Name: Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Lernen Sie Kultivierungsmethoden für Borrelia-Spirochäten zur Infektionsdiagnostik und Forschung. Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis lebensfähiger Bakterien aus klinischen Proben.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise vom Natural Science and Engineering Research Council of Canada und der Canadian Lyme Lyme Disease Foundation (AB und VL), dem Schwedischen Forschungsrat (SB, M-LF und IN), TAČR GAMA 2 Projekt - "Unterstützung der Verifizierung des Anwendungspotenzials 2.0 am Biologiezentrum CAS" (TP01010022) (MG und NR) und durch einen Zuschuss des Gesundheitsministeriums der Tschechischen Republik NV19-05-00191 (MG und NR) unterstützt. Wir danken S. Vranjes (2021, AG Rudenko) für das Bild in Abbildung 4 und J. Thomas-Ebbett (2021, AG Lloyd) für die Bilder in Abbildung 5. Wir danken allen Forschern, die zu diesem Gebiet beigetragen haben, und entschuldigen uns bei denen, deren Arbeiten wir aus Platzgründen nicht zitieren konnten.

Interessenkonflikte wurden nicht erklärt.

Die Laborkultur von Bakterien ist das Sprungbrett für die Forschung. Der tiefgreifende Vorteil, den die Fähigkeit zur Kultivierung mit sich bringt, wird durch den mehr als ein Jahrhundert dauernden Kampf gegen die Kultivierung von Treponema pallidum, der Spirochäte, die der ätiologische Erreger der Syphilis ist, veranschaulicht44. Borrelien-Spirochäten sind auch eine Herausforderung für die Kultur, aber Kultur ist möglich 23,24,34,44,45,46,47,48,49.</...

Borrelien sind eine Gattung von Spirochätenbakterien, die drei Hauptgruppen umfasst: die Gruppe der Lyme-Borreliose (LB), die Gruppe des Rückfallfiebers (RF) und eine weniger gut charakterisierte Gruppe, die anscheinend auf Reptilien beschränkt ist. Die Borrelien-Taxonomie ist mit dem Aufkommen molekularer Methoden, die Genom- und Proteomvergleiche ermöglichen, im Fluss, wie es bei den meisten anderen taxonomischen Gruppen der Fall ist 1,2,3,4,5,6,7. Die LB-Gruppe (auch Borreliose-Gruppe genannt) wird traditionell als Borrelia burgdorferi sensu lato bezeichnet, nach ihrem am besten charakterisierten Mitglied Borrelia burgdorferi sensu stricto. In diesem Artikel wird die derzeit am weitesten verbreitete Terminologie verwendet: die LB-, die RF- und die Reptilien-assoziierte Gruppe, und die Kulturprotokolle für die LB- und die RF-Gruppe beschrieben.
Wie für ein Mitglied der Familie Spirochaetaceae zu erwarten, können Borrelien die charakteristisch lange und dünne Spiralform annehmen, typischerweise 20-30 μm lang und 0,2-0,3 μm breit. Borrelienzellen sind jedoch hochgradig pleomorph und können aufgrund ihrer komplexen zellulären und genetischen Struktur sowohl in Kultur als auch in vivo viele andere Formen annehmen 1,8. In seiner Spirochätalform resultiert die planare Sinuswellenmorphologie aus der Rotation der axialen Endoflagellen im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran. Diese Struktur ermöglicht es den Zellen, sehr beweglich zu sein, wobei die äußere Membran Proteine enthält, die es der Zelle ermöglichen, mit dem Wirtsgewebe zu interagieren 9,10. Die Expression der Proteine der äußeren Membran ist streng reguliert und beeinflusst nicht nur die Invasion des Wirtsgewebes, sondern auch die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts11. Diese komplexe Genexpression ermöglicht es den Borrelienzellen, zwischen den sehr unterschiedlichen Umgebungen von Wirbeltierwirten und wirbellosen Vektoren zu pendeln. Das Genom von Borrelien ist bei Prokaryoten ungewöhnlich und besteht aus einem linearen und nicht aus einem zirkulären Chromosom. Neben dem linearen Chromosom enthalten Borrelien-Arten 7-21 Plasmide, einige linear und einige kreisförmig. Die Plasmide beherbergen die Mehrheit der Gene, die für die Anpassung und Virulenz des Wirts erforderlich sind, und es wird angenommen, dass die zirkulären Plasmide, die aus Prophagen stammen, für den Großteil des horizontalen Genflusses zwischen Spirochätalzellen verantwortlichsind 12,13. In Übereinstimmung mit einer Rolle bei der Wirtsanpassung verlieren einige, möglicherweise viele oder alle Mitglieder der Lyme-Borreliose-Gruppe Plasmide in Kultur14. Der am besten untersuchte "laborangepasste" Stamm von B. burgdorferi, B31, weist nur sieben der neun Plasmide auf, die in Wildisolaten dieser Art gefunden wurden15. In ähnlicher Weise verliert B. garinii Plasmide in Kultur16. Einige Studien haben gezeigt, dass RF-Spezies und B. miyamotoi Plasmide behalten, wenn sie kultiviert werden 14,17, aber neuere Arbeiten zeigen veränderte Plasmide und Infektiosität bei langfristiger In-vitro-Kultivierung 18.
Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit14,17. Die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben detektiert direkt replizierende Krankheitserreger und liefert Ausgangsmaterial für die Forschung14,17. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung der Spirochäten der LB-Gruppe sowie von RF-Borrelien und B. miyamotoi erforderlich sind. Das Basismedium für die Züchtung von Borrelia-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder das kommerziell erhältliche BSK-H), mit oder ohne Antibiotika, um das Wachstum kontaminierender Prokaryoten zu reduzieren. Dieses Medium wurde von einem Medium adaptiert, das ursprünglich zur Unterstützung von RF Borrelia19 verwendet wurde, und wurde von Stoenner20 und dann von Barbour21 weiter modifiziert. Seitdem wurden viele Modifikationen entwickelt, von denen jede Auswirkungen auf die bakterielle Physiologie hat, die das Wachstum, die Infektiosität und die Pathogenität beeinflussen können22. Dieses Medium unterstützt zuverlässig das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen und wurde verwendet, um Spirochäten aus Zecken-, Säugetier- und klinischen Proben zu isolieren23. Die neuere Variante, modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium, kann bei der Isolierung neuer Borrelienisolate aus Umweltproben einen besseren Isolationserfolg, eine bessere Morphologie und eine bessere Motilität bieten, wenn die Anzahl der in der Probe vorhandenen Spirochäten, die für die Aussaat der Kultur zur Verfügung stehen, gering ist23,24. In allen Fällen hängt der Erfolg der Kultivierung entscheidend vom frisch zubereiteten Medium und der Verwendung geeigneter Zutaten ab. Nicht alle kommerziellen Inhaltsstoffe produzieren ein hochwertiges Medium. Beimpfte Kulturen können bequem und ohne Schütteln in einem herkömmlichen Inkubator bei 32-34 °C in Gegenwart einer geringen Menge an Restsauerstoff in der Umgebung inkubiert werden. Borrelien-Spirochäten sind anaerob Pflanzen, sind aber in der Natur Schwankungen der Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentration ausgesetzt und reagieren mit Veränderungen der Genexpression26,27,28,29. Daher sollten Genexpressions-, Wachstums- und andere Stoffwechselstudien den Sauerstoff- und Kohlendioxidgehalt mit Hilfe eines sauerstoffkontrollierten Inkubators oder einer anaeroben Kammer kontrollieren. In Kultur werden Kulturen wöchentlich oder häufiger entweder mit Dunkelfeldmikroskopie oder Phasenkontrastmikroskopie auf das Vorhandensein von Spirochäten überprüft. Kulturausstriche können entweder mit Silberfärbungen, Immunhistochemie oder durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter Stämme gefärbt werden29,30. Die PCR mit anschließender DNA-Sequenzierung ist eine empfindliche und spezifische Methode zum Nachweis und zur genetischen Identifizierung bzw. Bestätigung der Borrelienspezies 30,31,32,33.
Es gibt viele kleinere Variationen von BSK-II, und einige sind im Handel erhältlich. Das hier in Abschnitt 1 beschriebene Protokoll wurde von Barbour (1984)21 übernommen. Flüssiges MKP-Medium ist ein neueres Medium und wird in Abschnitt 2 beschrieben. Es wird gemäß einem zuvor berichteten Protokoll33,34 hergestellt, das, ähnlich wie BSK-Medium, aus zwei Schritten besteht: der Herstellung des Basismediums und der Herstellung des vollständigen Mediums. Borrelien-Nährmedium kann mit oder ohne Antibiotika hergestellt werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben; das Antibiotikagesetz zur Verringerung kontaminierender Bakterien, die bei der Impfung mit klinischen Proben oder Umweltproben eingeführt werden, wie in Abschnitt 4 beschrieben; Bei der Inokulation mit reiner Borrelien-Sp.-Kultur sind möglicherweise keine Antibiotika erforderlich. Es ist oft wichtig, langfristige Borrelienvorräte anzulegen, und ein Protokoll dafür wird in Abschnitt 5 beschrieben. Abschnitt 6 beschreibt die Verwendung dieser Medien zur Isolierung reiner Borrelien-Sensu-Lato-Klone aus klinischen oder Umweltproben. Es gibt eine Reihe möglicher Ansätze36; Im Folgenden finden Sie eine, die sich als wirksam erwiesen hat. Das in diesem Protokoll verwendete Beschichtungsmedium ist eine Modifikation des BSK-II-Beschichtungsmediums37 und des MKP-Mediums34 (wobei das Kaninchenserum auf 10 % erhöht wurde38).

<table><tbody><tr><td>1,7 mL Röhrchen</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>0,2&nbsp; &Mikro; m Steriler Spritzenvorsatzfilter&nbsp;</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>10 & Mikro tun; L Barriere-Pipettenspitze</td><td>Neptune</td><td>BT10XLS3</td><td>Standardartikel - jeder Anbieter stellt</td></tr><tr><td>10 mL Serologische Pipetten her&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229011B</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>1000 & Mikro tun; L Barriere Pipettenspitze</td><td>Neptune</td><td>BT1000.96</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Celltreat</td><td>188261</td><td>Standardartikel machen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>20 & Mikro machen; L Barriere-Pipettenspitze</td><td>Neptune</td><td>BT20</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>20 ml sterile Spritze herstellen &nbsp;</td><td>BD</td><td>309661</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>200 & Mikro tun; L Barriere-Pipettenspitze</td><td>Neptune</td><td>BT200</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>25 ml Kulturröhrchen mit Schraubverschluss</td><td>herstellen Fisher Scientific</td><td>14-933C</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>25 mL Serologische Pipetten</td> herstellen <td>Celltreat</td><td>229025B</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>3 ml sterile Spritze</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>35% BSA durchführen&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-7409</td><td>Quelle ist wichtig - siehe Hinweis</td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipetten&nbsp;</td><td>Celltreat</td><td>229006B</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant stellt</td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>her Celltreat</td><td>229421</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant stellt</td></tr><tr><td>6,5 ml MKP Glasröhrchen her&nbsp;</td><td>Schott</td><td>Schott Nr. 26 135 115</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Amikacine</td><td>Sigma</td><td>PHR1654</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A9528-100MG</td><td>Standardartikel verwenden - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Bactrim/Rimethoprim/Sulfamethoxazol</td><td>Sigma</td><td>PHR1126-1G</td><td>Standardartikel verwenden - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>BBL Brucella Brühe</td> herstellen<td>BD</td><td>211088</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant führt</td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Labconco</td><td>302419100</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant führt</td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen (gelber Oberteil - ACD) durch.</td><td></td><td> Vacutainer Blutentnahmeröhrchen aus Glas mit saurer Citrat-Dextrose (ACD)</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>BSK-H Medium [w 6% Kaninchenserum]&nbsp;</td><td>Darlynn Biologicals</td><td>BB83-500</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>zentrifugieren&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Modell 5430</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird tun</td></tr><tr><td>Zitronensäure TrisodiumSalzDihydrat</td><td>Sigma</td><td>C-8532 100 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird CMRL</td></tr><tr><td></td><td>Gibco BRL</td><td>21540 500 mL</td><td>Standardartikel tun - jeder Lieferant wird kaufen</td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Gibco</td><td>21-510-018</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Kryoröhrchen (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Deep Petri mit Stapelring 100 mm & mal 25 mm</td><td>Sigma</td><td>P7741</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>tun Digitaler Inkubator</td><td>VWR</td><td>Modell 1545</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Filter für die Filtersterilisation</td> <td>herstellenMillipore 0,22 μm m GPExpressPLUS Membran</td><td>SCGPU05RE</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Difco BD</td><td>214340 500 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Glaskulturröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>99449-20</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>kaufen Glukose</td><td>Sigma</td><td>G-7021 1 kg</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td> <td>herstellenStandardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Hemafuge (Hämatokrit & Immunhämatologie-Zentrifuge )</td><td>Labwissen</td><td>Modell 3220</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant macht</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H-3784 100 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>N-Acetylglukosamin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A-3286 25 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant macht</td></tr><tr><td>Neopepton</td><td>Difco&nbsp; BD</td><td>211681 500 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant macht</td></tr><tr><td>Neubauer Hämatozytometer</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Z359629</td><td>Standardartikel - jeder Anbieter wird</td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskope</td> herstellen<td>Leitz</td><td></td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Phosphomycin</td><td>Sigma</td><td>P5396-1G</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Phosphomycin</td><td>Sigma</td><td>P5396</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Integra</td><td></td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Präzisions-Standardwaage</td><td>OHAUS</td><td>Modell TS200S</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant tun Lieferant wird</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure (Na-Salz)</td> <td>Sigma</td><td>P-8574 25 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Kaninchenserum machen&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16-120-032</td><td>Quelle ist wichtig&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaninchen-Serum&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R-4505&nbsp; 100 mL</td><td>Quelle ist wichtig&nbsp;</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501-1G</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S-5761&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 500 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Sufametaxazol verwenden&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>PHR1126</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>TC Yeastolate</td><td>Difco machen&nbsp; BD</td><td>255752 100 g</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Transferpipetten</td><td>VWR</td><td>470225-044</td><td>Standardartikel - jeder Lieferant wird</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>PHR1056</td><td>Standardartikel herstellen - jeder Lieferant wird es tun</td></tr></tbody></table>

kultivierungsmethoden von spirochäten aus borrelia burgdorferi , sensu lato complex und rezidivfieber borrelien

Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia

Die Borrelien bestehen aus drei Artengruppen, der Lyme-Borreliose-Gruppe (LB), die auch als B. burgdorferi sensu lato (s.l.) bekannt ist und kürzlich in Borreliella, die Rückfallfiebergruppe (RF) Borrelien und eine dritte reptilienassoziierte Gruppe von Spirochäten umklassifiziert wurde. Kulturbasierte Methoden sind nach wie vor der Goldstandard für den Labornachweis bakterieller Infektionen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit, da die Kultivierung von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten oder Geweben replizierende Krankheitserreger direkt detektiert und Ausgangsmaterial für die Forschung liefert. Borrelien und Borreliella-Spirochäten sind anspruchsvoll und langsam wachsend und werden daher üblicherweise nicht für klinische Zwecke kultiviert. Für die Forschung ist jedoch Kultur notwendig. Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung von LB- und RF-Spirochäten erforderlich sind, einschließlich aller anerkannten Arten aus dem B. burgdorferi s.l.-Komplex, einschließlich B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis undRF-Spirochäten, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis und B. miyamotoi. Das Basismedium für die Zucht von LB- und RF-Spirochäten ist das Barbour-Stoenner-Kelly-Medium (BSK-II oder BSK-H), das das Wachstum von Spirochäten in etablierten Kulturen zuverlässig unterstützt. Um neu isolierte Borrelienisolate aus Zecken- oder Wirtsproben züchten zu können, bei denen die anfängliche Spirochätenzahl im Inokulum niedrig ist, wird modifiziertes Kelly-Pettenkofer (MKP)-Medium bevorzugt. Dieses Medium unterstützt auch das Wachstum von B. miyamotoi. Der Erfolg der Kultivierung von RF-Spirochäten hängt auch entscheidend von der Qualität der Inhaltsstoffe ab.

Borrelien-Nährmedien BSK und MKP sowie Varianten sind reichhaltige Nährmedien mit Inhaltsstoffen, die nacheinander vorbereitet und sterilisiert werden müssen. Bei korrekter Zubereitung sollte BSK-Medium rot-orange und klar sein (Abbildung 1). Trübungen und Niederschläge, die nach der Erwärmung bestehen bleiben, deuten auf problematische Inhaltsstoffe, Mediumproduktion oder Kontamination hin. Ein solches Medium wird am besten verworfen. Wenn Gelatine zu BSK und mit MKP hinzugefügt wi...

Die In-vitro-Kultur ist eine direkte Nachweismethode für das Vorhandensein lebender Bakterien. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für die Kultivierung verschiedener Borrelien-Spirochäten, einschließlich der Borrelia burgdorferi sensu lato-Komplexes, der Rezidivfieber-Borrelienarten und der Borrelia miyamotoi. Diese Arten sind anspruchsvoll und wachsen langsam, können aber kultiviert werden.

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

The Borrelia consists of three groups of species, those of the Lyme borreliosis (LB) group, also known as B. burgdorferi sensu lato (s.l.) and recently ...

Borrelien sind eine Gattung von Spirochäten, die drei Hauptarten umfasst. Die Lyme-Borreliose-Gruppe, die Rückfallfieber-Gruppe und die weniger gut charakterisierte Gruppe, die bei Reptilien zu finden ist. Viele Borrelienarten sind pathogen.Die Bakterienkultur ist der Goldstandard für den Nachweis von Infektionen. Dies gilt sowohl für die Forschung als auch für die klinische Arbeit. Die Kultivierung von Bakterien aus Körperflüssigkeit und Gewebe bestätigt, dass die Bakterien sowohl lebensfähig sind als auch sich vermehren.Dieses Protokoll demonstriert die Methodik und die Rezepturen, die für die erfolgreiche Kultivierung und Konservierung der Lyme-Borreliose-Gruppe von Spirochäten, Rückfallfieber-Borrelien und Borrelia miyamotoi erforderlich sind. Es werden Methoden für die Kultivierung von zuvor isolierten Arten und Stämmen sowie für neue Isolate und monoklonale Isolate aus Umwelt- oder Säugetierquellen bereitgestellt. Marie-Line Faucillion, Postdoktorandin, und Ingela Nilsson, Technikerin aus dem Bergstrom Lab, Anne Berthold, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Lloyd Lab, und Maryna Golovchenko, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Rudenko Lab, demonstrieren das Verfahren.

cultivation-methods-spirochetes-from-borrelia-burgdorferi-sensu-lato

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Quelle: Eggers, C. H. Phagen-vermittelte genetische Manipulation der Lyme-Borreliose Borrochäte Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Herstellung einer genetisch veränderten Borrelia burgdorferi-Kultur , die mit ruhender Bakteriophagen-DNA hergestellt wurde, die ein Antibiotikaresistenzgen trägt. Nach der Auswahl und Inkubation von Antibiotika löst ein chemischer Induktor DNA-Schäden aus, die zur Exzision, Replikation und Assemblierung neuer Virionen führen, die das...

Präparation und Induktion von Borrelia burgdorferi-Kulturen für die Herstellung von Viruspartikeln

Source: Berthold, A., et al. Cultivation Methods of Spirochetes from Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex and Relapsing Fever Borrelia. J. Vis. Exp.(2022)This video demonstrates the cultivation of pathogenic spirochetes from infected skin tissue to model dermal infection. It highlights their localization in the dermis, interaction with the extracellular matrix, and survival during selective culture conditions.

Cultivation of Pathogenic Spirochetes to Investigate Skin Infection

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

Fütterung von Zecken auf Tiere, die zur Übertragung und Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

Nested PCR ist eine sensible, spezifische und einfache Technik, die Zecke kann, die DNA extrahiert angewendet werden, um Borrelia Burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose untersuchen. Das erste PCR-Experiment verwendet gen-spezifische Primer, um lange Amplifikate zu generieren, die dann Vorlagen für eine nachfolgende Reaktion unter Verwendung der internen Zündkapseln werden.

Das Lyme Krankheit Spirochete, Borrelia Burgdorferiin Zecken mit verschachtelten PCR zu erkennen

In-vitro-Transkriptionsassays können die Mechanismen der Transkriptionsregulation in Borreliella burgdorferi entschlüsseln. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Aufreinigung der B. burgdorferi RNA-Polymerase und zur Durchführung von In-vitro-Transkriptionsreaktionen. Experimentelle Ansätze mit In-vitro-Transkriptionsassays erfordern eine zuverlässige Aufreinigung und Lagerung der aktiven RNA-Polymerase.

Wesentliche Bestandteile von Borreliella (Borrelia) burgdorferi In-vitro-Transkriptionsassays

Die Fähigkeit von Bakteriophagen, DNA zwischen Bakterienzellen zu bewegen, macht sie zu wirksamen Werkzeugen für die genetische Manipulation ihrer bakteriellen Wirte. Hier wird eine Methodik zur Induktion, Wiederherstellung und Verwendung von φBB-1, einem Bakteriophagen von Borrelia burgdorferi, vorgestellt, um heterologe DNA zwischen verschiedenen Stämmen der Lyme-Borreliose Spirochäte zu transduzieren.

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Ein Dreikanal-Dual-Reporter-Fluoreszenz-Flussanalysesystem wurde verwendet, um einen Bead-basierten Multiplex-Immunoassay zu entwickeln, der gleichzeitig Serumproben auf IgG und IgM auswertet, die gegen mehrere Antigene verschiedener Borrelienspezies extrahiert wurden, die die Lyme-Borreliose in Europa und Nordamerika verursachen.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

In diesem Artikel wird die Methodik für die Exposition des Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis für die klinische Forschung vorgestellt. Die Technik ist relativ einfach, für die freiwilligen Forscher tolerierbar und kann je nach experimentellem Bedarf modifiziert werden. Solche Forschungen am Menschen müssen im Rahmen klinischer Studienprotokolle durchgeführt werden, die von den zuständigen Zulassungsbehörden genehmigt wurden.

Ein Modell für die experimentelle Exposition von Menschen gegenüber Larven von Ixodes scapularis Zecken

Dieses Protokoll beschreibt die in vitro Kultivierung des Syphilis-Erregers Treponema pallidum subsp. pallidum in Co-Kultur mit Säugetierzellen. Die Methode ist skalierbar; Es kann zur Herstellung großer Mengen von T. pallidum und zur Erzeugung klonaler Kulturen verwendet werden.

Verfahren zur In-vitro-Kultivierung von Treponema pallidum, der Syphilis-Spirochäte

Wir entwickelten ein humanes ex-vivo-Transwell-System , das in der Lage ist, akute entzündliche, infektiöse und strukturelle Veränderungen im Synovium zu bewerten.

Ein präklinisches Modell der Synovitis unter Verwendung ex vivo menschlichen Synovialgewebes mit erhaltener Funktion und Architektur

Lernen Sie Kultivierungsmethoden für Borrelia-Spirochäten zur Infektionsdiagnostik und Forschung. Dieses Protokoll ermöglicht den Nachweis lebensfähiger Bakterien aus klinischen Proben.

Kultivierungsmethoden von Spirochäten aus Borrelia burgdorferi , Sensu Lato Complex und Rezidivfieber Borrelien

Weitere Videos entdecken