Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

dd-PCR ist eine hochempfindliche und genaue Methode zur absoluten Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA. Es wurde für die Diagnose von Krankheiten verwendet, wo andere konventionelle Methoden keine genauen Ergebnisse liefern. dd-PCR ist die empfindlichste Technik zum Nachweis von sehr wenig vorkommenden Nukleinsäuremolekülen.

Im Gegensatz zur quantitativen PCR erfordert die dd-PCR keine Genkontrolle für die Quantifizierung. Aufgrund seiner Empfindlichkeit und Genauigkeit kann dd-PCR als Werkzeug für die molekulare Diagnostik und Forschung mit RNA-Molekülen mit geringer Häufigkeit wie Mikro-RNAs und zirkulären RNAs verwendet werden. Vor der Verwendung von dd-PCR sollte man RT-PCR oder RT-qPCR durchführen, um zu bestätigen, dass die Primer ihre Zielgene ohne unspezifische PCR-Amplifikation amplifizieren.

Um zu beginnen, bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten zirkulären RNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der zirkulären RNA-Sequenz verbinden. Verwenden Sie die Vorlagensequenz für den Primer, die vom Webtool Primer 3 entworfen wurde. Nehmen Sie eine 10-Zentimeter-Schale mit etwa 5 Millionen proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und eine viertägige differenzierte C2C12-Myoröhre zur RNA-Isolierung.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Milliliter 1X PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette. Fügen Sie einen Milliliter RNA-Isolierreagenz hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform und Wirbel für 15 Sekunden hinzu.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 12.000 G.Nehmen Sie 400 Mikroliter der oberen wässrigen Schicht, laden Sie es auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für eine Minute bei 12.000 G bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss zu einem neuen Rohr und fügen Sie 600 Mikroliter 100% Ethanol hinzu. Fügen Sie 20 Mikroliter magnetische Kieselsäureperlen hinzu und legen Sie die Tube fünf Minuten lang auf einen Thermomixer, der auf 25 Grad Celsius und 1.200 U/min eingestellt ist.

Dann legen Sie das Röhrchen für 30 Sekunden auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar wird. Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in 500 Mikroliter Waschpuffer, der 90% Ethanol enthält. Nachdem Sie das Rohr 30 Sekunden lang auf den Magnetständer gelegt haben, lassen Sie die Perlen in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.

Trocknen Sie das Rohr drei Minuten lang an der Luft auf einem Thermomixer an der Luft und halten Sie den Deckel offen. Fügen Sie 20 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer.

Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie ein Mikrogramm RNA für die cDNA-Synthese. Mischen Sie ein Mikrogramm Gesamt-RNA mit einem Mikroliter dNTP-Mix, vier Mikroliter 5X Reverse-Transkriptase-Puffer, zwei Mikroliter 10X Reverse Transkriptase Random Primer, 0,25 Mikroliter Reverse Transkriptase Enzym und 0,5 Mikroliter RNase Inhibitor. Füllen Sie das Volumen auf 20 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser.

Stellen Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf 25 Grad Celsius, gefolgt von 50 Grad Celsius für eine Stunde. Dann stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf 85 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 Mikrolitern in 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen oder -Streifen ein, zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und Nicht-Template-Kontrollröhrchen.

Fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten. Um die Reagenzgläser einzurichten, fügen Sie 11 Mikroliter dd-PCR-Mastermix, 5,5 Mikroliter zirkuläre RNA-spezifische Vorwärts- und Rückwärtsprimermischung mit einer Mikromolkonzentration und 5,5 Mikroliter cDNA hinzu. Für die Tröpfchenerzeugung werden 20 Mikroliter der PCR-Mischung aus 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen in die Probentöpfe der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.

Geben Sie 70 Mikroliter Tröpfchenöl vorsichtig mit einer Pipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorpatrone. Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit einer Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöltröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird. Zur PCR-Amplifikation werden 40 Mikroliter der Probenöltröpfchenmischung aus den Tröpfchenquellen der Tröpfchengeneratorkartusche mit einer Pipette auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen.

Versiegeln Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler. Legen Sie es in den auf 180 Grad Celsius vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf das Siegel zum Verschließen der PCR-Platte. Legen Sie dann die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius und eine Rampenrate auf zwei Grad Celsius pro Sekunde ein.

Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen. Öffnen Sie die Tröpfchenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie die Probeninformationen eingeben. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren, um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche 1D-Amplitude, um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen. Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren, um die zirkulären RNA-Zähldaten als CSV-Datei zu exportieren.

Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der zirkulären RNAs, die in jeder Probe vorhanden sind. Berechnen Sie manuell die Anzahl der zirkulären RNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird. Die Datenanalyse mit QuantaSoft Software wird hier gezeigt.

Alle Proben außer MT1 zeigten mehr als 12.000 Tröpfchenzahlen. Da die Gesamttropfenzahl in MT1 niedrig war, wurde diese Stichprobe für die abschließende Datenanalyse nicht berücksichtigt. Interessanterweise gab es einen deutlichen Unterschied im Expressionsmuster von Circ B und C2 in der viertägigen differenzierten Myotube-Erkrankung im Vergleich zu den Myoblastenzellen.

Die Analyse der Circ B- und C2-Häufigkeit in Bezug auf die Kopienzahl zeigte, dass die drei Replikate von C2C12-Myoblasten 76,8, 67 und 46 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen, während die beiden Myotube-Proben 558 und 610 Kopien pro Nanogramm RNA aufwiesen. Die Daten im Balkendiagramm stellen den Mittelwert plus minus Standardabweichung von zwei bis drei biologischen Replikaten dar. ddPCR ist eine der fortschrittlichsten Methoden, um die genaue differentielle Expression von zirkulärer Ziel-RNA zu messen.

Diese Methode wird ein wesentliches Instrument sein, um die zirkuläre RNA-Forschung und die diagnostische Industrie im kommenden Jahr zu beschleunigen.