Quantifizierung der antimykotischen Aktivität von Peptiden gegen Candida albicans
13. Januar 2023
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung quantitativer Daten über die antimykotische Aktivität von Peptiden und anderen Verbindungen, wie z. B. niedermolekularen Antimykotika, gegen Candida albicans. Die Verwendung der optischen Dichte anstelle der Zählung koloniebildender Einheiten zur Quantifizierung der Wachstumshemmung spart Zeit und Ressourcen.
Peptide werden als neuartige antimykotische Moleküle untersucht. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die antimykotische Wirksamkeit gegen den menschlichen Pilzerreger Candida albicans zu untersuchen. Diese Technik liefert quantitative Daten zur antimykotischen Aktivität und reduziert gleichzeitig die Versuchszeit und den Plastikmüll im Vergleich zu den anderen Methoden, die die Herstellung auf Agar erfordern.
Zusätzlich zum Testen der Aktivität gegen Candida albicans kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Aktivität gegen andere hefebildende Zellen zu testen und die Aktivität von niedermolekularen Antimykotika zu testen. Beginnen Sie mit der Inokulation des gewünschten Candida albicans-Stammes in 10 Milliliter flüssigen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose oder YPD-Medium in einem Kulturröhrchen. Züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius und 230 U/min auf einem Rotationsschüttler. Subkultivieren Sie die Nachtkultur von C.albicans und wachsen Sie auf eine optische Dichte von etwa 1,0 bis 1,2 bei 600 Nanometern Wellenlänge.
Lösen Sie jedes Peptid in sterilem Wasser und verdünnen Sie es auf das Doppelte der gewünschten höchsten Konzentration, dann geben Sie 40 Mikroliter der gewünschten Peptidstammlösungen in die erste Vertiefung jeder Reihe in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden. Als nächstes geben Sie 20 Mikroliter steriles Reinstwasser in die Spalten 2 bis 12 der Reihen, die das Peptid enthalten. Um die Peptidstammlösungen seriell über die Platte bis zu Spalte 10 zu verdünnen, übertragen Sie 20 Mikroliter von Säule 1 in Spalte 2 und mischen Sie sie durch Auf- und Abpipettieren.
Wiederholen Sie den Verdünnungsprozess bis zu Spalte 10, die 40 Mikroliter Peptidlösung bei einer Verdünnung der Konzentration von Spalte 1 zu 512 enthält. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie 20 Mikroliter Peptidlösung aus Spalte 10 und entsorgen Sie sie. Die C.albicans-Subkultur wird in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 3.900 g zentrifugiert.
Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren oder Dekantieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 Milliliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer und überführen Sie die Suspension in ein 1,7-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand.
Resuspendieren Sie das Pellet erneut in 1 Milliliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer und waschen Sie es weitere 2 Mal, um die gewaschenen Zellen in 1 Milliliter Natriumphosphatpuffer zu belassen. Bestimmen Sie die Zelldichte der gewaschenen Zellsuspension und verdünnen Sie die Suspension auf 5 mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Milliliter in einem 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer. Nehmen Sie eine verdünnte C.albicans-Zellsuspension und fügen Sie 20 Mikroliter zu den Spalten 1 bis 10 und Spalte 12 jeder Zeile hinzu, dann fügen Sie 20 Mikroliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer zu Spalte 11 hinzu.
Decken Sie die Platte 1 ab und legen Sie sie für 30 Minuten in einen Inkubator bei 30 Grad Celsius. Bereiten Sie eine neue 96-Well-Kulturplatte vor, um die Lebensfähigkeit zu quantifizieren, indem Sie 100 Mikroliter YPD in alle Vertiefungen von Platte Nummer 2 geben und dann 100 Mikroliter 2-millimolaren Natriumphosphatpuffer in alle Vertiefungen von Platte 2 geben. Um die Proben in Platte 1 zu verdünnen, entnehmen Sie Platte 1 aus dem Inkubator und geben Sie 280 Mikroliter 1-millimolaren Natriumphosphatpuffer in jede Vertiefung.
Nachdem Sie den Inhalt gut mit einer Pipette gemischt haben, geben Sie 8 Mikroliter von Platte 1 in die entsprechende Vertiefung von Platte 2. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die abgedeckte Platte 2 für 17 Stunden bei 30 Grad Celsius bei 350 U/min auf einen Mikrotiterplattenschüttler. Mischen Sie alle Vertiefungen in Platte 2, indem Sie auf und ab pipettieren, um sicherzustellen, dass alle Zellen resuspendiert sind.
Erhalten Sie optische Dichtemesswerte bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern für jede Vertiefung in Platte 2 mit einem Absorptionsplattenleser. Zeichnen Sie die Verringerung der Lebensfähigkeit als Funktion der Peptidkonzentration auf, um den Prozentsatz der Wachstumshemmung zu berechnen und die Wirkung der Peptide auf das Wachstum von C. albicans zu bestimmen. Nach der Inkubation der Peptide mit den C. albicans-Zellen wurde die antimykotische Aktivität unter Verwendung der koloniebildenden Einheiten oder der KBE-Zählmethode und des beschriebenen Protokolls unter Einbeziehung optischer Dichtemessungen quantifiziert.
Die Daten, die die optischen Dichtemessungen verwendeten, waren hochgradig reproduzierbar, wie die kleinen Standardabweichungen der Replikate zeigten. Halten Sie bei der Durchführung dieses Protokolls die Candida albicans-Zellen in Hefeform, indem Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius inkubieren, da optische Dichtemessungen in den Hyphenzellen nicht zuverlässig sind. Die Effizienz dieser Methode hat es den Forschern ermöglicht, hohe Dreifachstudien zur Peptidaktivität durchzuführen, indem sie eine größere Anzahl von Peptiden und Peptidkonzentrationen testeten.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Beurteilung der antimykotischen Aktivität von Peptiden und niedermolekularen Wirkstoffen gegenüber dem humanen Pathogen Candida albicans vor. Mithilfe von Messungen der optischen Dichte ermöglicht diese Methode einen effizienteren Ansatz zur Quantifizierung des Wachstumshemmungsgrades und spart im Vergleich zu traditionellen Bestimmungen der koloniebildenden Einheiten Zeit und Ressourcen ein.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Antifungale Aktivität von Peptiden
- Pathogenese von Candida albicans
- Quantitative Methoden in der Mikrobiologie
Hintergrund
- Entstehung neuartiger antimykotischer Therapien
- Einschränkungen herkömmlicher CFU-Zählmethoden
- Umweltauswirkungen wissenschaftlicher Methoden
Verwendete Methoden
- Optische Dichtemessung zur Wachstumshemmung
- Candida albicans als biologisches Modell
- High-Throughput-Screening in 96-Well-Platten
Hauptergebnisse
- Effiziente Quantifizierung der antimykotischen Wirksamkeit
- Nachgewiesene Reproduzierbarkeit von optischen Dichtemessungen
- Möglichkeit, mehrere Peptide und Konzentrationen gleichzeitig zu untersuchen
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine schnellere Untersuchung von antimykotischen Wirkstoffen.
- Es unterstreicht die Rolle von Peptiden bei der Bekämpfung von Candida-Infektionen und leistet einen Beitrag zur zukünftigen antimykotischen Forschung.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative Prüfung der Antimykotika-Empfindlichkeit ist entscheidend für die Validierung von Wirkstoffzielen in frühen Entwicklungsstadien und die Selektion von Verbindungen in der Antimykotika-Forschung. Dieses auf optischer Dichte basierende Protokoll ermöglicht eine schnelle, reproduzierbare Bestimmung der Wirksamkeit von Peptiden gegen Candida albicans und reduziert im Vergleich zur traditionellen Koloniezählung den zeitlichen und ressourcenspezifischen Aufwand. Die Methode unterstützt die Hochdurchsatzbewertung und beeinflusst somit unmittelbar die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten und die Absicherung von Wirkmechanismen in der Antimykotika-Forschung und -Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die quantitative Beurteilung der antifungalen Peptidaktivität zur Zielvalidierung.
- Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem reproduzierbare Hemmdaten über verschiedene Konzentrationen hinweg bereitgestellt werden.
- Erleichtert die schnelle Vorauswahl von Kandidatenmolekülen basierend auf quantitativen Wachstumshemmprofilen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte Hefe-basierte Systeme für nachgeschaltete Antimykotika-Screening-Workflows auf.
- Liefert standardisierte, quantitative Ergebnisse, die für Hochdurchsatz-Screenings im 96-Loch-Format geeignet sind.
- Verringert die Variabilität des Assays und unterstützt die Reproduzierbarkeit über verschiedene Substanzbibliotheken hinweg.
- Ermöglicht die effiziente parallele Evaluierung mehrerer Peptide und Konzentrationen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ergänzt translationsmedizinische Biomarker-Strategien, indem die Wachstumshemmung als funktioneller Endpunkt quantifiziert wird.
- Unterstützt die Kontinuität von der frühen Entdeckung bis hin zu präklinischen Wirksamkeitsstudien von Antimykotika.
- Liefert Daten zur risikoadjustierten Weiterentwicklung von Antimykotika-Kandidaten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich an der Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Identifizierung von Leitverbindungen und ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung sowie die Priorisierung von Verbindungen für antifungale Programme.
- Entdeckungsbiochemie: Quantitative Wachstumshemmungsdaten verdeutlichen den Wirkmechanismus von Peptiden und deren biologische Relevanz.
- Screening: Ein hochdurchsatzfähiges, reproduzierbares Testformat beschleunigt die Bewertung und den Vergleich von Substanzen.
- Analytik: Messungen der optischen Dichte liefern standardisierte, quantitative Ergebnisse für die statistische Analyse.
- Translationale Forschung: Daten zur funktionalen Hemmung unterstützen die Auswahl präklinischer Modelle und die Abstimmung von Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das Protokoll ist anpassbar für andere Hefe-artige Pathogene und antimykotische Wirkstoffe und ermöglicht die Skalierung der Plattform.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Validierung antifungaler Zielstrukturen und verringert mechanistische Unschärfen.
- Operationaler Wert: Optimiert Arbeitsabläufe, reduziert Kunststoffabfall und verbessert die Reproduzierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht schnellere Go/No-Go-Entscheidungen und verbessert die Kapitalnutzungseffizienz in der Entdeckung von Antimykotika.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung antifungaler Kandidaten.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Hefekultur und im Aufbau quantitativer Assays.
- Benötigt Zugang zu Absorptions-Plattenlesegeräten und 96-Well-Platten-Infrastruktur.
- Erfordert die Standardisierung von Kontrollen und Datenanalyseverfahren über Teamgrenzen hinweg.
- Kann möglicherweise Anpassungen für Nicht-Hefe- oder hyphale Pilzformen erfordern, bedingt durch Einschränkungen der optischen Dichte.
- Die Zuverlässigkeit hängt davon ab, C. albicans während der Messung in Hefeform zu halten.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Inoculation, Culturing, and Subculturing of C. albicans
1:29
Preparation of the Peptide Solutions in a 96-Well Plate
2:33
Dilution of the C. albicans Subculture
3:37
Incubation of C. albicans
5:00
Determination of Antifungal Activity
5:34
Results: Assessment of the Antifungal Activity of Histatin 5 and Variants of Histatin 5 Containing Modifications at the Lysine Residues
6:05
Conclusion
