Ein effizientes Clearing-Protokoll zur Untersuchung der Saatgutentwicklung bei Tomaten (Solanum lycopersicum L.)

Diese Methode kann Forschern helfen, schnell und mühelos abnormale Perioden der Tomatenembryonalentwicklung zu finden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist eine Behandlung von Tomatensamen mit Natriumhypochlorit, die eine Grundlage für die Beobachtung von Tomatenembryonen bietet. Beginnen Sie mit der chemischen Zubereitung und Ernte der Solanum lycopersicum Früchte drei bis 23 Tage nach der Blüte oder DAF.

Legen Sie die Früchte sofort auf Eis und teilen Sie sie in frühe, mittlere und späte Früchte, basierend auf den Tagen nach der Blüte. Brechen Sie die frühen Früchte, legen Sie sie auf einen Objektträger und sammeln Sie frische Samen vorsichtig mit einer Präzisionszange unter 1x bis 4x Vergrößerung des Stereomikroskops. Für mittlere und späte Früchte brechen Sie die Früchte und sammeln Sie frische Samen direkt mit einer Präzisionszange.

Bei der herkömmlichen Methode werden die frisch gesammelten Samen sofort in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 Milliliter FAA-Fixiermittel überführt und das Röhrchen bei 5 U/min für vier Stunden bei Raumtemperatur auf den Orbitalschüttler gelegt. Dann dehydrieren Sie die Samen in 70% 95% und 100% Ethanol für jeweils eine Stunde auf einem Orbitalschüttler bei 5 U/min. Wenn Sie fertig sind, legen Sie den Samen in die drei bis fünf Tropfen der auf dem Objektträger vorhandenen Reinigungslösung und bedecken Sie ihn vorsichtig mit einem Deckglas.

Verwenden Sie eine einzelne konkave Folie für mittlere und späte Samen. Abhängig von den Entwicklungsstadien der Samen inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur zur Reinigung. Nach der Inkubation beobachten Sie die Proben mit einem differentiellen Interferenzkontrast oder einem DIC-Mikroskop, das mit einer Digitalkamera bei 10-facher, 20-facher und 40-facher Vergrößerung ausgestattet ist.

Passen und optimieren Sie die Durchlichthelligkeit, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorblende in Echtzeit für jede Probe und erfassen Sie Bilder. Die frischen Samen der gebrochenen Früchte werden in ein Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit 1,5 Milliliter Desinfektionslösung überführt. Inkubieren Sie die Proben auf einem Orbitalschüttler bei 30 U/min für drei bis 50 Minuten bei Raumtemperatur.

Sobald der innerste Saatmantelumriss deutlich sichtbar ist, entsorgen Sie die Desinfektionslösung. Bei mittleren und späten Samen die Samen auf einen Objektträger übertragen. Verwenden Sie eine Pinzette und eine Seziernadel, um den Samenschleim unter 1x bis 4-facher Vergrößerung des Stereomikroskops zu entfernen.

Die Samen werden mit einer Pinzette wieder in das ursprüngliche Zentrifugenröhrchen überführt. Waschen Sie sie fünfmal in 1,5 Milliliter entionisiertem Wasser für jeweils 10 Sekunden und entsorgen Sie das entionisierte Wasser. Als nächstes fügen Sie das doppelte Volumen der Clearing-Lösung zu den Samen hinzu.

Abhängig von der Saatstufe geben Sie die intermittierende Vakuumbehandlung für null bis 50 Minuten, mit 10-Minuten-Intervallen nach jeder Vakuumbehandlung von 10 Minuten. Ersetzen Sie nach der Vakuumbehandlung die Clearing-Lösung. Um die Reinigung der Samen zu erleichtern, stellen Sie das Zentrifugenröhrchen 30 Minuten bis sieben Tage lang bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.

Bei späten Embryonen ersetzen Sie die Lösung täglich durch eine frische Reinigungslösung, gefolgt von einer Vakuumbehandlung der Samen für 10 Minuten. Legen Sie die gelöschten Samen auf den Objektträger oder den einzelnen konkaven Objektträger. Mit dem DIC-Mikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, können Sie die Helligkeit des Durchlichts, den DIC-Schieberegler und die Kondensatorapertur in Echtzeit für jede Probe einstellen und optimieren und das Bild aufnehmen.

Bei der herkömmlichen Methode zur Reinigung von S.lycopersicum-Samen blockierten die dichten Endospermzellen die Visualisierung früher Embryonen bei 3 und 6 DAF. Die verminderte Permeabilität während des Samenwachstums führte nach 9 DAF zu unscharfen Bildern. Der Samenschleim und die Samenhülle wurden allmählich dichter, wodurch das Eindringen von Klärmitteln ab 13 DAF verhindert wurde.

Die Umrisse des Embryos in 14 bis 19 DAF-Samen waren trotz der verlängerten Behandlungszeit von sieben Tagen extrem verschwommen. Die innere Struktur in 22 DAF-Samen war völlig unsichtbar. Der abgestreifte Samenmantelschleim, der von den epidermalen Zellen der Samenhülle produziert wurde, war ab 13 DAF prominent.

Die Natriumhypochlorit-Behandlung ermöglichte eine eindeutige Identifizierung der inneren Samenhülle und die Ablösung des größten Teils der anhaftenden Schleimstoffe ohne Samenschäden. Im optimierten Clearing-Protokoll zeigten die Samen in allen getesteten Entwicklungsstadien eine zufriedenstellende Transparenz. Die verschiedenen Zellschichten der Samenhülle bei 3 DAF, unterscheidbare Endospermzellen bei 5 DAF, der stabförmige Embryo bei sieben DAF, das kugelförmige Stadium bei 9 DAF und das Herzstadium bei 11 DAF wurden beobachtet.

Im optimierten Protokoll wurde der Grad der Kräuselung von Keimblättern und des apikalen Meristems in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung sehr leicht erfasst. Die Sterilisation entfernt Samenschleim und Samenhüllenpigment, was die Penetration und Visualisierung des Saatguts verbessert. Die Vakuumbehandlung kann das Eindringen von Reinigungslösungen beschleunigen.