Name: Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie die digitale Tröpfchen-PCR zur präzisen Quantifizierung zirkulärer RNAs in C2C12-Zellen. Diese Methode ermöglicht sensitive circRNA-Analysen ohne Housekeeping-Gen-Kontrolle für molekulardiagnostische Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Institute of Life Sciences, das DBT-Forschungsstipendium (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) und das Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] unterstützt, das an Amaresh C. Panda vergeben wurde. Wir danken anderen Labormitgliedern für das Korrekturlesen des Artikels.

RNA ist empfindlich gegenüber RNasen; Daher sollten alle Reagenzien, Instrumente und Arbeitsbereiche RNase-frei sein und mit Sorgfalt behandelt werden.
1. Divergentes Primerdesign für circRNA (siehe Abbildung 1)
<ol><li>Rufen Sie die reife Sequenz aus circRNA-Annotationsdaten mit BEDTools oder aus dem UCSC-Genombrowser ab, indem Sie die Exon/Intron-Sequenz zwischen den Backspleißverbindungskoordinaten18,19 verbinden.</li>
	<li>Bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten circRNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der circRNA-Sequenz10 verbinden. HINWEIS: Wenn die circRNA-Länge weniger als 200 Nukleotide beträgt, teilen Sie sie in zwei gleiche Hälften und verbinden Sie die Nukleotide von der letzten Hälfte bis zum Anfang der ersten Hälfte.</li>
	<li>Verwenden Sie die obige Vorlagensequenz für das Primer-Design, indem Sie das Primer3-Webtool verwenden und eine PCR-Produktlänge von 120-180 Nukleotiden in der Länge20 einstellen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Standardeinstellungen von Primer3 für andere Parameter wie Tm und Primerlänge. Die Primersequenzen für circBnc2 sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Bestellen Sie die divergenten Primersequenzen für die Synthese bei einem beliebigen oligosynthetisierenden Unternehmen.</li>
</ol>2. RNA-Isolierung
HINWEIS: Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den C2C12-Zellen der Maus mit handelsüblichen Kits oder einer internen RNA-Isoliermethode. Die hier verwendete hauseigene RNA-Isolierungsmethode wurde bereits21 beschrieben. Die magnetischen Kieselsäurekügelchen werden im Labor unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Protokolls22 hergestellt. Diese magnetischen Perlen können auch von verschiedenen Anbietern bezogen werden.
<ol><li>Nehmen Sie eine 10-cm-Schale mit etwa 5 x 106 proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und einem 4-tägigen differenzierten C2C12-Myoröhrchen zur RNA-Isolierung.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 ml 1x PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette.</li>
	<li>Die Zellen in 1 ml 1x PBS mit einem Zellschaber abkratzen, bei 4 °C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren und PBS mit einer Pipette entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml RNA-Isolierreagenz (RIR) hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren21.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μL (1/5 des Volumens von RIR) Chloroform und Wirbel für 15 s hinzu. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4 °C für 10 min bei 12.000 x g.</li>
	<li>Nehmen Sie 400 μL der oberen wässrigen Schicht, laden Sie sie auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für 1 min bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss in ein neues Röhrchen und fügen Sie 600 μL 100% Ethanol hinzu.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL magnetische Kieselsäurekügelchen hinzu und legen Sie das Röhrchen für 5 min auf einen Thermomixer, der auf 25 °C und 1.200 U/min eingestellt ist. HINWEIS: Das Perlenvolumen kann je nach anfänglicher Zellzahl für die Lyse erhöht oder verringert werden. Magnetische Kieselsäureperlen können von kommerziellen Anbietern bezogen werden.</li>
	<li>Legen Sie das Röhrchen für 30 s auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar ist. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in einem 500 μL Waschpuffer mit 90% Ethanol. Legen Sie das Rohr für 30 s auf den Magnetständer. Drehen Sie das Rohr zweimal auf dem Magnetständer, um die Perlen zu waschen. Lassen Sie die Perlen sich in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.9 zweimal. Nach dem Waschen das Röhrchen kurz umdrehen und für 30 s wieder auf den Magnetstativ legen. Entsorgen Sie den restlichen Waschpuffer. Trocknen Sie das Röhrchen bei 50 °C für 3 min an der Luft auf einem Thermomixer und halten Sie den Deckel offen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 μL nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. HINWEIS: Das RNA-Elutionsvolumen kann auf 10 μL reduziert werden, um die RNA-Konzentration zu erhöhen.</li>
	<li>Stellen Sie die Röhrchen für 2-3 min bei Raumtemperatur. Legen Sie das Rohr wieder auf den Magnetständer und lassen Sie es 30 s sitzen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer. HINWEIS: RNA kann bei −20 °C oder −80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. Um ein optimales Ergebnis zu erzielen, wird empfohlen, am nächsten Tag mit dem Schritt der cDNA-Synthese fortzufahren.</li>
</ol>3. cDNA-Synthese
<ol><li>Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie 1 μg RNA für die cDNA-Synthese.</li>
	<li>Mischen Sie 1 μg Gesamt-RNA mit 1 μL dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 4 μL 5x Reverse-Transkriptase (RT)-Puffer, 2 μL 10x RT-Zufallsprimer, 0,25 μL reverses Transkriptase-Enzym (200 U/μL) und 0,5 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL) und bilden das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf bis zu 20 μL. HINWEIS: Das Enzymvolumen der reversen Transkriptase kann abhängig von der anfänglichen RNA-Konzentration für die cDNA-Synthese verändert werden.</li>
	<li>Klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Reaktion zu mischen und kurz zu drehen. Stellen Sie das Röhrchen 10 min bei 25 °C, gefolgt von 1 h bei 50 °C.</li>
	<li>Um das Enzym zu inaktivieren, stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei 85 °C.</li>
	<li>Kühlen Sie das Röhrchen in Eis für 2 min und fügen Sie 480 μL nukleasefreies Wasser in das Röhrchen hinzu, um die cDNA-Konzentration auf 2 ng / μL zu erhöhen. HINWEIS: cDNA kann bei -20 °C gelagert oder sofort für die dd-PCR-Analyse verwendet werden.</li>
</ol>4. Workflow für die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR)
HINWEIS: Der Workflow der dd-PCR umfasst mehrere Schritte, beginnend mit der Probenvorbereitung, gefolgt von der Tröpfchenerzeugung, PCR-Amplifikation, Tröpfchenzählung und Datenanalyse. Jeder Schritt ist entscheidend für die genaue Datengenerierung, da dd-PCR die absolute Quantifizierung von Produkten beinhaltet und keine Standardkurve benötigt. Daher wurde jeder der verschiedenen Schritte der dd-PCR im Folgenden beschrieben.
<ol><li>Vorbereitung der dd-PCR-Reaktion.<ol><li>Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 μL in 0,2 ml PCR-Röhrchen oder -Streifen zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und NTC-Röhrchen (Non-Template-Control) ein. HINWEIS: Jedes unterschiedliche divergente Primerpaar für den Nachweis verschiedener circRNAs muss zusammen mit Testproben eine NTC-Reaktion aufweisen.</li>
		<li>Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix (z. B. EvaGreen Supermix) und 11 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen einzurichten. HINWEIS: Tauen Sie den dd-PCR-Master-Mix bei Raumtemperatur auf, gefolgt von einem kurzen Wirbel, um eine homogene Mischung zu erhalten. Verwenden Sie das gleiche nukleasefreie Wasser, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen und die NTC-Röhrchen einzurichten, die zum Verdünnen der cDNA verwendet wurden.</li>
		<li>Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten. HINWEIS: Verdünnen Sie die vorwärts- und rückwärts zirkulären RNA-spezifischen divergenten Primer von 100 μM Stamm und mischen Sie, um eine Arbeitskonzentration von 1 μM vorwärts und umgekehrt circRNA-Primermischung herzustellen; Somit beträgt die endgültige Primerkonzentration 250 nM in der 22 μL-Reaktion.</li>
		<li>Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Mastermix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) hinzu, um die Testreaktionsröhrchen einzurichten.</li>
		<li>Anschließend werden alle Reaktionsröhrchen kurz zentrifugiert, um ein homogenes Reaktionsgemisch am Boden der Röhrchen zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Tröpfchenerzeugung.<ol><li>Das 20 μL PCR-Gemisch aus 0,2 mL PCR-Röhrchen in die Probenvertiefungen der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.</li>
		<li>Geben Sie 70 μL Tröpfchenerzeugungsöl vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorkartusche. HINWEIS: Inkubieren Sie das Tröpfchenöl vor Gebrauch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit der Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöl-Tröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR-Amplifikation.<ol><li>40 μL der Probenöl-Tröpfchenmischung aus den Tröpfchenmulden der Tröpfchengeneratorkartusche auf eine 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette übertragen. HINWEIS: Übertragen Sie die Proben-Öl-Tröpfchenmischung vorsichtig, während Sie durch die Spitzen der Mehrkanalpipette einen Winkel zu den Vertiefungen bilden, um zu vermeiden, dass die Tröpfchen beim Übertragen auf die dd-PCR 96-Well-Platte gebrochen werden.</li>
		<li>Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler, legen Sie sie in den auf 80 °C vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf die Versiegelung der PCR-Platte.</li>
		<li>Legen Sie nun die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie das Programm wie in Tabelle 2 beschrieben ein, wobei die Deckeltemperatur auf 105 °C und eine Rampenrate von 2 °C/s eingestellt ist.</li>
	</ol></li>
	<li>Tröpfchenzählung.<ol><li>Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen.</li>
		<li>Öffnen Sie die Tropfenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie Eingaben für die Probeninformationen geben.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Setup-Option. Klicken Sie dann auf die Vorlagenoption , um eine neue Vorlage zu öffnen.</li>
		<li>Definieren Sie jede Vertiefung, indem Sie die Details des Experiments angeben, z. B. Probenname (verwendete cDNA oder Negativkontrolle oder NTC), Zielname (circRNA-Primername) und Typ (unbekannt) und Experimenttyp als ABS (absolute Quantifizierung) und Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) usw.</li>
		<li>Speichern Sie abschließend die Vorlage und starten Sie den Lauf, indem Sie auf die Ausführungsoption klicken und die Zählung nach Zeile oder Spalte auswählen. Lassen Sie die Maschine die Tröpfchenzählung abschließen, die etwa 1 Minute / Well dauert.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren , um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche 1D-Amplitude , um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen</li>
		<li>Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel. HINWEIS: Die Gesamtzahl der Tröpfchen in jeder Probe sollte über 10.000 liegen, um für die absolute Quantifizierung berücksichtigt zu werden. Der NTC sollte keine positiven Tröpfchenzahlen aufweisen. Das Vorhandensein positiver Tröpfchen im NTC weist auf eine Kontamination der Reagenzien oder eine Amplifikation der Primer-Dimere hin. Es ist schwierig herauszufinden, ob die positiven Tröpfchen Primer-Dimere oder unspezifische Produkte in NTC enthalten. Es wird empfohlen, die Primer zu überprüfen und eine Kontamination der Reagenzien als allgemeine Praxis für jede PCR einschließlich dd-PCR zu vermeiden.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren , um die circRNA-Zähldaten als .csv Datei zu exportieren. Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der in jeder Probe vorhandenen circRNAs.</li>
		<li>Berechnen Sie manuell die Anzahl der circRNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die CircRNA-Forschung ist in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien gewachsen. Daher wurde es als potenzielles Molekül für zukünftige RNA-Therapeutika angesehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass es als Biomarker bei mehreren Krankheiten wirkt, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4,8. Die Identifizierung von circRNA ist jedoch aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig und sie hat nur eine spezifi...

Jüngste Fortschritte bei RNA-Sequenzierungstechnologien und neuartigen Computeralgorithmen haben ein neues Mitglied der wachsenden Familie nicht-kodierender RNAs entdeckt, die als zirkuläre RNA (circRNA)1 bezeichnet wird. Wie der Name schon sagt, sind circRNAs eine Familie von einzelsträngigen RNA-Molekülen ohne freie Enden. Sie werden durch nicht-kanonisches Kopf-zu-Schwanz-Spleißen gebildet, das als Back-Splicing bezeichnet wird, bei dem sich die vorgeschaltete Spleißakzeptorstelle kovalent mit der nachgeschalteten Spleißspenderstelle verbindet, um einen stabilen RNA-Kreis 1,2 zu bilden. Dieser Prozess könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, einschließlich invertierter Alu-Repetitionselemente, die im Upstream und Downstream von zirkularisierten Exons vorhanden sind, oder kann durch einige Spleißfaktoren oder RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt werden2,3. Zirkuläre RNAs, die ausschließlich aus der exonischen oder intronischen Sequenz erzeugt werden, werden als exonische circRNA und zirkuläre intronische RNAs oder ci-RNAs klassifiziert, während einige exonische circRNAs das Intron behalten und als Exon-Intron-circRNAs (EIcircRNAs) bezeichnet werden3,4. Die Funktionen von circRNAs sind vielfältig, einschließlich der Schwammbildung von miRNA und/oder RBP, der Regulierung der Transkription und der Regulierung der zellulären Funktion durch Übersetzung in Peptide 3,5,6,7. Mehrere Berichte haben die Bedeutung von circRNAs bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Prozessen hervorgehoben8. Darüber hinaus machen gewebespezifische Expressionsmuster und Resistenz gegen Exonuklease-Verdauung es zu einem funktionellen Biomarker für die Krankheitsdiagnostik und kann auch als geeignetes therapeutisches Ziel verwendet werden8. In Anbetracht seiner Bedeutung für die Regulierung von Gesundheit und Krankheiten ist die genaue Quantifizierung der circRNA-Expression das Gebot der Stunde.
Mehrere biochemische Methoden wurden entwickelt, um circRNAs in biologischen Proben zu quantifizieren9. Eine der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur circRNA-Quantifizierung ist die reverse Transkription gefolgt von einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung divergenter Primerpaare10. Die Mehrheit der circRNAs ist jedoch im Vergleich zu linearen mRNAs in geringer Häufigkeit, was es schwierig macht, sie zu quantifizieren11. Um dieses Problem zu lösen, haben wir versucht, die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zu verwenden, um die Anzahl der circRNAs in einer bestimmten Probe genau zu quantifizieren. Die dd-PCR ist eine fortschrittliche PCR-Technologie, die dem Prinzip der Mikrofluidik folgt. es erzeugt mehrere wässrige Tröpfchen in Öl, und die PCR tritt in jedem Tröpfchen als individuelle Reaktion auf12. Die Reaktion erfolgt in einzelnen Tröpfchen und wird mit einem Tröpfchenleser analysiert, der die Anzahl der positiven oder negativen Tröpfchen für das interessierende Gen12 angibt. Es ist die empfindlichste Technik, um ein Gen von Interesse genau zu quantifizieren, auch wenn es nur eine einzige Kopie in einer bestimmten Probe gibt. Verminderte Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, bessere Präzision und das Weglassen des Referenzgens für die Quantifizierung machen es vorteilhafter als herkömmliche qPCR13,14,15. Es wurde häufig als Forschungs- und Diagnosewerkzeug für die absolute Quantifizierung eines interessierenden Gensverwendet 16,17. Hier beschreiben wir das detaillierte dd-PCR-Protokoll für die circRNA-Quantifizierung bei der Differenzierung von C2C12-Myotuben der Maus und proliferierenden C2C12-Myoblasten der Maus unter Verwendung divergenter Primer.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml Mikrozentifugenröhrchen</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml Röhrchenstreifen mit Kappe</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Filterspitzen</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNasefreies destilliertes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Zelle Abstreifer</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Verdünnungsmittel</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Murine RNase Inhibitor</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverse Transkriptase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad 1864033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tröpfchenerzeugungsöl für Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Plate Heat Seal, Folie, durchstechbar</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen und Dichtungen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Kartusche Halter</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Tröpfchengenerator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well Platten</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler mit 96&ndash; Deep Well Reaktionsmodul</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Silica Säule</td><td>Umbrella Life Science</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Genome Browser</td><td></td><td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

quantifizierung zirkulärer rnas mittels digitaler tröpfchen-pcr

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Die digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd-PCR) ist eine der empfindlichsten Quantifizierungsmethoden; Es fraktioniert die Reaktion in fast 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen, und die PCR tritt in den einzelnen Tröpfchen auf. Die dd-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen real-time qPCR, einschließlich einer erhöhten Genauigkeit bei der Erkennung von Zielen mit geringer Abundanz, dem Weglassen von Referenzgenen für die Quantifizierung, der Eliminierung technischer Replikate für Proben und der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Inhibitoren in den Proben. In jüngster Zeit hat sich die dd-PCR zu einer der beliebtesten Methoden zur genauen Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA für die Genexpressionsanalyse und -diagnostik entwickelt. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine große Familie von kürzlich entdeckten kovalent geschlossenen RNA-Molekülen ohne 5' und 3' Enden. Es wurde gezeigt, dass sie die Genexpression regulieren, indem sie als Schwämme für RNA-bindende Proteine und microRNAs fungieren. Darüber hinaus werden circRNAs in Körperflüssigkeiten sezerniert, und ihre Resistenz gegen Exonukleasen macht sie zu Biomarkern für die Krankheitsdiagnose. Dieser Artikel soll zeigen, wie divergentes Primer-Design, RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und dd-PCR-Analyse durchgeführt werden können, um spezifische zirkuläre RNA (circRNA) -Spiegel in Zellen genau zu quantifizieren. Abschließend demonstrieren wir die genaue Quantifizierung von circRNAs mittels dd-PCR.

Die absolute Anzahl der circRNAs in jeder Probe kann aus den exportierten dd-PCR-Daten abgeleitet werden. Die quantitative PCR-Analyse in Echtzeit deutete auf eine differentielle Expression von circBnc2 in den differenzierten C2C12-Myotuben hin (Daten nicht gezeigt). Hier wollten wir die absolute Kopienzahl von circBnc2 in proliferierenden C2C12-Myoblasten und Myotuben überprüfen. Da die Expression von circBnc2 unter zwei Bedingungen verglichen wird, ist es sehr wichtig, alle Proben für RNA-Iso...

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR ist eine hochempfindliche und genaue Methode zur absoluten Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA. Es wurde für die Diagnose von Krankheiten verwendet, wo andere konventionelle Methoden keine genauen Ergebnisse liefern. dd-PCR ist die empfindlichste Technik zum Nachweis von sehr wenig vorkommenden Nukleinsäuremolekülen.Im Gegensatz zur quantitativen PCR erfordert die dd-PCR keine Genkontrolle für die Quantifizierung. Aufgrund seiner Empfindlichkeit und Genauigkeit kann dd-PCR als Werkzeug für die molekulare Diagnostik und Forschung mit RNA-Molekülen mit geringer Häufigkeit wie Mikro-RNAs und zirkulären RNAs verwendet werden. Vor der Verwendung von dd-PCR sollte man RT-PCR oder RT-qPCR durchführen, um zu bestätigen, dass die Primer ihre Zielgene ohne unspezifische PCR-Amplifikation amplifizieren.Um zu beginnen, bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten zirkulären RNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der zirkulären RNA-Sequenz verbinden. Verwenden Sie die Vorlagensequenz für den Primer, die vom Webtool Primer 3 entworfen wurde. Nehmen Sie eine 10-Zentimeter-Schale mit etwa 5 Millionen proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und eine viertägige differenzierte C2C12-Myoröhre zur RNA-Isolierung.Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Milliliter 1X PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Isolierreagenz hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform und Wirbel für 15 Sekunden hinzu.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 12.000 G.Nehmen Sie 400 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht, laden Sie es auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für eine Minute bei 12.000 G bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss zu einem neuen Rohr und fügen Sie 600 Mikroliter 100% Ethanol hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter magnetische Kieselsäureperlen hinzu und legen Sie die Tube fünf Minuten lang auf einen Thermomixer, der auf 25 Grad Celsius und 1.200 U/min eingestellt ist.Dann legen Sie das Röhrchen für 30 Sekunden auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar wird. Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in 500 Mikroliter Waschpuffer, der 90% Ethanol enthält. Nachdem Sie das Rohr 30 Sekunden lang auf den Magnetständer gelegt haben, lassen Sie die Perlen in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.Trocknen Sie das Rohr drei Minuten lang an der Luft auf einem Thermomixer an der Luft und halten Sie den Deckel offen. Fügen Sie 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer.Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie ein Mikrogramm RNA für die cDNA-Synthese. Mischen Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA mit einem Mikroliter dNTP-Mix, vier Mikroliter 5X Reverse-Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter 10X Reverse Transkriptase Random Primer, 0,25 Mikroliter Reverse Transkriptase Enzym und 0,5 Mikroliter RNase Inhibitor. Füllen Sie das Volumen auf 20 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser.Stellen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf 25 Grad Celsius, gefolgt von 50 Grad Celsius für eine Stunde. Dann stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf 85 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 Mikrolitern in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen oder -Streifen ein, zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und Nicht-Template-Kontrollröhrchen.Fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten. Um die Reagenzgläser einzurichten, fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter cDNA hinzu. Für die Tröpfchenerzeugung werden 20 Mikroliter der PCR-Mischung aus 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen in die Probentöpfe der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.Geben Sie 70 Mikroliter Tröpfchenöl vorsichtig mit einer Pipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorpatrone. Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit einer Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöltröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird. Zur PCR-Amplifikation werden 40 Mikroliter der Probenöltröpfchenmischung aus den Tröpfchenquellen der Tröpfchengeneratorkartusche mit einer Pipette auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen.Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler. Legen Sie es in den auf 180 Grad Celsius vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf das Siegel zum Verschließen der PCR-Platte. Legen Sie dann die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius und eine Rampenrate auf zwei Grad Celsius pro Sekunde ein.Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen. Öffnen Sie die Tröpfchenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie die Probeninformationen eingeben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1D-Amplitude, um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen. Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um die zirkulären RNA-Zähldaten als CSV-Datei zu exportieren.Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der zirkulären RNAs, die in jeder Probe vorhanden sind. Berechnen Sie manuell die Anzahl der zirkulären RNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird. Die Datenanalyse mit QuantaSoft Software wird hier gezeigt.Alle Proben außer MT1 zeigten mehr als 12.000 Tröpfchenzahlen. Da die Gesamttropfenzahl in MT1 niedrig war, wurde diese Stichprobe für die abschließende Datenanalyse nicht berücksichtigt. Interessanterweise gab es einen deutlichen Unterschied im Expressionsmuster von Circ B und C2 in der viertägigen differenzierten Myotube-Erkrankung im Vergleich zu den Myoblastenzellen.Die Analyse der Circ B- und C2-Häufigkeit in Bezug auf die Kopienzahl zeigte, dass die drei Replikate von C2C12-Myoblasten 76,8, 67 und 46 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen, während die beiden Myotube-Proben 558 und 610 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen. Die Daten im Balkendiagramm stellen den Mittelwert plus minus Standardabweichung von zwei bis drei biologischen Replikaten dar. ddPCR ist eine der fortschrittlichsten Methoden, um die genaue differentielle Expression von zirkulärer Ziel-RNA zu messen.Diese Methode wird ein wesentliches Instrument sein, um die zirkuläre RNA-Forschung und die diagnostische Industrie im kommenden Jahr zu beschleunigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von emulgierten Nanotröpfchen zum Nachweis von Zielnukleinsäuren durch digitale Polymerase-Kettenreaktion oder dPCR.

Tröpfchen-Digitalpolymerase-Kettenreaktion: Eine Methode zur Erzeugung von Nanotröpfchen-PCR-Reaktionen zum Nachweis seltener Tumormutationen

Wir beschreiben einen digitalen Endpunkt-Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten (analogen) Auslesung. Wir messen die Massenfluoreszenz von tröpfchenbasierten digitalen Assays mit einem Standard-qPCR-Gerät anstelle von speziellen Instrumenten und bestätigen unsere Ergebnisse durch Mikroskopie.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von tumorsomatischen Mutationen in zirkulierender DNA in biologischen Flüssigkeiten (Biofluide) vor. Unsere Droplet-Methode zur digitalen Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ermöglicht die Quantifizierung der Tumormutations-Allelfrequenz (MAF) und ermöglicht eine minimalinvasive Ergänzung zur Diagnose und zeitlichen Überwachung der Tumorreaktion.

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Circular RNAs (circRNAs) sind nicht-kodierende RNAs, die eine Rolle bei der Transkriptionsregulation und der Vermittlung von Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen können. Nach Der Bewertung verschiedener Parameter für den Aufbau von CircRNA-Sequenzierungsbibliotheken wurde ein Protokoll unter Verwendung der gestrandeten Gesamt-RNA-Bibliotheksvorbereitung mit RNase R-Vorbehandlung erstellt und hier vorgestellt.

Identifizierung von kreisförmigen RNAs mittels RNA-Sequenzierung

Diese Arbeit fasst Schritte zur Entwicklung verschiedener Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis unter Verwendung eines zweifarbigen ddPCR-Systems zusammen. Die Schritte sind ausgeklügelt und es wurden Hinweise zur Verbesserung der Assays und der Versuchsleistung beigefügt. Diese Assays können für mehrere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Anwendungen verwendet werden.

Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der absoluten mitochondrialen (mt)DNA-Kopienzahl und der mtDNA-Deletionsheteroplasmie in einzelnen Zellen vor.

Messung der einzelligen mitochondrialen DNA-Kopienzahl und Heteroplasmie mittels digitaler Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Die genaue Quantifizierung von Vektorgenomkopien des Adeno-assoziierten Virus (AAV) ist von entscheidender Bedeutung, aber ein standardisiertes Protokoll muss noch etabliert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine validierte Methode zur Aufbereitung gereinigter AAV-Proben und zur Durchführung einer digitalen Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd_PCR), um den viralen Genomtiter zuverlässig zu quantifizieren.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Diese Studie präsentiert eine robuste Methode zur Isolierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraneinsätze, wodurch die Trennung von totalen Neuronen versus Neuriten und RNA-Reinigung ermöglicht wird. In Kombination mit RTddPCR ermöglicht der Ansatz eine absolute Quantifizierung von Low-Copy-Transkripten, was Studien zum mRNA-Transport und der lokalen Übersetzung mit hoher Sensitivität, Reproduzierbarkeit und breiter experimenteller Anwendbarkeit erleichtert.

Isolierung und Quantifizierung axonaler mRNAs mittels poröser Membraninserts und RTddPCR

Erfahren Sie die digitale Tröpfchen-PCR zur präzisen Quantifizierung zirkulärer RNAs in C2C12-Zellen. Diese Methode ermöglicht sensitive circRNA-Analysen ohne Housekeeping-Gen-Kontrolle für molekulardiagnostische Forschung.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

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