Name: Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Erfahren Sie die etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus dem Mäuseuterus mittels enzymatischer und mechanischer Dissoziation. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung endometrialer Signalwege und Erneuerungsmechanismen.

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Wir danken Dr. Stephanie Pangas und Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) für die kritische Lektüre und Bearbeitung unseres Manuskripts. Die Studien wurden durch die Zuschüsse R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) und R01-HD110038 (M.M.M.) sowie durch NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123) unterstützt. Diana Monsivais, Ph.D. erhält einen Next Gen Schwangerschaftspreis des Burroughs Wellcome Fund.

Die Handhabung von Mäusen und experimentelle Studien wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt wurden, und gemäß den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Isolierung von Uterusepithel aus Mäusen mit enzymatischen und mechanischen Methoden
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um epitheliale Endometrium-Organoide von Mäusen unter Verwendung eines Gelmatrix-Gerüsts zu etablieren, zu passieren, einzufrieren und aufzutauen. Frühere Studien haben ergeben, dass während der Brunstphase4 optimale Kulturen von Endometrium-Organoiden der Maus aus Mäusen etabliert werden, was durch zytologische Untersuchung eines Vaginalabstrichs bestimmt werden kann15. Für alle Experimente wurden erwachsene weibliche WT-Mäuse (6-8 Wochen alt, Hybride C57BL/6J und 129S5/SvEvBrd) verwendet. Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC genehmigten Richtlinien mit Isofluran-Sedierung und anschließender zervikaler Disartikulation auf humane Weise eingeschläfert. Sobald die Mäuse eingeschläfert sind, sollten die folgenden Schritte befolgt werden. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .
<ol><li>Lassen Sie die Gelmatrix vor Gebrauch ca. 1-2 h auf Eis auftauen.</li>
	<li>Um die Maus zu sezieren, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt am Bauch zu machen, und schälen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealschicht hochzuhalten, und machen Sie seitliche Schnitte mit der Schere, um den Bauchinhalt freizulegen.<ol><li>Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben. Sezieren Sie sie, indem Sie sie zuerst an der zervikalen Verbindung halten und mit einer Schere entlang des Mesenterialfetts schneiden. Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn. HINWEIS: Halten Sie die Sterilität während der Zellisolierung aufrecht, indem Sie alle Operationswerkzeuge vor Gebrauch sterilisieren, den Mäusebauch mit 70% Ethanol besprühen und alle Schritte nach der Dissektion unter einer sterilen Gewebekulturhaube durchführen.</li>
	</ol></li>
	<li>Schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils ca. 4-5 mm groß sind.</li>
	<li>Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 ml 1% Trypsin enthält. Lassen Sie die enzymatische Lösung in das Uteruslumen eindringen, wodurch das Endometriumepithel vom darunter liegenden Stroma enzymatisch getrennt wird.</li>
	<li>Die 24-Well-Platte wird in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für ca. 1 h inkubiert.</li>
	<li>Nach der 1-stündigen Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35 mm große Gewebekulturplatte übertragen, die 1 ml Phosphat-gepufferte Lösung (DPBS) von Dulbecco enthält.</li>
	<li>Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine feine Pinzette und eine 1-ml-Pipette, um das Uterusepithel mechanisch von der Gebärmuttersonde zu trennen. Während Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette nach unten halten, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment und drücken Sie das Epithel aus dem anderen Ende der Gebärmutterröhre. Beobachten Sie die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop.</li>
	<li>Verwenden Sie die 1-ml-Pipette, um die Epithelschichten zu sammeln und vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zu überführen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Uterusfragmente und übertragen Sie alle Epithelblätter in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
	<li>Die dissoziierten Epithelschichten werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10x auf und ab, oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12 + 10% fetales Rinderserum (FBS) + Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g. HINWEIS: Weitere Informationen über das Breitbandantibiotikum, das für die Zellkultur verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.</li>
</ol>2. Verarbeitung des Stromakompartiments
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Protokolle beschrieben, die für die Isolierung des Stromakompartiments des Endometriums der Maus erforderlich sind. Angesichts des zunehmenden Interesses an epithelialen/stromalen Kokulturexperimenten ist es wichtig, neben den Epithelzellen, die Organoide erzeugen, auch die Stromazellpopulationen verarbeiten zu können.
<ol><li>Sobald das gesamte Epithel enzymatisch und mechanisch von den Uterusfragmenten getrennt wurde, sind die verbleibenden röhrenförmigen Strukturen die "stromalen / myometrischen" Kompartimente. Sammeln Sie dieses Gewebe in einer 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase in HBSS-Lösung.</li>
	<li>Die stroma-/myometriale Probe wird 15 Minuten lang auf einem 37 °C-Shaker inkubiert.</li>
	<li>Nach der Inkubation werden 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika pro Maus hinzugefügt und die nicht dissoziierten Fragmente durch einen 40 μm Zellfilter filtriert.</li>
	<li>Die Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Geben Sie die Mischung tropfenweise in 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika in eine 10 cm Zellkulturplatte. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank inkubiert.</li>
	<li>Um Kokulturen von Endometriumepithel- und Stromazellen der Maus zu erzeugen, sind die für menschliche Endometrium-Organoide beschriebenen Methoden unter Verwendung von gerüstfreien oder Kollagenmatrixsystemen 6,8 anzuwenden. HINWEIS: Obwohl diese Techniken noch nicht für Mäuse veröffentlicht wurden, können sie basierend auf den veröffentlichten Protokollen mit menschlichem Endometrium angepasst werden.</li>
</ol>3. Verkapselung von Uterusepithel in Gelmatrix zur Etablierung von Organoiden
HINWEIS: Bewahren Sie die Gelmatrix auf Eis auf, bis sie gebrauchsfertig ist.
<ol><li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen der Gelmatrix, das 20x so groß ist wie das des Zellpellets (d. h. wenn das Zellpellet 20 μl beträgt, resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl Gelmatrix). Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, um das Auftreten von Blasen zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie die Gelmatrix/Zellsuspension ~10 min bei Raumtemperatur einwirken.</li>
	<li>Sobald die Gelmatrix/Zellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer breiten 200-μl-Spitze, um 25 μl der Gelmatrix/Zellsuspension vorsichtig abzusaugen. Dosieren Sie drei separate 25-μl-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekulturinkubator aushärten.</li>
	<li>Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 μL Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrixkuppeln enthält. Inkubation bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekulturbrutscher. HINWEIS: Die Formulierung der organoiden Medien ist in der Materialtabelle angegeben. Organoide bilden sich typischerweise innerhalb von 4 Tagen nach der ersten Kultur.</li>
</ol>4. Genexpressionsanalyse von Endometrium-Organoiden nach Behandlung mit Östradiol
ANMERKUNG: In diesem Abschnitt werden die Methoden beschrieben, die zur Profilierung der Genexpression von Endometriumepithel-Organoiden mittels real-time qPCR nach Behandlung mit Östradiol verwendet werden (E2; siehe Tabelle 1). Da das Endometrium unter der zyklischen Kontrolle des Ovarialhormons E2 steht, ist das Testen der Reaktionsfähigkeit der Organoide auf E2 ein wichtiges Maß für die physiologische Funktion. Wir haben qualitativ hochwertige RNA erhalten und genügend mRNA generiert, um die Genexpression mittels qPCR und/oder RNA-Sequenzierung aus unseren Endometrium-Epithel-Organoiden zu profilieren. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Organoide gesammelt und für die nachgelagerte Analyse der Genexpression aufbereitet werden. Das gewählte Behandlungsmedium entspricht demjenigen, das zur Behandlung kultivierter Endometriumzellen verwendet wird. Es ist jedoch zu beachten, dass dieses Behandlungsmedium entsprechend optimiert werden kann, wie es bei der Behandlung von humanen Endometrium-3D-Kulturen mit den Hormonen 8,16,17 der Fall ist.
<ol><li>Kultur der Endometrium-Organoide wie oben beschrieben.</li>
	<li>Entfernen Sie das Organoidmedium und ersetzen Sie es vier Tage nach der Aussaat durch 750 μL Hungermedium. Über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie am nächsten Morgen das Hungermedium. Fügen Sie 750 μL Behandlungsmedium hinzu, das entweder Vehikel oder 10 nM E2 enthält. Inkubieren für 48 h.</li>
	<li>Fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers fort.</li>
</ol>5. Histologische Analyse von Endometrium-Organoiden
HINWEIS: Die Abbildung der morphologischen Merkmale von Endometrium-Organoiden ist entscheidend für die Beurteilung der zellulären Wirkung von Wachstumsfaktoren, genetischen Manipulationen oder niedermolekularen Inhibitoren. In diesem Abschnitt werden die Techniken beschrieben, die zur Fixierung, Verarbeitung und Abbildung von Endometriumepithelorganoiden unter Verwendung histologischer Färbungen und Antikörper-Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.
<ol><li>Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 1 mL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS enthalten. Legen Sie sie auf Eis.</li>
	<li>Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte ab, die die Organoide enthält.</li>
	<li>Übertragen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit einer geschnittenen Spitze 500 μL 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und lösen Sie die Gelmatrixdome vorsichtig vom Boden der Platte.</li>
	<li>Die gesamten Gelmatrixdome werden vorsichtig in die Pipettenspitze abgesaugt und in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.</li>
	<li>Fixieren Sie die Organoide, indem Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einen Rotator legen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 × g für 5 Minuten, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung vorsichtig mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. Waschen Sie die Organoide 2x mit 70% Ethanol.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle bis auf 50-100 μL Ethanol aus dem Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen beiseite.</li>
	<li>Legen Sie eine Tube Probenverarbeitungsgel für ~ 30 s in ein Wasserbad und in die Mikrowelle, um das Gel zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Probenverarbeitungsgel nicht überkocht, indem Sie die Konsistenz des Gels überwachen. HINWEIS: Sobald das Probenverarbeitungsgel geschmolzen ist, aber nicht kochend heiß, arbeiten Sie schnell, um die Organoide zu verkapseln.</li>
	<li>Übertragen Sie genügend Probenverarbeitungsgel, um die gesamte Oberfläche der Form (ca. 250 μL) zu bedecken.</li>
	<li>Während das Probenverarbeitungsgel noch geschmolzen ist, übertragen Sie schnell die 50 μL 70%ige Ethanollösung, die die Organoide enthält. Stellen Sie sicher, dass die Organoide versenkt oder in den unteren Teil der Form gedrückt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Histologieform auf einen Eimer Eis und lassen Sie das Probenverarbeitungsgel abkühlen und erstarren.</li>
	<li>Sobald das Probenverarbeitungsgel vollständig getrocknet ist, übertragen Sie das Probenverarbeitungsgel vorsichtig in einen Probenbeutel und behalten Sie die Ebene im Auge, in der sich die Organoide befinden.</li>
	<li>Legen Sie den Beutel in eine Histologiekassette und verarbeiten Sie ihn unter Verwendung von Standardmethoden, die für die Formalinfixierung und die Paraffineinbettung von Gewebenverwendet werden 18.</li>
	<li>Nach der Fixierung und Einbettung in Paraffin wird mit einem Mikrotom19 in 5-μm-Abschnitte geschnitten. Fahren Sie mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbungs- oder Immunfärbungsverfahren fort, wie unten beschrieben.</li>
</ol>6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung
<ol><li>Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie folgt: Xylol, 2 x 10 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 60% Ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in Hämatoxylin; Leitungswasser (3 x 5 s); 1 min in Eosin.</li>
	<li>Die Abschnitte wie folgt entwässern: 60% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; Xylol, 2 x 15 Min.</li>
	<li>Montage mit Montagemedium.</li>
</ol>7. Immunfluoreszenzfärbung
<ol><li>Entparaffinieren Sie die Abschnitte, wie in Schritt 6.1 beschrieben.</li>
	<li>Antigen-Retrieval durchführen<ol><li>Tauchen Sie die Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in einem mikrowellengeeigneten Behälter.</li>
		<li>Mikrowelle bei hoher Hitze für 20 Minuten in Intervallen von 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht überkocht.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem der 20-minütige Antigen-Retrieval-Schritt abgeschlossen ist, lassen Sie die Objektträger 40 Minuten lang auf Eis abkühlen, während sie noch in den Antigen-Retrieval-Puffer getaucht sind.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger mit 1x TBST für 3 min</li>
	<li>Blockieren Sie die Objektträger, indem Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in 3% BSA in TBST inkubieren.</li>
	<li>Inkubation mit primären Antikörpern<ol><li>Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, abhängig von Ab).</li>
		<li>Über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer brüten.</li>
		<li>3 x 5 min mit TBST waschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Inkubation von sekundären Antikörpern<ol><li>Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA (in TBST) (1:250) oder in 5% normalem Eselserum.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, da der Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Nukleare Färbung<ol><li>Verdünntes 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:1.000 in TBST.</li>
		<li>Inkubieren Sie für 5 min bei RT.</li>
		<li>2 x 5 min mit TBST waschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage<ol><li>Verwenden Sie einen Tropfen Montagemedium, um das Deckglas zu montieren.</li>
		<li>Versiegeln Sie das Deckglas am nächsten Tag mit Nagellack.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von Endometriumepithel-Organoiden aus dem Endometrium der Maus und die Protokolle, die routinemäßig für ihre nachgeschaltete Analyse verwendet werden. Endometrium-Organoide sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die Endometrium-bedingte Erkrankungen wie Endometriose, Endometriumkarzinom und Implantationsversagen kontrollieren. Bahnbrechende Studien, die 2017 veröffentlicht wurden, berichteten über die Bedingungen für die Kultivierung langfristige...

Das Endometrium - das innere Schleimhautgewebe der Gebärmutterhöhle - ist ein einzigartiges und hochdynamisches Gewebe, das eine entscheidende Rolle für die reproduktive Gesundheit einer Frau spielt. Während der reproduktiven Lebensspanne hat das Endometrium das Potenzial, Hunderte von Zyklen der Proliferation, Differenzierung und des Abbaus zu durchlaufen, die durch die konzertierte Wirkung der Eierstockhormone - Östrogen und Progesteron - koordiniert werden. Studien an gentechnisch veränderten Mäusen haben grundlegende biologische Mechanismen aufgedeckt, die der Reaktion der Gebärmutterschleimhaut auf Hormone und der Kontrolle der Embryoimplantation, der Stromazelldezidualisierung und der Schwangerschaft zugrunde liegen1. In-vitro-Studien waren jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung nicht transformierter primärer Endometriumgewebe der Maus in traditionellen 2D-Zellkulturen begrenzt 2,3. Jüngste Fortschritte in der Kultur von Endometriumgewebe als 3D-Organsysteme oder Organoide bieten eine neue Möglichkeit, biologische Signalwege zu untersuchen, die die Regeneration und Differenzierung von Endometriumzellen steuern. Endometrium-Organoidsysteme der Maus und des Menschen wurden aus reinem Endometriusepithel entwickelt, das in verschiedenen Matriceseingekapselt ist 4,5, während menschliches Endometrium als gerüstfreie epitheliale/stromale Co-Kulturen 6,7 und in jüngerer Zeit als kollagenverkapselte Epithel-/Stroma-Assembloide kultiviert wurde8 . Das Wachstum und das regenerative Potenzial von epithelialen Organoidkulturen wird durch einen definierten Cocktail aus Wachstumsfaktoren und niedermolekularen Inhibitoren unterstützt, die empirisch bestimmt wurden, um das Wachstum und die Regeneration der Organoide zu maximieren 4,5,9. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, Endometrium-Organoide einzufrieren und aufzutauen, die langfristige Einlagerung von Endometrium-Organoiden von Mäusen und Menschen für zukünftige Studien.
Gentechnisch veränderte Mäuse haben die komplexen Signalwege aufgedeckt, die die frühe Schwangerschaft und Dezidualisierung steuern, und wurden als Modelle für Schwangerschaftsverlust, Endometriumkarzinom und Endometriose verwendet. Diese genetischen Studien wurden weitgehend mit zellspezifischer Deletion von loxP-flankierten Allelen ("gefloxt") unter Verwendung von Cre-Rekombinasen erreicht, die spezifisch im weiblichen Fortpflanzungsgewebe aktiv sind. Zu diesen Mausmodellen gehören der weit verbreitete Progesteronrezeptor-cre 10, der eine starke Rekombinaseaktivität im Epithel- und Stromagewebe des Endometriums aufweist, Lactoferrin i-cre, das bei erwachsenen Mäusen eine endometriumepitheliale Rekombination induziert11, oder Wnt7a-cre, das eine epithelialspezifische Deletion in Müller-abgeleiteten Geweben auslöst12 . Die Kultivierung von Endometriumgewebe aus gentechnisch veränderten Mausmodellen als 3D-Organoide bietet eine hervorragende Möglichkeit, die Biologie des Endometriums zu untersuchen und die Identifizierung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen zu erleichtern, die die Erneuerung und Differenzierung von Endometriumzellen steuern13,14. Verfahren zur Isolierung und Kultur von Endometriumgewebe der Maus sind in der Literatur beschrieben und berichten über die Verwendung verschiedener enzymatischer Strategien zur Isolierung von Uterusepithel für die anschließende Kultivierung von Endometriumepithel-Organoiden4. Während die bisherige Literatur einen kritischen Rahmen für Endometriumepithel-Organoid-Kulturprotokolle 4,5,6 bietet, bietet diese Arbeit eine klare, umfassende Methode zur Generierung, Wartung, Verarbeitung und Analyse dieser Organoide. Die Standardisierung dieser Techniken ist wichtig, um den Fortschritt auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie von Frauen zu beschleunigen. Hier berichten wir über eine detaillierte Methodik zur enzymatischen und mechanischen Reinigung von Endometrium-Epithelgewebe der Maus für die anschließende Kultur von Endometrium-Organoiden in einem Gelmatrix-Gerüst. Wir beschreiben auch die Methoden für nachgeschaltete histologische und molekulare Analysen der Gelmatrix-verkapselten Maus-Endometrium-Epithel-Organoide.

<table><tbody><tr><td>Organoid Media Formulation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td><>Endkonzentration</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix, *LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>Trypsin aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; Nahrungsergänzungsmittel (50X), abzüglich Vitamin A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, -7 Inhibitor, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>rekombinantes humanes HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/</td></tr><tr><td>mLSonstige Verbrauchsmaterialien und Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>><Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Endkonzentration</td></tr><tr><td>Kollagenase aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ mL</td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Polystyrol-Mikrotiterplatten (24-Well)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Mikrotiterplatten aus Polystyrol (12 Well)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zellsiebe, 40 & Mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 & Mikro; g)</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, kein Phenolrot</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum, Holzkohle abgestreift</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldehyd 16% in wässrig Lösung, EM Grade</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia Kassette 1 geschlitzte Gewebekassetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Edelstahl-Einbettungs-Basisformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Nylon Biopsiebeutel</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Gel für die Probenverarbeitung</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y (gelblich) Lösung Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Puffer, 20X, pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat tribasisches Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI Lösung (1 mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>1:1000 Verdünnung</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Klarlack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger</td><td>Fisher Wissenschaftliche</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Brille</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antikörper (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>1:50 Verdünnung</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Anti-Ratte IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundär Antikörper, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>Esel Anti-Rabbin IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundär Antikörper, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td> 1<td>:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Inverses Routinemikroskop mit Digitalkamera</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Sequence</td><td>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Lactoferrin (Ltf)</td><td>TGAGGCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTTTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

etablierung von 3d-endometrium-organoiden aus der gebärmutter der maus

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometriumgewebe kleidet die innere Höhle der Gebärmutter aus und steht unter der zyklischen Kontrolle von Östrogen und Progesteron. Es ist ein Gewebe, das aus luminalem und Drüsenepithel, einem Stromakompartiment, einem vaskulären Netzwerk und einer komplexen Immunzellpopulation besteht. Mausmodelle waren ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Endometrium zu untersuchen und kritische Mechanismen aufzudecken, die Implantation, Plazenta und Krebs steuern. Die jüngste Entwicklung von 3D-Endometrium-Organoidkulturen stellt ein hochmodernes Modell dar, um die Signalwege zu analysieren, die der Biologie der Gebärmutterschleimhaut zugrunde liegen. Die Etablierung von Endometrium-Organoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen, die Analyse ihrer Transkriptome und die Visualisierung ihrer Morphologie in Einzelzellauflösung sind entscheidende Werkzeuge für die Erforschung von Endometriumerkrankungen. Dieser Artikel skizziert Methoden zur Etablierung von 3D-Kulturen von Endometriumepithel aus Mäusen und beschreibt Techniken zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der Histologie der Organoide. Ziel ist es, eine Ressource bereitzustellen, die zur Etablierung, Kultur und Untersuchung der Genexpression und morphologischen Eigenschaften von Endometriumepithel-Organoiden verwendet werden kann.

Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus Wir haben Organoide aus dem WT-Maus-Endometriumepithel etabliert, wie im beigefügten Protokoll beschrieben (siehe Diagramm in Abbildung 1). Nach der enzymatischen Dissoziation des Endometrialepithels der Maus wurden die Epithelschichten mechanisch von den Stromazellen der Gebärmutter getrennt und weiter mit Kollagenase dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Bei korrekter Durchführung sollte diese ...

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Schritt-für-Schritt-Methodik zur Isolierung von hochreinem Uterusepithel aus der Gebärmutter der Maus für die Kultur von Endometrium-Organoiden zeigt. Diese Methode nutzt effizient die enzymatische und mechanische Dissoziation, um das Uterusepithel zu isolieren. Die Techniken wurden optimiert, um Endometriumepithel-Organoide aus dem isolierten Epithel zu etablieren, zu behandeln und zu analysieren.Beginnen Sie mit dem Auftauen der Gelmatrix auf Eis für etwa ein bis zwei Stunden vor der Anwendung. Dann sezieren Sie die eingeschläferte Maus, indem Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt am Bauch machen und die Haut vorsichtig zurückziehen, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben und die Gebärmutterhörner an der Gebärmutterhalsverbindung halten, bevor Sie sie entlang des Mesenterialfetts schneiden.Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn. Sobald Sie fertig sind, schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils etwa vier bis fünf Millimeter groß sind. Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 Milliliter 1% Trypsin enthält.Inkubieren Sie dann die 24-Well-Platte in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für etwa eine Stunde, um das Endometriumepithel enzymatisch vom darunter liegenden Stroma zu trennen. Nach der Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35-Millimeter-Gewebekulturplatte übertragen, die einen Milliliter der phosphatgepufferten Dulbecco-Lösung (DPBS) enthält. Als nächstes trennen Sie das Uterusepithel unter einem Dissektionsmikroskop von der Gebärmutterröhre, indem Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette halten und die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment führen, wobei das Epithel aus dem anderen Ende des Uterusrohrs gedrückt wird.Beobachten Sie dann die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop. Als nächstes überführen Sie alle Epithelschichten vorsichtig mit der Ein-Milliliter-Pipette in dasselbe 1,5-Milliliter-Röhrchen. Und pelletieren Sie die dissoziierten Epithelschichten durch Zentrifugation bei 375 x g für fünf Minuten.Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Milliliter 2,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase plus zwei Milligramm pro Milliliter DNA-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10 Mal auf und ab oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist. Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter DMEM F / 12 plus 10% fötales Rinderserum oder FBS plus Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 375 x g.Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DMEM/F12 plus 10% FBS plus Antibiotika und zentrifugieren Sie die Zellen. Legen Sie die Gelmatrix auf Eis, bis sie fertig ist. Als nächstes entfernen Sie den Überstand aus den Zentrifugenzellen und resuspendieren Sie das Zellpellet mit dem 20-fachen Volumen der Gelmatrix, ohne die Blasen einzuführen.Lassen Sie die Gelmatrix-Zellsuspension ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Sobald die Gelmatrixzellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer 200-Mikroliter-Spitze mit breitem Durchmesser und saugen Sie vorsichtig 25 Mikroliter der Gelmatrixzellsuspension ab. Dosieren Sie drei separate 25-Mikroliter-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang aushärten und einen 37 Grad Celsius befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 Mikroliter Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrix-Kuppel enthält, und Inkubator bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus zeigten, dass die Trennung von Epithel- und Stromazellen Proben mit nicht mehr als 10% bis 15% Kontamination des entgegengesetzten Zelltyps ergab. Die Epithelzellen der Gebärmutterschleimhaut wurden innerhalb von drei bis vier Tagen zu Organoiden zusammengesetzt.Die in Formalin fixierten, paraffineingebetteten Endometrium-Organoide wurden durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen sichtbar gemacht, die die einzelne Schicht aus Epithel und Hohlzentren, die Lumen der Organoide, zeigten. Die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung zeigte, dass alle Zellen in den Organoiden Cytokeratin-8-positiv waren und DAPI enthielten, was darauf hindeutet, dass die Fixierung, Einbettung und Verarbeitung der Endometrium-Organoide mit der Antikörper-basierten Immunfärbung kompatibel ist. Die quantitative Echtzeit-PCR zeigte, dass die Stimulation mit 10 nanomolaren Östradiolen die Expression von Lipocalin 2, Lactoferrin und Progesteronrezeptor in den epithelialen Organoiden erhöhte, was darauf hindeutet, dass Endometriumepithel-Organoide erfolgreich verwendet werden können, um die Genexpressionsänderungen als Reaktion auf Östradiol zu messen.Es ist wichtig sicherzustellen, dass während des mechanischen Dissoziationsschritts eine klare Trennung des Endometriumepithels erreicht wird. Man sollte in der Lage sein, Epithel zu beobachten, das aus der Eileiter austritt. Andere Methoden umfassen die Etablierung der epithelialen Organoide durch Verkapselung in eine Gelmatrix.Falls gewünscht, kann das Stromakompartiment weiter verdaut werden, um 3D-epitheliale Stroma-Kokulturen zu erzeugen. Die Methode kann helfen, Fragen zu den Signalen zu beantworten, die die Erneuerung der Gebärmutterschleimhaut steuern. Es könnte helfen, Krankheiten bei Frauen wie Endometriose, Schwangerschaftsverlust und Krebs zu behandeln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

Viele Nagetiermodelle der Endometriose sind durch technische Komplexität, Reproduzierbarkeit und/oder den Bedarf an immungeschwächten Tieren oder speziellen Reportermäusen begrenzt. Wir präsentieren ein vereinfachtes System der Läsionsinduktion mit jeder experimentellen Maus mit einem unabhängig überprüfbaren, objektiven Scoring-System und ohne Notwendigkeit für Ovariektomie oder Überlebensoperation.

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In dieser Studie wird ein neuartiges Mausmodell vorgestellt, das speziell zur Simulation von Endometriomen, einem klinisch signifikanten Subtyp der Endometriose, entwickelt wurde. Durch die Verwendung von C57BL/6J-Mäusen zielt das Modell darauf ab, die pathophysiologischen Mechanismen aufzuklären, die der endometriombedingten Unfruchtbarkeit zugrunde liegen, und bietet ein verfeinertes Werkzeug, um die derzeitige Wissenslücke in der Reproduktionsmedizin zu schließen.

Etablierung eines experimentellen Mausmodells des Endometrioms zur Untersuchung der damit verbundenen Unfruchtbarkeit

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von endometriumen epithelialen Stammzellen (reESCs) von Ratten vor, um endometriale Organoide von Ratten zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht In-vitro-Studien von Endometriumerkrankungen und ermöglicht die Genom-Editierung und andere zelluläre Manipulationen.

Generierung und Charakterisierung von Organoiden der Gebärmutter von Ratten aus endometrialen epithelialen Stammzellen der Ratte

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Etablierung eines Mausmodells für dünnes Endometrium

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Dieses Protokoll beschreibt eine definierte, hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung menschlicher Brustorganoide, die zentrale Merkmale der Mammarienmorphogenese in einem kontrollierten dreidimensionalen Kultursystem nachbilden.

Eine definierte hydrogelbasierte Methode zur Erzeugung dreidimensionaler menschlicher Brustorganoide, die die Mammarienmorphogenese rekapitulieren

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Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

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