Sammlung von Alfalfa-Wurzelexsudaten zur Untersuchung des Einflusses von Di(2-ethylhexyl)phthalat auf die Metabolitenproduktion
2. Juni 2023
Die Sekretion von Wurzelexsudaten ist in der Regel eine externe Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne durch eine nicht zielgerichtete metabolomische Analyse bewertet werden kann.
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen von Xenobiotika auf Luzerne während einer nicht zielgerichteten Metabolomik-Analyse bewertet werden können. Die Technik ist sehr einfach und bequem zu bedienen und es können mehr Arten von Wurzelexsudaten identifiziert werden. Dies hilft, den metabolomischen Fingerabdruck von Pflanzenwurzelexsudaten zu konstruieren.
Beginnen Sie die Sterilisation der Medicago sativa- oder Luzernesamen, indem Sie die Samen 10 Minuten lang mit 0,1 % Natriumhypochlorit abspülen. Anschließend 30 Minuten lang mit 75%igem Ethylalkohol waschen. Spülen Sie die sterilisierten Samen anschließend mehrmals mit destilliertem Wasser ab.
Und keimen Sie dann auf dem feuchten Filterpapier, das in eine sterile Petrischale gelegt wird. Bei 30 Grad Celsius im Dunkeln. Nach der Keimung 20 gleichmäßig gekeimte, große, pralle Samen in einen Pfropfkorb in einer mit Nährlösung gefüllten Kulturflasche geben.
Stellen Sie alle Kulturflaschen in eine Wachstumskammer mit kontrollierten Bedingungen. Übertragen Sie nach zwei Wochen 15 einheitliche Luzerne-Sämlinge in eine neue Glasflasche, um sie für das Kulturexperiment einem Milligramm pro Kilogramm und 10 Milligramm pro Kilogramm DEHP-Stress auszusetzen. Wickeln Sie die Behandlungs- und Kontrollglasflaschen mit Aluminiumfolie und Parafilm ein, um eine Photolyse und Verflüchtigung des DEHP zu verhindern.
Ergänzen Sie die Nährlösung täglich, um den Flüssigkeitsstand aufrechtzuerhalten. Platzieren und drehen Sie die Flaschen alle zwei Tage nach dem Zufallsprinzip, um konsistente Wachstumsbedingungen für die Luzerne-Sämlinge zu gewährleisten. Entfernen Sie nach sieben Tagen Anbau die Luzerne-Sämlinge aus den Flaschen.
Und waschen Sie sie mehrmals mit Reinstwasser, um sie auf die Sammlung von Wurzelausscheidungen vorzubereiten. Beginnen Sie das Experiment zur Sammlung von Wurzelexsudat, indem Sie 10 gleichmäßige Luzernesämlinge in Zentrifugenröhrchen geben, die mit 50 Millilitern sterilisiertem deionisiertem Wasser gefüllt sind. Um Wurzelausscheidungen zu sammeln, halten Sie die Schläuche sechs Stunden lang aufrecht und tauchen Sie die Wurzeln in Wasser.
Wenn Sie fertig sind, wickeln Sie die Zentrifugenröhrchen mit Alufolie ein, um die Wurzeln vor Licht zu schützen. Entfernen Sie die Pflanzen und gefrieren Sie die gesammelte Flüssigkeit für die Erstellung von Metabolitenprofilen. Fahren Sie mit dem Extraktionsexperiment fort, indem Sie den gefriergetrockneten Proben 1,8 Milliliter Extraktionslösung hinzufügen.
30 Sekunden im Wirbel. Wenden Sie anschließend die Ultraschallwellen 10 Minuten lang in einem Eiswasserbad auf die Röhren an. Vor dem Zentrifugieren der Proben.
200 Mikroliter Überstand vorsichtig in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen umfüllen. Saugen Sie 45 Mikroliter Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen ab und mischen Sie es mit einem Endvolumen von 270 Mikrolitern in Qualitätskontroll- oder QC-Proben. Sobald Sie fertig sind, gefrieren Sie die Extrakte in einem Vakuumkonzentrator.
Sobald die Trocknung abgeschlossen ist, fügen Sie fünf Mikroliter interne Standard-Ribonuklease hinzu und trocknen Sie weiter. Nach dem Verdampfen werden 30 Mikroliter Methoxyaminierungshydrochloridlösung hinzugefügt und die Röhrchen 30 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert. Als nächstes fügen Sie den Proben 40 Mikroliter BSTFA-Reagenz hinzu, bevor Sie die Röhrchen für 1,5 Stunden zur Derivatisierung bei 70 Grad Celsius platzieren.
Sobald die Inkubation beendet ist und die derivatisierte Probe Raumtemperatur erreicht hat, fügen Sie den derivatisierten Proben fünf Mikroliter in Chloroform gelöste Fettsäuremethylester hinzu. Mit einer Kapillarsäule von 30 mal 250 Mikrometern mal 0,25 Mikrometer trennen Sie einen Mikroliter der Wurzelexsudate mit einem Trägergas Helium bei einem Durchfluss von 1,0 Milliliter pro Minute. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 280 Grad Celsius ein.
Und halten Sie die Temperatur der Transferleitung bei 280 Grad Celsius. Stellen Sie das Ofenprogramm auf Trennung ein. Nach dem Trennen der Extrakte wird eine Massenspektrometrie im Elektronenkollisionsmodus mit einer Energie von minus 70 Elektronenvolt durchgeführt.
Halten Sie die Temperatur der Ionenquelle bei 250 Grad Celsius. Erfassen Sie Massenspektren mit dem Full-Scan-Überwachungsmodus mit einem Massenscanbereich von 50 bis 500 Masse durch Ladung bei einer Rate von 12,5 Spektren pro Sekunde. 778 Peaks wurden im Chromatographen der Kontrollprobe nachgewiesen.
Davon wurden 314 Metaboliten anhand der Massenspektren identifiziert. Die Säuren wurden weiter unterteilt in Fettsäuren, Aminosäuren, organische Säuren und Phenolsäuren. Darüber hinaus wurden auch einige gängige Substanzen, die im Allgemeinen in den Wurzelexsudaten vorhanden sind, in Luzernewurzelexsudaten nachgewiesen, darunter Pyrimidine, Hydroxypyrimidine, Flavonoide, Phenole, Ketone, Pyrimidine und Diterpene.
Basierend auf dem VIP-Score wurde eine Heatmap erstellt, um die Variation der differentiellen Metaboliten zwischen verschiedenen DEHP-Behandlungen zu visualisieren. Im Vergleich zu den Kontrollproben veränderte die DEHP-Exposition den Gehalt an 50 Metaboliten und Luzernewurzelexsudaten signifikant. Enthält hauptsächlich einige Kohlenhydrate und niedermolekulare organische Säuren.
Die Analyse der Stoffwechselwege zeigte, dass DEHP den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, die das Produkt der Photosynthese sind, signifikant hemmt, was darauf hindeutet, dass DEHP die Photosynthese von Luzerne bis zu einem gewissen Grad unterdrücken kann. DEHP fördert den Stoffwechsel von Fettsäuren, die helfen, Stress durch DEHP zu widerstehen. Zumindest die Samenwurzelexsudate sollten für jede Behandlung durchgeführt werden, um eine genaue Analyse der metabolomischen Daten zu gewährleisten. Wir können differentielle Metabolisierungen bestimmen und die wichtigen Regeln im Umweltverhalten von Schadstoffen weiter untersuchen.
Die Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und der weiteren biologischen Gemeinschaft können vor allem mit dieser Methode entschlüsselt werden.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Beurteilung der Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne mithilfe einer nicht gezielten metabolomischen Analyse. Es unterstreicht die Bedeutung von Wurzelexsudaten als Entgiftungsstrategie für Pflanzen unter Stressbedingungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Pflanzenbiologie
- Metabolomik
- Umweltstressantworten
Hintergrund
- Wurzelexsudate spielen eine entscheidende Rolle bei der Wechselwirkung von Pflanzen mit ihrer Umwelt.
- Xenobiotika können die Pflanzengesundheit und den Stoffwechsel beeinflussen.
- Mittels nicht-zielgerichteter Metabolomik lässt sich ein umfassendes Profil der Metabolite erstellen.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann die landwirtschaftliche Praxis verbessern.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von Xenobiotika auf Luzerne.
- Identifizierung verschiedener Typen von Wurzelexsudaten.
- Erstellung eines metabolomischen Fingerabdrucks von Pflanzen-Wurzelexsudaten.
Verwendete Methoden
- Sterilisation von Alfalfa-Samen mit Natriumhypochlorit und Ethylalkohol.
- Spülen der Samen mit destilliertem Wasser nach der Sterilisation.
- Anwendung von nicht-zielgerichteten metabolomischen Analysemethoden.
- Identifizierung von Metaboliten in Wurzelexsudaten.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung verschiedener Wurzelausscheidungen.
- Erkenntnisse über die Entgiftungsmechanismen von Luzerne.
- Erstellung eines metabolomischen Profils für zukünftige Forschungsarbeiten.
- Nachweis der Wirksamkeit der Methode bei der Bewertung von Pflanzenreaktionen auf Xenobiotika.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um Pflanzenreaktionen auf Umweltstressfaktoren zu untersuchen.
- Wurzelausscheidungen sind entscheidend für das Verständnis der Pflanzengesundheit unter Stressbedingungen.
- Dieser Ansatz kann auf andere Pflanzenarten angewendet werden, um umfassendere Erkenntnisse zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Das nicht gezielte Metabolom-Profil von Wurzelexsudaten von Luzerne unter DEHP-Belastung ermöglicht eine mechanistische Risikominderung von Pflanze-Umwelt-Wechselwirkungen, die für agrochemische und umweltbiotechnologische Verfahren relevant sind. Die quantitative Analyse differenzieller Metaboliten stützt die Vorhersagegenauigkeit bezüglich Stressreaktionswegen und unterstützt die frühe Entdeckung sowie translationsorientierte Forschung zu den Auswirkungen xenobiotischer Stoffe. Dieser Arbeitsablauf etabliert die Metabolomik von Wurzelexsudaten als wiederverwendbare Methode zur gesamtheitlichen Bewertung von Pflanzenresilienz und Entgiftungsstrategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung pflanzlicher Entgiftungspfade als Reaktion auf die Exposition gegenüber Xenobiotika.
- Unterstützt die funktionelle Validierung stressinduzierter metabolischer Verschiebungen an der Wurzel-Boden-Grenzfläche.
- Erleichtert eine vorhersagebasierte Zuverlässigkeit bei der Identifizierung zentraler Metaboliten und Stoffwechselwege für weitere Studien.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt validierte metabolomische Fingerabdrücke für vergleichende Analysen in nachfolgenden Untersuchungen.
- Standardisiert die Sammlung von Wurzelexsudaten und die GC-TOF-MS-Messung, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erzeugt quantitative Ergebnisse, die sich für den Hochdurchsatz-Screening von Umweltstressfaktoren eignen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt Metabolitenveränderungen mit der Entdeckung umweltbezogener Biomarker, um die translationale Kontinuität sicherzustellen.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kandidatenansätzen zur Minderung von Stress.
- Liefert mechanistische Einblicke in Pflanze-Umwelt-Wechselwirkungen, die für eine nachhaltige Landwirtschaft relevant sind.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess, der von der frühen Hypothesenprüfung pflanzlicher Stressantworten bis hin zur Identifizierung führender metabolischer Biomarker und der präklinischen Validierung von Entgiftungsmechanismen reicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die hypothesengeleitete Analyse der Zusammensetzung von Wurzelausscheidungen unter definiertem xenobiotischem Stress.
- Screening: Erstellt reproduzierbare, quantitative Metabolitenprofile für den vergleichenden Bedingungsvergleich.
- Analytik: Liefert datenreiche GC-TOF-MS-Daten und bioinformatische Auswertungen zur Zuordnung von Stoffwechselwegen.
- Translationale Forschung: Verbindet metabolomische Veränderungen mit Umwelt-Biomarker-Strategien, sofern durch die Weganalysen gestützt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Workflow, der auf andere Pflanzensysteme und Stressfaktoren übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit bezüglich der Mechanismen der Pflanzen-Stressantwort und die Validierung von Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Bietet standardisierte, skalierbare und reproduzierbare metabolomische Arbeitsabläufe.
- Strategischer Wert: Unterstützt Entscheidungen über die Durchführung oder Unterlassung von Maßnahmen zur Minderung ökologischer Risiken und zur Förderung der Widerstandsfähigkeit von Kulturpflanzen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Studien zu Pflanzen-Umwelt-Interaktionen innerhalb von Forschungs- und Entwicklungsprogrammen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der pflanzlichen Metabolomik und in der Bedienung von GC-TOF-MS-Geräten.
- Benötigt eine leistungsfähige analytische Infrastruktur für die Hochdurchsatzverarbeitung von Proben und die Datenanalyse.
- Setzt eine standardisierte Probensammlung und Dateninterpretation über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus.
- Kann mit Optimierung des Protokolls auf verschiedene pflanzliche Modelle und Umweltstressfaktoren übertragen werden.
- Hängt von strenger Reproduktion und Qualitätskontrolle ab, um zuverlässige Metabolomik-Ergebnisse zu erzielen.
