폼을 위해 고품질의 기능성 CS를 생산하는 3D 심장조직 생성 방법을 개발했습니다. 또한 산업용 EV 생산을 위한 3D 바이오리액터 시스템에 스페로이드 기술을 결합하면 EV 기반 요법의 임상 번역에 필요한 단계를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 몇 가지 중요한 요소에 의존하며 기존 프로토콜 9,10,28,29의 변형입니다. 이러한 방법에는 1) 3D 조직 구조의 생성, 2) 스크리닝 전 최적의 세포 수 및 타이밍, 3) 기기의 감도 및 고처리량 용량 개선, 4) 기능 분석 전에 스페로이드를 동결할 수 있는 능력이 포함됩니다. 이전에 설명된 프로토콜과 달리 제안된 프로토콜은 하루에 최대 1,500개의 스페로이드 생성과 HTS에 대한 적합성을 설명합니다. 기존의 96웰 칼슘 이미징 시스템 또는 24웰 다중으로 조작된 심장 조직을 사용하여 10회 반복에 대해 6 x 0.5 로그 용량 이상의 100개 화합물에 대한 기존의 분석에는 약 5억 개에서 30억 개의 hiPSC-CM이 필요합니다31,32. 제안된 응용 프로그램은 96웰 플레이트가 설명된 방법에 비해 파종 밀도의 10%만 필요하기 때문에 기존 시스템에 비해 심장 검진을 덜 비싸고 시간 효율적으로 만듭니다. 더욱이, 행잉-드롭 방법과 같은 이전의 프로토콜과 비교하여, 초저 부착 플레이트에서 자가 응집에 의한 스페로이드의 생성은 단일 미세조직(33)의 고품질 자동 이미징을 가능하게 한다.
이 작은 3D 모델은 생체 내 심혈관 환경의 생물학적 및 생리학적 표현형을 모방합니다. 이전에 입증된 바와 같이, 칼슘 과도현상은 2D 단층 세포 배양물과 비교하여 3D 심장 조직 구성물에서 극적으로 증가한다34.
다음으로, 파종 밀도와 적절한 배양 시간도 성공적인 CS 스크리닝을 위한 중요한 요소임을 발견했습니다. 스페로이드당 10K-20K hiPSC-CM의 밀도와 생성 후 2-3주 사이의 스크리닝이 최적인 반면, 너무 작거나 너무 오래된 스페로이드는 칼슘 취급 장애를 나타냅니다(그림 2 및 그림 3). 따라서 크기가 기능적 매개 변수에 영향을 미치기 때문에 파종 밀도를 가능한 한 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 이 광학 방법은 전체 조직으로서 살아있는 3D 배양에 대해 좋은 결과를 제공하지만, 시간이 많이 소요되는 조직학 방법에 의존하지 않고는 (하위)세포 수준에서 더 큰 스페로이드 내에서 데이터를 얻는 것이 어렵습니다. 최근에는 마커의 단일 세포 정량화 기회와 함께 전체 3D 스페로이드를 획득할 수 있는 "광학 투명화"를 사용하는 몇 가지 접근 방식이 발표되었습니다. 여기에서 우리는 CS 수확에서 이미지 분석에 이르기까지 3일 프로토콜을 적용했으며, 이는 컨포칼 현미경29 (그림 1C 및 그림 4D)를 사용하여 3D 이미징에 최적화되었습니다.
마지막으로, 3D 심장 조직 응용 분야 및 상업적 응용 분야가 증가함에 따라 다양한 기증자의 장기 보관 및 환자 맞춤형 바이오뱅킹에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 냉동 보존은 시간이 지남에 따라 여러 배치에서 HTS 플레이트를 생성하는 효과적인 전략입니다. hiPSC-CMs의 동결은 이전에 기술된 바와 같이, 다른 배양된 세포 유형과 비교하여 상이하지 않다 10,35,36. 최근에, 2D 셀로 플레이트를 동결시키는 접근법이 기술되었다37. 여기에서 우리는 PSC 동결 보존 키트가 다른 세 가지에 비해 가장 최적의 조건임을 발견했으며(데이터는 표시되지 않음) 스페로이드의 효율적인 동결을 위해 이 배지를 사용했습니다. 냉동 보존 후에도 생존력은 높게 유지되지만(그림 4B,C) CS의 전기생리학적 특성이 영향을 받고 해동 후 배양 기간이 필요합니다. 실제로, 해동 후 1주일 후에 CS는 자발적인 박동 활동과 칼슘 처리를 나타냈습니다. 그러나, 신선하고 회수된 hiPSC-CM이 항상 동일한 분자 및 생리학적 특성을 나타내는 것은 아니라는 것이 기술되어 있다38. 이 제한은 냉동 보존된 hiPSC-CM이 약물 유발 심장 판독값을 평가하는 데 사용될 때 고려되어야 합니다. 또한, 스페로이드 당 세포 수와 칼슘 과도 이미징의 최적 타이밍을 효과적으로 조절하지만, hiPSC 유래 심근 세포 세포를 내피 세포, 섬유 아세포, 세포 간 접합 및 키토산, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 매트리겔 또는 라미닌과 같은 세포 외 매트릭스와 혼합하여 생체 내 심장 환경을 모방함으로써 심장 스페로이드를 개선 할 수 있습니다39, 40. 전반적으로, 우리는 질병 모델링 및 HT 약물 스크리닝과 같은 다운스트림 애플리케이션에 적합한 CS를 효율적으로 생성하기 위한 단계별 프로토콜을 제안합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)의 발견은 세포 수준에서 인간 발달과 질병을 연구할 수 있는 전례 없는 기회를 제공했습니다. 지난 10년 동안 발달 수업을 사용하여 hiPSC를 심근 세포(CM)로 효율적으로 분화하기 위한 다양한 프로토콜이 수립되었습니다1,2,3,4. hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMs)는 유전 적으로 유전 가능한 심혈관 질환 (CVD)을 모델링하고, 신약에 대한 심장 안전성을 테스트하고, 심장 재생 전략을 수립하기위한 자원으로 사용될 수 있습니다 5,6,7,8. hiPSC의 유도된 심장 분화에도 불구하고, 성숙한 hiPSC-CM은 일반적으로 증식하지 않고 일차 인간 세포는 대량으로 사용할 수 없기 때문에 불명확한 CM 수는 심장 분야에서 여전히 도전 과제로 남아 있습니다.
최근에, 우리는 낮은 세포 밀도 배양과 수반되는 Wnt 신호 전달 활성화가 hiPSC-CM 9,10의 대규모 증식 반응(최대 250배)을 초래한다고 설명했습니다. 배양 플라스크 형식의 직렬 패시징을 통해 hiPSC-CM의 대규모 확장을 위한 이 비용 효율적인 전략은 많은 수의 기능성 hiPSC-CM의 표준화 및 품질 관리를 용이하게 합니다. 또한, 다양한 기증자로부터 대량의 hiPSC-CM에 대한 수요를 따라잡기 위해 hiPSC-CM의 바이오뱅킹에 대해 설명했습니다10. 그러나 이러한 표준 배양 접시에 파종된 심근 세포 단층은 심장에 존재하는 복잡한 3D 구조를 대표하지 않습니다. 더욱이, hiPSC-CM의 미성숙은 여전히 장애물로 남아 있어 생체 내 심혈관 환경의 생물학적 및 생리학적 표현형을 모방하는 데 부족합니다.
hiPSC-CM이 자기 조직화 11,12, 세포외 기질(ECM) 리모델링 13, 향상된 성숙 14,15,16 및 동기화된 수축17,18,19과 같은 더 가까운 생리적 행동을 보여주는 새로운 3D 시험관 내 모델이 개발되었습니다 . 3D 모델은 약물 발견, 약물 심장 독성 테스트, 질병 모델링, 재생 요법 및 첫 번째 임상 시험 20,21,22,23,24에도 활용되었습니다. 가장 많이 사용되는 모델 중 하나는 피브린 기반 조작 심장 조직(EHT)으로, 조직과 같은 배열과 심장 수축성을 나타냅니다13,17,25. 이전에 우리는 확장된 hiPSC-CM에서 생성된 EHT가 확장되지 않은 hiPSC-CM에서 생성된 EHT와 유사한 수축성을 나타내어 확장9 후에도 손상되지 않은 세포 기능을 입증했음을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고 hiPSC-CM에서 EHT 생성이 잘 확립되어 있음에도 불구하고 HT 평가 플랫폼 구축과 관련하여 추가 개발이 예상됩니다. 여기에서 96웰 형식의 많은 수의 자가 응집 심장 스페로이드(CS)를 빠르게 생성하면 고처리량 스크리닝(HTS) 목적을 위한 3D 조건을 개선할 수 있습니다.
전반적으로 3D 세포 배양으로서 CS의 장점은 높은 재현성과 확장성입니다. 특히, 로봇 시료 처리와 결합된 CS는 CS 배양, 약물 처리 및 고함량 분석(high-content analysis)을 표준화하고 자동화할 수 있다(20). 여기에서는 광학 칼슘 획득 및 분석 시스템을 사용하여Ca2+ 과도 측정을 수행하여 심장 기능을 효율적으로 냉동 보존하고 스크리닝할 수 있는 고순도 및 고품질 CS를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 수백에서 수천 개의 스페로이드17,18에 대해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있는 간단하면서도 강력한 도구를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>24 웰 서스페니언 플레이트&nbsp;</td><td>코닝&nbsp;</td><td>3738</td><td></td></tr><tr><td>96웰 초저 어태치먼트 다중 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Actinin (Sarcomeric) 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td>희석: 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Cardiac Troponin T 항체 (ab45932)</td><td>Abcam</td><td>ab45932</td><td>희석: 1:200</td></tr><tr><td>아스코르브산&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 분획 V (BSA)</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520, AM&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab171868</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td>디미8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 소프트웨어&nbsp;</td><td>라이카&nbsp;</td><td>Las X</td><td></td></tr><tr><td>Conical 튜브 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>크레아틴 일수화물&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>C3630</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td>농도: 1 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM 포도당 없음&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>과당&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>붐</td><td>76050771.05</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>희석: 1:500</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11011</td><td>희석: 1:500</td></tr><tr><td>수평 셰이커</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>인간 유도 만능 줄기 세포주</td><td>(Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank)</td><td>CVI-273 (대조군 1)</td><td></td></tr><tr><td>인간 유도 만능 줄기 세포주</td><td>독일&nbsp;</td><td>141 (대조군 2) 144 (대조군 3)</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)&nbsp;</td><td>Ajax Firechem</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10 M 원료 용액, 부식성</td></tr><tr><td>이소타입 제어, FITC 마우스 IgM &kappa; 이소타입</td><td>BD</td><td>556652</td><td></td></tr><tr><td>녹아웃 세럼 교체&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>L-카르니틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Myocyte 칼슘 및 수축 시스템</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Thunder, DMi8</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 (NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 용액 4% in 1x PBS, pH 7.0&ndash; 7.6</td><td>Santa Cruz</td><td>SC281692</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PES 멤브레인 진공 필터 시스템</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>431097</tr><tr><td>PI/RNase 염색 용액</td><td>Invitrogen</td><td>F10797</td><td>희석: 1:1000</td></tr><tr><td>Pluronic&nbsp; F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>PSC 동결 보존 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644601</td><td></td></tr><tr><td>RevitaCell</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2644501</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머 키트</td><td>SYLGARD</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트 용액 (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>소듐 L-락테이</td>트 <td>Sigma-Aldrich</td><td>71718</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tris Fisher&nbsp;</td><td>과학적&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11486631 Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100-1L</td><td>위험한</td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>요소&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>비타민 B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드 (Rho-kinase 억제제)</td><td>Tocris&nbsp;</td><td>1254</td><td>빛으로부터 보호</td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 인간 심장 질환 모델링 및 치료에 가장 중요합니다. 우리는 최근 2차원(2D)에서 hiPSC-CM의 대규모 확장을 위한 비용 효율적인 전략을 발표했습니다. 두 가지 주요 한계는 세포 미성숙과 고처리량 스크리닝(HTS) 플랫폼의 3차원(3D) 배열 및 확장성 부족입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 확장된 심근 세포는 3D 심장 세포 배양 및 조직 공학 기술의 생성을 위한 이상적인 세포 공급원을 형성합니다. 후자는 심혈관 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있으며 보다 발전되고 생리학적으로 관련된 HTS를 제공합니다. 여기에서는 96웰 형식의 심장 스페로이드(CS)의 생성, 유지 관리 및 광학 분석을 위해 쉽게 확장할 수 있는 HTS 호환 워크플로우에 대해 설명합니다. 이러한 소형 CS는 현재 체외 질환 모델 및/또는 3D 조직 공학 플랫폼용 생성에 존재하는 격차를 메우는 데 필수적입니다. CS는 고도로 구조화된 형태, 크기 및 세포 구성을 나타냅니다. 또한, CS로 배양된 hiPSC-CM은 성숙도가 증가하고 자발적인 칼슘 처리 및 수축 활동과 같은 인간 심장의 여러 기능적 특징을 나타냅니다. CS 생성에서 기능 분석에 이르기까지 전체 워크플로우를 자동화함으로써 고처리량(HT) 이미징 및 칼슘 처리 분석에서 입증된 바와 같이 배치 내 및 배치 간 재현성을 높입니다. 설명된 프로토콜을 통해 완전 자동화된 HTS 워크플로우에서 복잡한 3D 세포 환경 내에서 단일 세포 수준에서 심장 질환을 모델링하고 약물/치료 효과를 평가할 수 있습니다. 또한, 이 연구는 전체 스페로이드의 장기 보존 및 바이오뱅킹을 위한 간단한 절차를 설명하여 연구자들에게 차세대 기능성 조직 저장소를 만들 수 있는 기회를 제공합니다. 장기 보관과 결합된 HTS는 약물 발견 및 테스트, 재생 의학, 개인화된 치료법 개발을 포함한 광범위한 분야의 중개 연구에 크게 기여할 것입니다.

그림 1A에 표시된 프로토콜은 이전에 확장된 hiPSC-CM에서 CS를 생성하는 방법을 설명합니다. CS는 초저 부착 둥근 바닥 플레이트에서 파종 후 1일까지 3D 구조를 획득하고 최대 6주 동안 배양할 수 있습니다(그림 1B). 면역형광 염색에 의해 평가된 바와 같이, 3주령 CS의 세포 대부분은 α-액티닌 및 트로포닌 T와 같은 육종 단백질을 발현하고 규칙적인 육종 조직을 나타냈습니다(그림 1C). α-actinin 양성 세포의 정량화를 위해 유세포 분석을 수행하였다. 면역형광 결과에 따라, 유세포 분석 데이터는 0일째(76.9% ± 16.6%) 및 3주령 CS(71.1% ± 22.7%) 모두에서 비교할 수 있는 높은 수준의 α-악티닌을 입증했으며(그림 1D), 이는 배양 동안 일정하고 매우 순수한 세포 조성을 나타냅니다. 90일 동안 2D에서 배양된 hiPSC-CM에 비해 hiPSC-CM 유래 스페로이드(42일)에서 접합부(GJA1, JPH2 및 PKP2), 데스모솜(DES) 및 미토콘드리아(ATP5A)에 대한 심장 유전자의 발현이 증가했습니다(그림 1E). 이들 유전자의 발현은 세포-세포 상호작용 및 성숙의 특징이다30.
그 후, CS의 기능적 특성, 즉 박동률 및Ca2+ 핸들링을 서로 다른 시점에서 평가하였다(그림 2). 상승 시간, 피크 시간, 붕괴 시간 및 칼슘 과도 기간(CTD90)과 같은 칼슘 과도 매개변수는 그림 2A, B에 표시된 대로 평가되었습니다. CS를 이기는 비율은 생성 후 처음 3주 동안은 비슷하지만 6주차(Wk6) CS에서는 크게 감소했습니다(그림 2C). 구타율은 Wk1에 비해 Wk3에서 유의하게 감소했으며, CS를 구타하는 비율과 유사하게 Wk6에서 극적으로 감소했습니다(그림 2D). Wk6에서 CS 열화가 관찰되었으며, 이는 박동률과 박동 CS의 수 모두의 감소를 설명할 수 있습니다. 칼슘 과도 매개변수의 측정은 Wk2에서 유의하게 더 높은 피크 값을 나타내었고(그림 2E), 상승 시간, 감쇠 시간 및 CTD90은 Wk1에 비해 Wk3에서 유의하게 증가했습니다(그림 2F-H ). 종합하면, 이러한 결과는 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 생성 후 약 2주 및 3주차에 기능적으로 최적임을 보여줍니다.
그림 3은 박동 속도와 칼슘 처리에 대한 스페로이드 크기의 영향을 보여줍니다. CS는 조건당 총 24개의 CS/웰에 대해 96웰 플레이트의 웰에서 2.5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 104 및 20 x 104 hiPSC-CM을 시딩하여 생성되었습니다(그림 3A). 예상대로 사용된 셀 수가 증가함에 따라 스페로이드 크기가 증가하여 178 ± 36 μm에서 351 ± 65 μm까지 다양했습니다(그림 3A, 오른쪽 패널). Ca2+ 과도 현상은 4개의 상이한 파종 밀도에서 3주령 CS에서 측정되었다(도 3B). 박동하는 CS를 측정한 결과, 더 작은 크기의 CS(2.5K 및 5K-CS)의 약 50%만이 박동하는 반면, 더 큰 크기의 CS(10K 및 20K-CS)의 비율은 훨씬 더 높았습니다(약 85%)(그림 3C). 5K, 10K, 20K-CS에서도 유사한 박동률(약 28bpm)이 나타났으며, 이는 2.5K-CS에 비해 훨씬 높았습니다(그림 3D). 칼슘 이미지의 피크 값은 모든 테스트 조건에서 유사했지만(그림 3E), 상승 시간(그림 3F), 붕괴 시간(그림 3G) 및 CTD90(그림 3H)은 더 작은 크기(10K- 및 20K-CS)에 비해 더 큰 크기-CS(2.5K- 및 5K-CS)에서 유의하게 증가했습니다. 종합하면, 이러한 결과는 10K와 20K hiPSC-CM/웰 사이의 파종 밀도를 사용할 때 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 칼슘 취급 스크리닝에 최적임을 보여줍니다.
다음으로 냉동보존이 CS의 생존력과 기능에 미치는 영향을 평가했습니다. 분석 전에, 해동된 CS를 1주일 동안 배양물에서 유지하였다(도 4A). 유세포 분석(도 4B) 및 Calcein-AM(도 4C) 세포 생존율 검정 모두에 의해 나타난 바와 같이, 냉동보존은 CSs 내의 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다. 또한, 해동된 CS는 신선한 연령 일치 CS와 비교하여 유사한 육종 단백질의 발현 수준을 나타내었다(도 4D). 이러한 데이터는 CS가 후속 심장 기능 분석 및 고처리량 스크리닝을 위해 효율적으로 냉동 보존될 수 있음을 나타냅니다.
마지막으로, 박동 활성 및Ca2+ 취급은 신선 및 냉동보존된 CS 모두에서 측정되었다(도 5). CS를 박동하는 비율은 해동 후 각각 2일, 5일 및 7일에 다른 시점에서 측정되었습니다. 대부분의 신선한 CS는 시간이 지남에 따라 박동 활성을 보였지만, 냉동 보존된 CS는 박동 활성을 회복하기 위해 최대 1주일의 배양이 필요했습니다(그림 5B). 해동된 CS와 신선한 CS의 박동률에는 큰 변화가 없었습니다. 그러나 일부 냉동 CS에서는 자발적인 구타 활동이 관찰되지 않았습니다(그림 5C). 신선 CS에 비해 냉동/해동 CS에서 피크 값이 유의하게 감소했지만(그림 5D), 신선 CS와 비교하여 상승 시간, 감쇠 시간 및 냉동/해동 CS의 CTD90에서 유의한 변화가 관찰되지 않았습니다(그림 5E-G). 이러한 데이터는 해동 후 CS가 최소 1주일 동안 인큐베이터에서 회복되도록 하는 것이 중요하다는 것을 나타내며, 그 전에 박동 활동 및 일시적인Ca2+를 측정합니다.
종합하면, 이러한 결과는 hiPSC-CM 유래 스페로이드의 냉동 보존이 심근 세포 생존력, 육종 구조 및 자발적인 박동 활동 및 칼슘 취급과 같은 기능적 특성을 보존한다는 것을 보여줍니다. 따라서 hiPSC-CM 유래 스페로이드는 시험관 내에서 심장 전기생리학을 정확하게 요약하는 데 적합한 모델을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig01.jpg"> 그림 1: 심장 스페로이드 생성. (A) Wnt 기반 지시 심장 분화, hiPSC-CM의 후속 확장 및 C 생성의 개략도. biorender.com 로 만들어졌습니다. (B) CS 배양의 다른 시점에서의 명시야 이미지. 스케일 바, 200 μm. Wk는 주를 나타냅니다. (C) 3주 된 CS에서 심장 육종 단백질α-액티닌 및 트로포닌 T에 대한 대표적인 면역형광 이미지. 면역형광: Hoechst(파란색), α-액티닌(녹색) 및 트로포닌 T(빨간색). 스케일 바, 200 μm. 오른쪽의 확대된 병합 그림은 sarcomere 조직을 표시합니다. 스케일 바, 50 μm. (D) CSs 형성 전(0일) 및 3주 후 α-액티닌 양성 세포의 유세포 분석 정량화(조건당 n = 14-23. (E) 90일 동안 배양된 hiPSC-CM에 대해 RT-qPCR(2D)을 수행하고 42일 동안 배양된 스페로이드 샘플에서 수행하여 세포 접합부, 중간 필라멘트 및 미토콘드리아와 관련된 다양한 심장 유전자의 발현 수준을 확립합니다. (n = 1-3 배치). 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. NS(유의하지 않음)는 짝을 이루지 않은 t-검정에 의해 계산됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig02.jpg"> 그림 2: 생성 후 다른 주에 CS의 박동률 및 칼슘 처리. (A) Cyteseer Software의 Vala sciences 분석 알고리즘에 의해 계산된 칼슘 과도 파라미터의 예. (B) 생성 후 다른 시점(주)에서 CS의 대표적인 칼슘 과도 흔적 및 타임랩스 이미지. 스케일 바, 200 μm. (C) 자발적 박동 활동의 시간 경과 정량화는 구타 CS의 백분율로 표현됩니다. (D) 배양 시간 동안 CS의 박동 속도. (E-H) 피크 값, 상승 시간, 붕괴 시간 및 CTD90을 보여주는 칼슘 과도 현상의 정량화. 표시된 데이터는 평균 ± SD입니다. 생물학적 복제 = 3, 기술 복제 = 각각 38, 50, 66 및 7. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어; CTD = 칼슘 과도 기간, Wk = 주, CSs = 인간 심장 스페로이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig03.jpg"> 그림 3: 서로 다른 세포 파종 밀도를 사용하여 생성된 CS의 박동률 및 칼슘 처리. (A) 서로 다른 수의 hiPSC-CM을 사용하여 생성된 CS의 명시야 이미징(왼쪽) 및 크기 측정(오른쪽). 스케일 바, 200 μm. (B) 2.5K-20K-CS의 대표적인 칼슘 과도 추적 및 타임랩스 이미지. (씨, 디) 2.5K-20K-CS의 박동 비율 및 박동 비율. (E-H) 2.5K-20K-CS의 피크 값, 상승 시간, 감쇠 시간 및 CTD90. 데이터는 평균± SD입니다. 생물학적 복제 = 3, 기술 복제 = 28-39. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어: CTD = 칼슘 과도 기간, Wk = 주, k = x 1,000개 세포, CS = 심장 스페로이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig04.jpg"> 그림 4. 냉동보존이 심장 스페로이드의 생존력과 구조에 미치는 영향. (A) CS 생성, 후속 바이오뱅킹 및 해동의 개략도. (B) 신선 및 냉동보존된 CS에서 유세포 분석 세포 생존율 테스트. 양성 대조군으로서 5분 동안 10% Triton-X 용액으로 처리한 것을 사용하였다. (조건당 n = 4). 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. ****p &lt; 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. (C) 배양 7일 후 신선 CS와 해동된 CS에서의 Calcein-AM 세포 생존율 테스트(조건당 n = 15-17, ****p &lt; 0.001, paired t-test; 스케일 바, 200μm). (D) 신선하고 해동된 CS에서 α-액티닌 및 트로포닌 T 발현에 대한 대표적인 명시야(왼쪽) 및 면역형광 염색. 면역형광: Hoechst(파란색), α-액티닌(녹색) 및 트로포닌 T(빨간색). 오른쪽의 병합된 그림은 CS의 sarcomere 줄무늬를 표시합니다. 스케일 바, 50 μm. 약어: X = 해동일 선택, PI = 요오드화 프로피듐, Cal-AM = 칼세인-AM, EthD-I = 에티듐 호모다이머 I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64365/64365fig05.jpg"> 그림 5: 신선 CS와 해동된 CS의 칼슘 과도 현상. (A) 냉동 보존 전과 해동 후 1주일 CS의 대표적인 칼슘 과도 상태 및 시간 경과 이미지. (B) 신선 및 냉동/해동된 심장 스페로이드의 박동 비율. 막대는 개별 실험을 나타냅니다. (C) 신선 및 냉동/해동된 심장 스페로이드의 박동률. (D-G) 칼슘 과도 매개변수의 정량화: 피크 값, 상승 시간, 붕괴 시간 및 CTD90. 데이터는 SD± 평균입니다. *p &lt; 0.05, ****p &lt; 0.001; 일원 분산 분석에 이어 Tukey의 사후 다중 비교 테스트. 약어; CTD = 칼슘 과도 기간, CSs = 심장 스페로이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/64365fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 유세포 분석을 위한 대표적인 게이팅 전략. (A) 순수 모집단에서 α-액티닌 양성 hiPSC-CM에 대한 대표적인 게이팅 전략 대 음성 대조군 및 동형 대조군. α-액티닌 양성 분석 세포의 수는 25 x 105입니다. 약어; SSC = 측면 산란, PI+ = 프로피듐 요오드화물 양성. (B) 신선, 해동, 양성 대조군(Triton-X) 및 음성 대조군(염색되지 않음) 모두에서 생존력 분석을 위한 대표적인 게이팅 전략. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64365/figures%20version%202_6-end.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에 제시된 것은 고처리량, 다차원 형식으로 배양된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 심장 스페로이드(CS)의 생성 및 냉동 보존을 위한 일련의 프로토콜입니다. 이 3차원 모델은 질병 모델링, 고처리량 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼 역할을 하며 냉동 보존 후에도 기능을 유지합니다.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

이 프로토콜은 심장 스페로이드의 생성, 유지 관리 및 광학 분석을 위한 워크플로우를 설명합니다. 이러한 심장 스페로이드는 현재 체외 질환 모델의 격차를 메우는 데 필수적입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 차세대 고처리량 스크리닝 및 심장 스페로이드의 기능적 보관을 만들 수 있습니다.인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 포함하는 배양 플레이트의 각 웰에 1 밀리리터 / 센티미터 제곱의 멸균 심장 박리 용액을 추가하는 것으로 시작하십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 명시야 현미경의 4배 배율로 흰색과 둥근 모양의 세포를 관찰하여 세포의 분리를 확인합니다.5 밀리리터 피펫을 사용하여 2 밀리리터의 따뜻한 기저 배지로 세포를 플러싱하여 세포를 기계적으로 해리시켜 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고, 300g에서 3분 동안 원심분리한다. 그런 다음 상청액을 흡인하고 1밀리리터의 hiPSC-CM 재도금 매체에 세포를 재현탁합니다.1, 000 마이크로 리터 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿을 해리하십시오. 3 회 또는 4 회 혼합 후 용액이 균질하게 나타나면 카세트에 로드하여 세포를 계수하고 100 마이크로 리터의 재 도금 배지에 적절한 양의 세포를 초저 부착, 둥근 바닥, 96 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 인큐베이터의 오비탈 셰이커에 심장 스페로이드 플레이트를 섭씨 37도의 온도, 5%의 이산화탄소, 21%의 산소, 90%습도로 24시간 동안 70rpm으로 놓습니다.스페로이드 파열을 방지하려면 각 웰에서 50마이크로리터의 배지만 흡입하고 처음 48시간 동안 웰당 100마이크로리터의 RPMI와 B27 배지를 추가합니다. 다음에, 각 웰로부터 100 마이크로리터의 배지를 흡인하고, 웰 당 100 마이크로리터의 성숙 배지를 첨가한다. 성숙 배지에서 세포를 유지하고 2-3 일마다 배지를 새로 고칩니다.스페로이드 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 놓아 예냉한 후 플레이트를 70g에서 3분 동안 원심분리합니다. 50마이크로리터가 우물에 남을 때까지 배지를 제거합니다. 그런 다음 웰당 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 hiPSC 동결 매체를 추가합니다.플레이트 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 실리콘 몰드를 준비하기 위해 실리콘 엘라스토머 키트의 구성 요소를 10:1 비율로 혼합하고 웰 플레이트의 바닥 부분에 용액을 추가합니다. 진공 펌프를 사용하여 15-20분 동안 용액의 기포를 제거합니다.몰드를 오븐에 넣고 섭씨 60도에서 8시간 동안 경화시켜 플레이트에서 벗겨낸 반유연 엘라스토머를 얻습니다. 밀봉된 플레이트를 실리콘 몰드에 조심스럽게 넣어 웰 플레이트와 냉동실 사이의 균일한 열 교환을 보장합니다. 플레이트를 액체 질소 탱크 또는 장기 보관을 위해 섭씨 150도 냉동고로 옮기기 전에 준비된 실리콘 몰드에서 최소 4시간 동안 플레이트를 섭씨 80도에서 동결합니다.심장 스페로이드의 빠른 해동을 보장하기 위해 액체 질소에서 한 번에 심장 스페로이드가 있는 세포 플레이트 하나를 수집하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소, 21% 산소 및 90% 습도의 인큐베이터에 15분 동안 두십시오. 플레이트에서 밀봉 필름을 제거하고 각 웰에 200 마이크로리터의 따뜻한 기본 배지를 추가하기 전에 각 웰의 150마이크로리터를 흡인합니다. 플레이트를 70g에서 3분 동안 원심분리하고 따뜻한 기초 배지 세척을 반복합니다.완료되면 150 마이크로 리터의 배지를 제거하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 심근 세포 해동 배지를 추가합니다. 그런 다음 심장 스페로이드 생성 동안 언급된 대로 RPMI 세척을 반복한 다음 성숙 배지에서 세포를 유지합니다. 배양 1주일 후, 해동된 심장 스페로이드는 칼슘 취급 광학 이미징에 최적입니다.각 웰의 150 마이크로 리터를 흡인합니다. 해동된 심장 스페로이드를 어두운 조건에서 웰 당 100마이크로리터의 Cal-520 AM 칼슘 염료 배지로 처리하고 플레이트를 60분 동안 배양합니다. 현미경에 전원을 공급하고 환경 제어 옵션이 켜져 있는지 확인하여 칼슘 획득 및 분석 시스템을 준비합니다.카메라와 프레이밍 조리개 크기를 조정하여 배경 영역을 최소화합니다. 칼슘 신호를 측정하려면 488나노미터 레이저를 사용하여 칼슘 방출 중에 밝은 녹색 신호가 있는 검은색 배경으로 대비를 설정합니다. 10초 이내에 2-10개의 피크의 일관된 스트림으로 비디오를 녹화합니다.10초 분량의 비디오를 녹화하고 96웰 플레이트를 스캔하여 처음에는 왼쪽으로 이동한 다음 지그재그 방식으로 아래쪽으로 이동하여 전체 플레이트를 덮습니다. 과도칼슘을 획득한 후 형광 추적 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 심장 스페로이드는 파종 후 첫날까지 3D 구조를 획득했으며 최대 6주 동안 배양할 수 있었습니다.3주령 심장 스페로이드의 대부분은 알파 액티닌 및 트로포닌 T.0일째에 높은 수준의 알파 액티닌과 3주 된 심장 스페로이드가 배양 중에 일정하고 매우 순수한 세포 조성을 나타냄으로써 규칙적인 육종 조직을 나타냈습니다. 심장 유전자, 데스모솜 및 미토콘드리아의 증가된 발현은 90일 동안 2D에서 배양된 hiPSC-CM보다 스페로이드에서 관찰되었습니다. 심장 스페로이드의 박동 비율은 생성 후 처음 3주 동안 비슷했으며 심장 스페로이드 악화로 인해 6주차에 크게 떨어졌습니다.박동률은 3주차에 비해 현저히 감소했고 악화의 결과로 6주차에 감소했습니다. 칼슘 과도 매개변수는 2주차에 더 높은 피크 값을 나타냈고, 상승 시간, 붕괴 시간 및 붕괴의 90%에서 칼슘 과도 지속 시간은 3주차에 유의하게 증가하여 hiPSC-CM 유래 스페로이드가 생성 후 2주차와 3주차에 기능적으로 최적임을 보여줍니다. 스페로이드 크기는 파종에 사용되는 세포의 수에 따라 증가했습니다.더 큰 크기의 오래된 스페로이드에서는 박동이 훨씬 더 컸습니다. 2.5k 스페로이드와 비교하여 5k, 10k 및 20k 스페로이드에서 유사하고 상당히 높은 박동률이 나타났습니다. 냉동보존은 심장 스페로이드 내의 세포 생존율에 영향을 미치지 않았습니다.해동된 스페로이드와 신선한 연령 일치 스페로이드에서 육종 단백질의 유사한 발현은 냉동 보존 효율을 나타냅니다. 해동되거나 신선한 심장 스페로이드의 박동률에는 큰 변화가 없었습니다. 상승 시간, 붕괴 시간 및 해동 또는 신선한 CS의 CTD90에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다. 질병 모델링 및 고처리량 약물 스크리닝 외에도 이러한 스페로이드는 세포외 소포 생산 및 세포외 소포 관련 치료의 생물반응기에도 사용할 수 있습니다.또한 이러한 스페로이드의 바이오뱅킹은 재생 전략을 위한 새로운 심근세포 공급원으로 사용될 수 있습니다. 축적된 증거에 따르면 낭포성 섬유증, 암 및 심장 스페로이드에 대한 환자 유래 줄기 세포 모델의 바이오뱅크는 약물 스크리닝 및 개인 맞춤형 의학을 위한 분자 메커니즘을 밝힐 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

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연구

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생명공학

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

이 기사는 효율적으로 선택적으로 참조 마커의 분석은 인구의 동질성과 정체성을 평가하기 위해 유동 세포 계측법 다음에 대한 Wnt 경로를 변조하여 심근에 인간 만능 줄기 세포를 구별하는 자세한 방법을 설명합니다.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

여기에서는 인간 만능 줄기세포(hPSC)를 위한 강력하고 빠르며 확장 가능한 심근세포 분화 프로토콜을 제시합니다. 이 대규모 방법을 사용하여 파생된 심근세포는 인간 심혈관 질환 모델링, 고처리량 약물 스크리닝 및 잠재적인 임상 응용 분야에서 효과적으로 사용할 수 있는 충분한 세포 수를 제공할 수 있습니다.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

여기서 우리는 견고한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포를 일관되게 생성하고 그 기능을 특성화하는 방법을 설명하고 검증한다. 이러한 기술은 신호 경로에 대한 기계적 통찰력을 개발하고, 대규모 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공하고, 심장 질환을 안정적으로 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

칼슘 취급 특성화를 위한 심실 유사 HiPSC 유래 심근세포 및 고품질 세포 제제 의 생성

여기서, 우리는 미리 분화된 인간 유도만능 줄기 세포 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포로 구성된 3D 자가 조립 심장 미세 조직 배열을 생성하는 사용하기 쉬운 방법론을 기술합니다. 심장 미세 조직을 생성하는 기술을 요구하는 이 사용자 친화적이고 낮은 세포는 질병 모델링 및 약물 개발의 초기 단계를 위해 구현될 수 있습니다.

인간 iPSC 유래 심근세포, 심장 섬유아세포 및 내피 세포를 사용하여 3D 심장 미세 조직 배열의 제조

이 프로토콜은 매달려 방울에 세포를 공동 배양하여 3D 심장 스페로이드 (CSs)를 제조하는 것을 목표로합니다. 콜라겐 임베디드 CS는 심부전을 모델링하기 위해 생리적 농도에서 독소루비신(DOX, 심독성 제) 으로 치료됩니다. DOX 처리된 CS를 사용하여 시험에서 시험은 심부전 환자를 위한 새로운 치료를 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다.

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여기서, 우리는 환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포를 강력하게 생성하고 확장하는 프로토콜을 제시합니다.

환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포(hiPSC-CM)는 전임상 심장 독성 스크리닝을 위해 동물을 사용하는 것에 대한 대안을 제공합니다. 전임상 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 광범위한 채택에 대한 한계는 세포의 미성숙하고 태아와 유사한 표현형입니다. hiPSC-CM의 견고하고 신속한 성숙을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

성숙한 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 단층을 사용한 고처리량 심장 독성 스크리닝

빛을 사용하여 심장 세포와 조직을 제어하면 비접촉 자극이 가능하여 세포의 자연 상태와 기능을 보존할 수 있으므로 기본 연구와 치료 응용 분야 모두에 유용한 접근 방식이 됩니다.

비유전적 광학 자극을 통한 Ca2+ 전파를 연구하기 위한 심장 미세생리학적 시스템

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높은 처리량 Antifungal 약물 검사를위한 칸디다 albicans Biofilm 칩 (CA BChip)

배우세요 hiPSC 유래 심장 스페로이드 생성 및 고처리량 스크리닝 방법을. 냉동보존 기술로 장기 저장이 가능하며 약물 발굴과 질병 모델링에 활용됩니다.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심장 스페로이드의 생성, 고처리량 스크리닝 및 바이오뱅킹

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