Eine Methode zur Untersuchung der Toxizität und Aggregation von α-Synuclein unter Verwendung eines humanisierten Hefemodells

Dies ist eine einfache Methode, um zelluläre Phänotypen und Merkmale von R-Pass-Kernen zu überwachen. Es kann auch oft in genomweiten Studien gewonnen werden, um die genetischen Faktoren zu finden, die die Stabilität von R-Pass-Kernen beeinflussen. Da es sich um einen gut etablierten motorischen Organismus handelt, ist diese Technik einfach und erfordert nicht viel Zeit und Mühe im Vergleich zur Verwendung von menschlichen Zelllinien oder Tiermodellen.

Die Aggregation von R-Pass-Kernen ist eng mit der Parkinson-Krankheit verbunden. Die Proteine oder Chemikalien, die wahrscheinlich die Stabilität von R-Pass-Kernen beeinflussen, können in diesem humanisierten Hefemodell getestet werden. Zu Beginn werden drei einzelne Kolonien auf eine SD-URA-Agarplatte gepatcht, um Zellen auszuwählen, die Alpha-Synuclein-Plasmide enthalten.

Dann werden die dreigepatchten Hefetransformanten pro Stamm in 3 Milliliter SRD-URA für das selektive Wachstum von Hefe, die die Plasmide enthält, mit 2% Raffinose zur Hemmung der Induktion von Alpha-Synuclein unter dem Gal1-Promotor und 0,1% Glukose beimpft. Inkubieren Sie die beimpfte Kultur bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute. Am nächsten Tag impfen Sie die über Nacht kultivierten Zellen in 3 Milliliter frisches SRD-URA, bis sie eine optische Dichte von 0,2 bei 600 Nanometern erreichen.

Dann inkubieren Sie die Kultur für sechs Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometer mit einem Spektralphotometer. Als nächstes verdünnen Sie die Proben auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern mit sterilem destilliertem Wasser in Spur 1 einer 96-Well-Platte, um die Anzahl der Zellen in jeder Kultur auszugleichen.

Führen Sie 5-fache serielle Verdünnungen der Hefezellen durch, indem Sie 160 Mikroliter steriles destilliertes Wasser in die nächsten fünf Bahnen geben und ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern sicherstellen, wenn die Zellen in jeder Spur seriell verdünnt werden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter aus jeder Vertiefung zu übertragen, um die Proben auf SD-URA-Agarplatten für die Kontrollen und SG-URA-Agarplatten zur Überwachung der Toxizität zu erkennen. Inkubieren Sie die gefleckten Platten kopfüber bei 30 Grad Celsius für vier Tage.

Nehmen Sie alle 24 Stunden bis zum vierten Tag Bilder von den Platten auf und analysieren Sie dann die Daten, indem Sie die Wachstumsunterschiede zwischen den vom Auge entdeckten Stämmen vergleichen. Die drei geflickten Hefetransformatoren pro Stamm werden in drei Milliliter SRD-URA geimpft und bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht inkubiert. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der über Nacht kultivierten Zellen auf 600 Nanometern und impfen Sie die Zellen in 96-Well-Platten in insgesamt 200 Mikroliter frisches SD-URA und SG-URA.

Stellen Sie das Endvolumen einschließlich der Zellen auf 200 Mikroliter ein und stellen Sie die anfängliche optische Dichte der Zelle auf 0,05 bei 600 Nanometern ein. Passen Sie die Programmeinstellungen in der Mikrotiterplatte an. Stellen Sie die Solltemperatur auf 30 Grad Celsius, die Intervallzeit auf 15 Minuten, die Schütteldauer auf 890 Sekunden, die Schüttelamplitude auf 5 Millimeter und die Messung als Absorption auf 600 Nanometer ein.

Inkubieren Sie die Platte für 2-3 Tage, damit alle Stämme die stationäre Phase in einem Mikroplatten-Reader erreichen. Analysieren Sie die Daten, indem Sie die Wachstumskurve darstellen. Die geflickten Hefetransformatoren werden in 3 Milliliter SRD-URA geimpft und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute kultiviert.

Am nächsten Tag werden die über Nacht kultivierten Zellen erneut in 3 Milliliter frisches SRD-URA auf eine optische Dichte von 0,003 bei 600 Nanometern injikuliert, dann die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Rühren mit 200 Umdrehungen pro Minute inkubiert, bis die optische Dichte 0,2 erreicht. Dann fügen Sie 300 Mikroliter 20% Galaktose hinzu und inkubieren Sie dann weitere 6 Stunden bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 200 Umdrehungen pro Minute. Einen Milliliter der Zellkultur durch Zentrifugieren bei 800 g für 5 Minuten auffangen und den Überstand entsorgen.

Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 30 Mikroliter destilliertem Wasser. Bereiten Sie ein Agarose-Gel-Pad auf einem Objektträger vor. Resuspendieren Sie die Zellen und laden Sie fünf Mikroliter der Zellresuspension auf den Glasobjektträger und decken Sie die Zellen mit dem geschnittenen Agarose-Pad zur Untersuchung ab.

Um eine mikroskopische Bildgebung mit einem 100-fachen Objektiv durchzuführen, verwenden Sie die Screen-Capture-Option zum Erzeugen von Bildern mit dem Programm und wählen Sie Hellfeld, um die Zelle mit einem 100-fachen Objektiv mit Immersionsöl zu fokussieren. Wechseln Sie zu einem GFP-Fluoreszenzfilter und stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 Millisekunden und 300 Millisekunden ein, um ein klares Bild zu erzielen, indem Sie das Signal-Rausch-Verhältnis ausgleichen. Öffnen Sie die Bilddatei und analysieren Sie die Daten, indem Sie die Zellen basierend auf der Anzahl der Herde in den Zellen mit einer Bildanalysesoftware zählen.

Die Synuclein-Expression unter dem Gal1-Promotor im PRS426-Vektor zeigte eine signifikante Wachstumsverzögerung auf der Agarplatte, die Galactose als Induktor enthielt. Der Unterschied im Wachstum der Synuclein-Expression wurde auch in flüssigen Kulturen beobachtet. In beiden Kulturbedingungen zeigten Wildtyp-Synuclein und Varianten mit E46K- oder A53T-Mutationen Wachstumsdefekte aufgrund von Synuclein-Toxizität.

Die Synuclein-A30p-Variante, die keine Aggregate bildet, zeigte jedoch einen nicht-toxischen Phänotyp. Die Stämme mit schwerer Zytotoxizität zeigten Herde von Synuclein-Aggregaten, aber in der A30p-Variante wurde eine weniger toxische Form von Synuclein in den Zellen diffundiert. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Zelle in jedem Experiment im gleichen Wachstumsstadium zu verwenden, insbesondere wenn Sie Synuclein-assoziierte Phänotypen überwachen.

Wie wir in fluoreszierenden mikroskopischen Daten gezeigt haben, kann Synuclein größere Aggregate bilden. Daher kann es einfach durch Zentrifugation fraktioniert und durch Western Blotting unter Verwendung von Synuclein-spezifischen Antikörpern quantifiziert werden. Diese Technik ist für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, um neue genetische Faktoren und chemische Verbindungen zu finden, die die Aggregation von Synuclein beeinflussen.

So hoffen wir, neue therapeutische Kandidaten für die Parkinson-Krankheit zu finden.