Bestimmung der in vitro und zellulären Einschaltkinetik für fluorogene RNA-Aptamere

Die Untersuchung der In-vitro- und zellulären fluorogenen Aptamer-Kinetik ermöglicht es dem Benutzer zu beurteilen, ob Aptamer-Farbstoff-Interaktionen schnell genug sind, um einen Prozess von Interesse in Echtzeit zu untersuchen. Die vorgestellten Techniken ermöglichen quantitative kinetische Messungen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Zelle, die je nach Anwendung des Aptamers relevant sein können. Die vorgestellten Methoden können auf jedes fluorogene RNA-System angewendet werden, einschließlich alternativer Aptamere und RNA-basierter Biosensoren für kleine Moleküle.

Um zu beginnen, richten Sie das RNA-Renaturierungsprogramm aus dem Thermocycler ein. Erstellen Sie das Programm, indem Sie Neues Programm erstellen "Neue Phase hinzufügen" und "Neuen Schritt hinzufügen" mehrmals auswählen, um temperaturspezifische Schritte hinzuzufügen, bevor Sie auf Speichern klicken"Passen Sie zusätzliche Einstellungen entsprechend dem Programm an. Um Spinat zwei und Brokkoli-RNAs zu renaturieren, bereiten Sie zwei mikromolare Stiele jeder RNA in doppelt destilliertem Wasser in einem 0,5 Milliliter dünnwandigen PCR-Röhrchen vor.

Fügen Sie dann gleiche Volumina von zwei-x Renaturierungspuffer hinzu, um eine mikromolare RNA-Lösung herzustellen. Legen Sie die Schläuche in den Thermocycler. Öffnen Sie das gespeicherte Renaturierungsprogramm und drücken Sie Ausführen"Als nächstes richten Sie das Plattenlese-Injektorprogramm ein.

Wählen Sie auf dem Fluoreszenzplattenleser "Temperatur" und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein. Stellen Sie vor Beginn der Kinetik sicher, dass sich die Temperatur auf diesen Wert eingestellt hat. Öffnen Sie die Plattenlesersoftware.

Wählen Sie Einstellungen"dann Erfassungsansicht", um das Programm für kinetische Messungen einzugeben, wählen Sie "Schleife" für jede Vertiefung. Legen Sie als Nächstes die Baseline-Einstellung auf 60 Baseline-Lesevorgänge und die Smart-Inject-Einstellungen für die 10-Mikroliter-Injektion fest. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 448 Nanometer, die Emissionswellenlänge auf 506 Nanometer und die Kartusche auf Mono ein.

Stellen Sie die Gesamtlesezeit auf 10 Minuten mit einem Leseintervall von 0,5 Sekunden ein. Stellen Sie PMT und Optik auf sechs Blitze pro Lesevorgang ein. Dann Eingabeschleife zum nächsten Bohrloch.

Um den Plattenleser-Injektor vorzubereiten, wählen Sie "inject" auf dem Plattenleser und liefern Sie eine Abfallsammelplatte, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Dann wählen Sie "Waschen" und reinigen Sie das Injektionsrohr gemäß den Anweisungen auf dem Plattenleser mit einem Milliliter Volumen doppelt destilliertem Wasser, 75% Ethanol und dann destilliertem Wasser. Als nächstes wählen Sie aspirieren", damit der Injektor überschüssige Flüssigkeit ausstoßen kann.

Dann wählen Sie "prime", um den Injektor mit zwei 260 Mikrolitern 100 Mikromolar D F H B zu grundieren I.To führen Sie ein kinetisches Experiment durch, fügen Sie 80 Mikroliter Bindungspuffer-Master-Mix zu einer Vertiefung einer 96 gut klaren Bodenplatte hinzu. Dann fügen Sie 10 Mikroliter renaturierte RNA hinzu. Lassen Sie die Platte und die D F H B I Lösung im Injektor 15 Minuten lang auf 37 Grad Celsius ausgleichen.

Als nächstes wählen Sie den zu analysierenden Brunnen in den Softwareeinstellungen unter dem Lesebereich aus. Wählen Sie dann auf der Registerkarte "Startseite" die Option "Ausführen", um das zuvor beschriebene Kinetik auszuführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Experimente abgeschlossen sind.

Nach dem Lauf waschen Sie den Injektor, um die verbleibende D F H B I Lösung aus dem Injektionsrohr zu entfernen, wie zuvor gezeigt. Um die experimentellen Dateien einzurichten, schalten Sie das Durchflusszytometer und den Computer ein. Erstellen Sie eine neue Datei auf der Registerkarte des Experiment-Explorers, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Benutzernamen des Durchflusszytometers klicken.

Wählen Sie dann "Neues Experiment" im Dropdown-Fenster und wenn ein neues Fenster auf dem Computerbildschirm erscheint, wählen Sie Experimenttyp als Röhrchen "und wählen Sie dann OK"Klicken Sie in der neuen Experimentdatei mit der rechten Maustaste auf den Gruppenordner und wählen Sie Neues Probenröhrchen hinzufügen"Beschriften Sie die Probenröhrchen für jeden bestimmten Zeitpunkt und replizieren Sie, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Probe klicken und "Umbenennen" im Dropdown-Menü auswählen. Als nächstes bereiten Sie eine verdünnte Zelllösung vor, indem Sie 1,5 Milliliter eines X P B S und drei Mikroliter induzierte Zellen in AI-Medien in einem Kulturröhrchen hinzufügen. Bevor Sie Farbstoff hinzufügen, messen Sie die Hintergrundfluoreszenz der Zellen, um zu beobachten, wie sich die Falte im Laufe der Zeit einschaltet.

Sobald der Farbstoff hinzugefügt wurde, legen Sie das Kulturröhrchen mit Zellen in PB S in den Probenröhrchenheber und heben Sie den Lifter zur Probeninjektionsnadel an. Wählen Sie dann die richtige Probendatei auf der Registerkarte des Sammelbereichs aus und klicken Sie auf "Sobald der Lauf abgeschlossen ist, senken Sie den Probenröhrchenheber mit dem Kulturröhrchen von Hand. Um einen Spülschritt einzuleiten, das fluidische System zu spülen und die Verschleppung zwischen jeder biologischen Replikationsprobe zu minimieren.

Um zum folgenden Beispiel zu wechseln, wählen Sie die nächste Beispieldatei aus, indem Sie auf das Pfeilsymbol nach rechts neben dem Namen des Probenröhrchens unter dem Datensatzsymbol klicken. Um die Fluoreszenz von Zellen mit Farbstoff zu messen, fügen Sie 1,4 Mikroliter konzentrierten Farbstoffvorrat in einen X P B S mit Zellen ein, um eine Endkonzentration von 50 Mikromolar D F H B I one T zu erhalten.Schließen Sie den Deckel des Kulturröhrchens und drehen Sie ihn drei- bis fünfmal um, um die Lösung gleichmäßig zu mischen. Als nächstes entfernen Sie den Deckel und legen Sie das Kulturröhrchen in den Probenröhrchenheber.

Nachdem Sie den Halter zur Probeninjektionsnadel gehoben haben, klicken Sie auf das Symbol "Aufnahme" unter der richtigen Probendatei. Beginnen Sie dann einen Timer durch Drücken von Start"In-vitro-Kinetik von fluorogenen Aptameren Spinat zwei und Brokkoli, zeigte Zwei-Phasen-Assoziationskinetik für die Bindung an den D F H B I Farbstoff. Für beide Aptamere wurden die Kinetik besser durch Zweiphasenassoziation als durch einphasige Assoziation bei langen Messzeiten angepasst.

Die Best-Fit-Kurve bestimmte die Geschwindigkeitskonstanten und Halbwertszeiten für die schnellen und langsamen Assoziationen. Spinat zwei im Bindungskompetenzzustand, zeigte ein schnelleres Einschalten als Brokkoli. Die Kinetik der zweiten Phase für beide Aptamere ist ähnlich und kann einem gemeinsamen geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt entsprechen.

Die kinetischen Aptamerenkurven bestehen aus einem ähnlichen Grad an schnell assoziierenden RNAs. Für Zellen, die Spinat zwei T-RNA exprimieren, steigt die mittlere Fluoreszenzintensität oder M F I sofort zum Zeitpunkt Null an. Darüber hinaus erreichte die zelluläre Fluoreszenz innerhalb von fünf Minuten ihren maximalen äquilibrierten M f I-Wert.

Im Gegensatz dazu zeigten Kontrollzellen eine geringe Hintergrundfluoreszenz und keine Änderung der M F I-Werte mit D M S O Addition Mit den vorgestellten Methoden können Forscher bestimmen, wie sie RNA-basierte Sensoren in fluorogenen Aptameren schneller herstellen können.