Name: Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Erfahren Sie die orthotope Injektionstechnik für GEM-abgeleitete Glioblastomzellen in immunkompetente Mäuse. Dieses reproduzierbare Modell ermöglicht die Evaluation therapeutischer Strategien gegen Tumorwachstum und Invasion.

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Wir danken Herrn Alan E. Kulaga für die hervorragende technische Unterstützung und Frau Michelle L. Gumprecht für die Verfeinerung der Operationstechniken. Wir danken Dr. Philip L. Martin für die Analyse der Pathologie und Frau Lilia Ileva und Dr. Joseph Kalen vom Frederick National Laboratory Small Animal Imaging Program für MRT-Scans.
Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, unter der Vertragsnummer HHSN261201500003I finanziert. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Ministeriums für Gesundheit und Soziale Dienste wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.

Das hier beschriebene Studienprotokoll wurde vom NCI des Frederick Animal Care and Use Committee genehmigt. NCI-Frederick ist von AAALAC International akkreditiert und befolgt die Richtlinien des öffentlichen Gesundheitsdienstes für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Verfahren, die im "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (National Research Council, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).
1. Vorbereitung der Zellen für die Injektion
HINWEIS: Die für dieses Modell verwendeten Hirntumor-Primärzellen (MBRs) der Maus wurden ursprünglich aus Tamoxifen-induzierten TRP-GEM-Mäusen isoliert, wie in El Meskini et al.5 beschrieben. Details zur Zellpräparation finden Sie in dieser Referenz.
<ol><li>Führen Sie die folgenden Schritte mit steriler Technik in einer Biosicherheitswerkbank durch.</li>
	<li>Kultur von primären Hirntumorzellen in vitro , bis sie die exponentielle Wachstumsphase erreichen.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen in 0,25% Trypsin, und sobald sie sich gelöst haben, verdünnen Sie sie mit Wachstumsmedium, um das Trypsin zu inaktivieren.</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g und waschen Sie sie mit serumfreien Medien. Wiederholen Sie dies einmal, bevor Sie zählen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen manuell oder mit einem automatischen Zellzähler. Resuspendieren Sie die Zellen in 5%iger steriler Methylcellulose in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in der gewünschten Konzentration, basierend auf einem endgültigen Injektionsvolumen von 2 μl. Die gewünschte Zellkonzentration kann je nach Zelllinie und Hirntumormodell variieren. Für GBM GEM TRP-Zellen injizieren wir 2 μl einer 25 x 106-Zellen /ml-Lösung oder 50.000 Zellen.</li>
</ol>2. Mäusestamm
<ol><li>Züchten oder kaufen Sie einen geeigneten Mausstamm, der dem Stammhintergrund der Hirntumorzellen entspricht. Verwenden Sie für TRP-Zellen 9 Wochen alte B6D2F1/J-Mäuse (aus einer Kreuzung zwischen C57BL/6J [B6]-Weibchen und DBA/2J [D2]-Männchen) als Tumorzellempfänger.</li>
</ol>3. Einrichten des Operationsbereichs
HINWEIS: Alle chirurgischen Schritte werden mit aseptischer Technik in einer sauberen, desinfizierten Umgebung durchgeführt. Peelings und persönliche Schutzausrüstung, einschließlich einer Maske, sollten vom Chirurgen getragen werden. Chirurgische Instrumente müssen vor der Verwendung hitzesterilisiert werden.
<ol><li>Platzieren Sie den Oberflächenschutz unter dem stereotaktischen Gerät und auf der Arbeitsfläche.</li>
	<li>Befestigen Sie den Vinylschlauch des Anästhesiegeräts am IN-Anschluss der Gasanästhesieplattform des stereotaktischen Geräts und einen weiteren Schlauch am OUT-Anschluss.</li>
	<li>Schließen Sie die Digitalanzeige an eine Stromquelle und an das Gerät an.</li>
	<li>Schließen Sie die Mikropumpensteuerung (Abbildung 1A) an eine Stromquelle an und schließen Sie die Mikropumpe (Abbildung 1A) an den Manipulatorarm des Geräts an (siehe auch Herstelleranweisungen).</li>
	<li>Stellen Sie die Mikropumpe für die Volumeninjektion von 2.000 nL auf 5,6 nL/s ein.</li>
	<li>Schalten Sie den Heißperlensterilisator ein.</li>
	<li>Schließen Sie das Mausheizkissen an den Temperaturregler an und schließen Sie es an eine Stromquelle an. Stellen Sie den Teller auf das Bühnenpodest. Stellen Sie die Plattentemperatur auf 37 °C ein.</li>
	<li>Legen Sie eine 30-g-Präzisionsspritze zurück und achten Sie darauf, keine Blasen einzuführen. Setzen Sie den Kolben ein und befestigen Sie die Nadel. Achten Sie darauf, die Nadel nur an der Nabe zu fassen. Drücken Sie den Kolben, bis ein Tropfen der Methylcellulose-Zellmischung durch die Nadel abgegeben wird. Reinigen Sie die Nadel mit einem Vorbereitungspad mit 70 % Alkohol, indem Sie die Seiten der Nadel vorsichtig abwischen oder ein steriles Mullkissen auf die Arbeitsfläche legen und abtupfen. Achten Sie darauf, die Nadel nicht zu verbiegen oder zu brechen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Präzisionsspritze an der Mikropumpe und drehen Sie den Manipulatorarm vom Tisch weg, um ein Verschieben der Spritzennadel zu verhindern, bevor Sie die Maus auf den Tisch setzen.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Maus auf die Operation
<ol><li>Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in die Induktionskammer legen, wobei der Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % eingestellt ist, oder gemäß den institutionellen Richtlinien. Schalten Sie den Isofluranfluss zum Nasenkegel ein.</li>
	<li>Setzen Sie die Maus in die stereotaktische Apparatur ein und befestigen Sie sie am Nasenkegel, wobei die oberen Zähne auf der Nasenkonusstütze positioniert werden (Abbildung 1B, 9). Ziehen Sie den Knopf am Nasenkonus fest, um ihn zu befestigen (Abbildung 1B). Stellen Sie ein angemessenes Maß an Anästhesie sicher, indem Sie einen Zehenkneifen durchführen, um den Reflex zu überprüfen.<ol><li>Überwachen Sie die Ohren, Füße und Schleimhäute auf Farbe (rosa), um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Überwachen Sie auch die Atemfrequenz (ein Anstieg oder eine Abnahme könnte darauf hindeuten, dass der Isofluranspiegel angepasst werden muss).</li>
	</ol></li>
	<li>Setzen Sie die Ohrbügel (Abbildung 1B) in beide Ohren ein und ziehen Sie den Knopf fest, um den Kopf zu sichern.</li>
	<li>Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen zu befeuchten, während die Maus unter Narkose steht.</li>
	<li>Verwenden Sie eine gebogene Pinzette, um die Haare auf dem Kopf der Maus auf einen Bereich zu zupfen, der etwa 150 % größer ist als der geplante Schnitt, um ausreichende aseptische Bedingungen zu gewährleisten.</li>
	<li>Injizieren Sie 0,5-1 mg/kg Buprenorphin SR-Analgesie subkutan oder verwenden Sie ein anderes im Protokoll zugelassenes Analgetikum.</li>
	<li>Positionieren Sie die Rektalsonde der Maus, um die Innentemperatur zu überwachen und eine Unterkühlung aufgrund der Anästhesie zu verhindern. Halten Sie die Körpertemperatur der Maus zwischen 36,5 und 38,5 °C.</li>
	<li>Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit nach außen gerichteten Kreisen und wechseln Sie dreimal zwischen einem chirurgischen Peeling und Ethanol.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette straff und machen Sie mit der Skalpellklinge einen Schnitt von ca. 1 cm, beginnend zwischen den Augen. Das Bregma sollte durch den Schnitt sichtbar sein. Anmerkungen: Berühren Sie die Operationsstelle für eine ordnungsgemäße sterile Technik nur mit den Spitzen sterilisierter Werkzeuge und legen Sie die Werkzeugspitzen nur auf eine sterile Oberfläche (z. B. das Innere eines autoklavierten Werkzeugpakets).</li>
	<li>Verwenden Sie das hölzerne Ende des Applikators mit Wattespitze, um überschüssiges Bindegewebe abzukratzen, und dann das Baumwollende eines anderen Applikators zum Trocknen.</li>
</ol>5. Zellinjektion
<ol><li>Ziehen Sie den Manipulatorarm mit dem Spritzenaufsatz über die Maus und ziehen Sie den Knopf fest, um ihn zu sichern. Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe in der horizontalen Ebene, um die Spritzenhalterung über Bremma zu bewegen. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf ab, um die Bregma-Position zu bestätigen. Stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.</li>
	<li>Verwenden Sie die X- und Y-Knöpfe und die entsprechende Digitalanzeige, um die Nadel in die gewünschte Position zu bringen. Für die Lage der kortikalen Rinde sind die entsprechenden Koordinaten 3 mm posterior, 2 mm lateral rechts von der Bremma und 2 mm tief von der Dura mater. Verwenden Sie den Z-Knopf, um die Nadel auf die Oberfläche des Schädels zu bewegen.</li>
	<li>Punktieren Sie ein Loch in den Schädel mit einer 1-ml-Spritze und einer angebrachten 25-G-Nadel. Setzen Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung der 30-G-Präzisionsspritze und -nadel und drehen Sie den Manipulatorarm vorsichtig zur Seite. Rollen Sie die Nadel mit Daumen und Finger langsam und mit leichtem Druck hin und her, bis die Nadelspitze gerade noch die Schädeldecke durchsticht.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Applikator mit Wattestäbchenspitze, um jegliches Blut aus dem Nadelloch abzutupfen. Bringen Sie den Manipulatorarm wieder in die entsprechende Position, wobei sich die Präzisionsspritzennadel über dem Loch befindet. Richten Sie die Nadelspitze am Loch aus, senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf auf die Gehirndura ab und stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null.</li>
	<li>Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf um 1 mm ab und warten Sie dann 1 Minute. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Tiefe erreicht ist (2 mm wie angegeben). Anmerkungen: Die Nadel wird langsam abgesenkt, um eine zusätzliche Schädigung des umgebenden Hirngewebes und einen Rückfluss der Zelllösung zu vermeiden.</li>
	<li>Starten Sie die Mikropumpe und überwachen Sie dann, ob die Pumpe stoppt, wenn 2 μl injiziert wurden. Dieser Vorgang sollte bei der angegebenen Geschwindigkeit etwa 6 Minuten dauern. Warten Sie dann 1 Minute, bevor Sie die Nadel bewegen.</li>
</ol>6. Entfernen der Nadel und Wundverschluss
<ol><li>Heben Sie die Nadel 1 mm an und warten Sie dann 1 Min. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Nadel vollständig frei vom Schädel ist.</li>
	<li>Verwenden Sie bei Bedarf einen Applikator mit Wattespitze, um Blut von der Injektionsstelle wegzutupfen.</li>
	<li>Nehmen Sie mit dem hölzernen Ende eines Applikators mit Wattestäbchen ein kleines Stück Knochenwachs (~1 mm) und formen Sie es zu einem Kegel. Setze es in die Öffnung im Schädel ein und drücke das Wachs in das Loch.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Pinzette mit einem Perlensterilisator und verwenden Sie sie, um das restliche Wachs auf dem Schädel zu schmelzen und zu glätten.</li>
	<li>Geben Sie etwa zwei Tropfen Bupivacain-Lösung (Anästhesie) in den Schnitt und ziehen Sie die Hautränder mit einer Pinzette zusammen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Haut straff und platzieren Sie ein oder zwei Wundclips, um die Haut zu schließen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in einen sauberen Erholungskäfig auf einem Heizkissen in einem zugfreien Bereich und beobachten Sie die Maus genau. Lassen Sie die Maus vollständig aus der Narkose aufwachen und ihre normale Aktivität wieder aufnehmen, bevor Sie sie wieder in die normale Unterbringung zurückbringen.</li>
	<li>Kontrollieren Sie die Maus täglich nach dem chirurgischen Eingriff und führen Sie eine Schmerzbehandlung gemäß den institutionellen Richtlinien durch.<ol><li>Wenn Buprenorphin SR (Schritt 4.6) zur Analgesie verwendet wird, hält die Retardformel 72 h an. Wiederholen Sie die Injektion nur, wenn nach 72 h sichtbare Schmerzen oder Beschwerden vorhanden sind. Bei korrekter Durchführung erholen sich die Mäuse gut von den intrakraniellen Injektionen und eine zusätzliche Analgesie ist nicht erforderlich.</li>
		<li>Entfernen Sie die Klammern 7-10 Tage nach der Operation.</li>
	</ol></li>
	<li>Überwachen Sie das Tumorwachstum durch Bildgebung von Tieren (MRT).<ol><li>Einschläfern Sie die Mäuse ein, wenn humane Endpunkte erreicht sind (d. h. wenn das Tier 20 % Körpergewicht verliert oder unterkühlt wird).</li>
		<li>Aufgrund der invasiven Natur dieser Hirntumore sollten die Mäuse auf neurologische Symptome wie ungleichmäßiger Gang, teilweise Lähmung, Drehen oder Kopfneigung beobachtet werden. Euthanasieren Sie eine Maus, wenn eines dieser klinischen Anzeichen eines fortgeschrittenen Tumorwachstums beobachtet wird.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTamimi%2C+AF+%22Glioblastoma%22">Glioblastoma</a>. , (2017).</li>
<li>Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+and+tools+to+tackle+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Experimental models and tools to tackle glioblastoma.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).</li>
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<li>Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Models+of+Experimental+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Mouse Models of Experimental Glioblastoma.</a> Gliomas. , Exon Publications. (2021).</li>
<li>Zalles, M., Towner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-Clinical+Models+and+Potential+Novel+Therapies+for+Glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Gliomas%22%5BJournal%5D)">Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas.</a> Gliomas. , Exon Publications. 1-13 (2021).</li>
<li>Wierzbicki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+therapeutic+monitoring+of+H3K27M-mutant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma.</a> Current Oncology Reports. 22 (2), 19(2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Präklinische Modelle sind essentiell für die Evaluierung neuer therapeutischer Zielstrukturen und neuartiger Behandlungsstrategien bei GBM. Gentechnisch veränderte Mausmodelle für GBM haben den Vorteil, dass Tumore an der autochthonen Stelle auftreten, aber oft mit einer langen Latenz und einem unvorhersehbaren Tumorwachstum13. Die Tumore des GEM-Modells weisen eine Latenz von 4-5 Monaten auf, und das ideale Zeitfenster für Bildgebung, Rekrutierung und Behandlung ist zwischen den einzelnen Mäusen ...

Das Glioblastom (GBM; Gliom Grad IV) ist der häufigste und bösartigste Hirntumor, und die derzeitigen Therapien sind unwirksam, was zu einer medianen Überlebenszeit von 15 Monaten führt1. Zuverlässige und genaue präklinische Modelle, die die komplexen Signalwege darstellen, die am Wachstum und der Pathogenese von Hirntumoren beteiligt sind, sind unerlässlich, um den Fortschritt bei der Bewertung neuer Therapieschemata für GBM zu beschleunigen. Mausmodelle, in denen humane Hirntumorzelllinien subkutan in immungeschwächte Mäuse implantiert werden, spiegeln weder die native Immunumgebung von Hirntumoren wider, noch können sie verwendet werden, um die Fähigkeit von Therapeutika zu bewerten, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden2. Idealerweise sollten präklinische Mausmodelle auch die humane GBM-Histopathologie genau reproduzieren, einschließlich der hohen Invasivität in das umgebende Parenchym3. Obwohl gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) Tumore im Kontext eines intakten Immunsystems entwickeln, sind oft komplizierte Zuchtschemata erforderlich, und Tumore können sich langsam und uneinheitlich entwickeln4. GEM-abgeleitete Allotransplantatmodelle eignen sich besser für präklinische therapeutische Studien, bei denen große Kohorten von tumortragenden Mäusen in kürzerer Zeit benötigt werden.
In einem früheren Bericht haben wir ein orthotopes GBM-Mausmodell beschrieben, das direkt von GEM-Tumoren abgeleitet wurde. Die Tumorgenese im GEM wird durch genetische Ereignisse in Zellpopulationen (hauptsächlich Astrozyten) initiiert, die das gliale fibrilläre saure Protein (GFAP) exprimieren und zu einer Progression zu GBM führen. Diese TRP-GEMs beherbergen ein TgGZT121-Transgen (T), das T121 nach Exposition gegenüber der GFAP-getriebenen Cre-Rekombinase exprimiert. Die Expression des T121-Proteins führt zu einer Unterdrückung der Aktivität des Rb-Proteins (Rb1, p107 und p103). Die Co-Expression eines GFAP-getriebenen Cre-Transgens (GFAP-CreERT2) zielt auf die Expression adulter Astrozyten nach Induktion mit Tamoxifen ab. TRP-Mäuse beherbergen auch eine Cre-abhängige Mutante Kras (KrasG12D; R)-Allel, das die Aktivierung des Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwegs darstellt, und sind heterozygot für den Verlust von Pten(P)5,6. Gleichzeitige Genaberrationen in den Netzwerken Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), PI3K und RB sind an 74% der GBM-Pathogenese beteiligt7. Daher werden die primären Signalwege, die im humanen GBM verändert sind, durch die manipulierten Mutationen in TRP-Mäusen, insbesondere GBM-Tumoren, repräsentiert, in denen gemeinsame nachgeschaltete Ziele von RTKs aktiviert werden5.
Das von GEM abgeleitete syngene orthotope Modell wurde als ein Modell validiert, das Merkmale menschlicher Hirntumore, einschließlich der Invasivität und des Vorhandenseins von Subtyp-Biomarkern, rekapituliert, um als Plattform für die Evaluierung von Krebstherapeutika zu dienen, die auf abweichende Signalwege bei GBM abzielen. Die Zellen wurden aus Tumoren kultiviert, die aus TRP-Gehirnen entnommen und mit stereotaktischen Geräten zur intrakraniellen Injektion in den Kortex wieder in das Gehirn von Mäusen implantiert wurden, die mit dem Stamm verglichen wurden. Dieses präklinische orthotope Mausmodell entwickelte GBM-Tumoren, die hochzellig, invasiv, pleomorph mit einer hohen Mitoserate waren und lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation aufwiesen, wie sie für humanes GBM beobachtet wurden. Das Tumorvolumen und -wachstum wurde mittels in vivo Magnetresonanztomographie (MRT) gemessen.
In diesem Bericht beschreiben wir am Beispiel von TRP-Tumoren die optimale Technik für die intrakranielle Injektion von primären GBM-Zellen oder Zelllinien in das Wildtyp-Mäusegehirn. Das gleiche Protokoll könnte für immungeschwächte Mäuse und andere GBM-Zelllinien angepasst werden. Es werden wichtige Tipps gegeben, um häufige Fallstricke wie suboptimale Zellpräparation oder Zellleckage an der Injektionsstelle zu vermeiden und die stereotaktische Ausrüstung richtig einzusetzen, um die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit des Modells zu gewährleisten. Zu translationalen Zwecken validieren wir das Modell durch MRT-Detektion des Hirntumorwachstums bei lebenden Tieren, histologische Charakterisierung und präsentieren ein Beispiel für die Behandlung in tumortragenden Mäusen.

<table><tbody><tr><td>5% Methylcellulose in 1X PBS, autoklaviert</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7027 1mL</td><td></td></tr><tr><td>Tuberkulinspritze, Stülpspitze</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>6" Applikatoren mit Wattespitze</td><td>Puritan</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Verstellbare Bühnenplattform</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 901</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol-Barrierespitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-33</td><td></td></tr><tr><td>Alkoholvorbereitungspads Steril, groß - 2,5 x 3 Zoll</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>B6D2&nbsp; Mausstamm (C57Bl/6J x DBA/2J)</td><td>Jackson Laboratory Jax</td><td>#10006</td><td></td></tr><tr><td>Knochenwachs</td><td>Chirurgische Spezialitäten</td><td>901</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacain 0,25%</td><td>Henry Schein</td><td>6023287</td><td></td></tr><tr><td>BuprenorphinSR</td><td>ZooPharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Klare Vinylschläuche 1/8ID X 3/16OD</td><td>UDP</td><td>T10004001</td><td></td></tr><tr><td>CVS Gleitmittel Augensalbe</td><td>CVS Apotheke</td><td>247881</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpelle, # 10 Klinge</td><td>Skalpell Miltex</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Gasanästhesiegerät mit Sauerstoffanschluss und Anästhesiebox</td><td>Somni Scientific</td><td>n/a</td><td>Der Ermittler kann die Standardausrüstung der Einrichtung </td></tr><tr><td>verwenden Gas Anästhesieplattform für Mäuse</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 923-B</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>Graphpad</td><td>Prism&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 9&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Version 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 30 g Nadel, &frac12; ", kleine Nabe, Spitze pst 3</td><td>Hamilton</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Präzisions-Mikroliterspritze, 1701 RN, ohne Nadel 10 &micro; L</td><td>Hamilton</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Heißperlensterilisator mit Kügelchen</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Countess 3 Automatisierter Zellzähler</td><td>Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol-Vorbereitungspads</td><td>PDI</td><td>C69900</td><td></td></tr><tr><td>ITK_SNAP (Version 36.X, 2011- Penn</td> <td>Image Computing and Science Laboratory (PICSL) an der University of Pennsylvania und das Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) an der University of Utah</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOPF Stereotaktisches Instrument für Kleintiere mit digitaler Anzeigekonsole</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modell 940</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, PVDF, gerade, Schlauchtülle Reduzierer, 1/4" ID x 1/8" ID</td><td>Masterflex</td><td>HV-30616-16</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Heizplatte</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Rektalsonde</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH RET-3-ISO</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry Oberflächenschutz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>74000-00</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipette</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Jod OP-Peeling</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Applikator</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-09</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clip Remover</td><td>Fine Science Tools</td><td>12033-00</td><td></td></tr><tr><td>Reflex 9 mm Wound Clips</td><td>Fine Science Tools</td><td>12032-09</td><td></td></tr><tr><td>Semken Pinzette, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>David Kopf Instruments</td><td>PH TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tuberkulinspritze mit 25g Nadel, Slip Tip</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump 3 mit Micro2T Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>Modell UMP3T</td><td></td></tr></tbody></table>

translationale orthotope modelle des glioblastoma multiforme

Translational Orthotopic Models of Glioblastoma Multiforme

Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEM) für humanes Glioblastoma multiforme (GBM) sind entscheidend für das Verständnis der Entstehung und des Fortschreitens von Hirntumoren. Im Gegensatz zu Xenograft-Tumoren entstehen Tumore bei GEMs in der nativen Mikroumgebung einer immunkompetenten Maus. Der Einsatz von GBM-GEMs in präklinischen Behandlungsstudien ist jedoch aufgrund der langen Tumorlatenzen, der Heterogenität der Neoplasienhäufigkeit und des Zeitpunkts der Tumorentwicklung im fortgeschrittenen Grad eine Herausforderung. Mäuse, die durch intrakranielle orthotope Injektion induziert wurden, sind für präklinische Studien besser handhabbar und behalten Merkmale der GEM-Tumore bei. Wir generierten ein orthotopes Hirntumormodell, das aus einem GEM-Modell mit Rb-, Kras- und p53-Aberrationen (TRP) abgeleitet wurde und GBM-Tumore entwickelt, die lineare Nekroseherde durch neoplastische Zellen und eine dichte Vaskularisation analog zu humanem GBM aufweisen. Zellen, die von GEM-GBM-Tumoren abgeleitet sind, werden intrakraniell in Wildtyp-Empfängermäuse injiziert und reproduzieren Tumore des Typs IV, wodurch die lange Tumorlatenzzeit in GEM-Mäusen umgangen wird und die Erstellung großer und reproduzierbarer Kohorten für präklinische Studien ermöglicht wird. Die hochproliferativen, invasiven und vaskulären Merkmale des TRP-GEM-Modells für GBM werden in den orthotopen Tumoren rekapituliert, und histopathologische Marker spiegeln humane GBM-Subgruppen wider. Das Tumorwachstum wird durch serielle MRT-Scans überwacht. Aufgrund des invasiven Charakters der intrakraniellen Tumoren in immunkompetenten Modellen ist eine sorgfältige Einhaltung des hier beschriebenen Injektionsverfahrens unerlässlich, um ein extrakranielles Tumorwachstum zu verhindern.

Mäuse, denen Hirntumorzellen injiziert wurden, sollten täglich auf Anzeichen von Tumorwachstum wie Krampfanfälle, Ataxie oder Gewichtsverlust überwacht werden. Das Wachstum von Hirntumoren kann auch durch MRT-Untersuchungen in regelmäßigen Abständen überwacht werden. Wöchentliche MRT-Scans ermöglichen die Visualisierung der zunehmenden Tumorlast im Gehirn und der Tumorvolumenmessungen (Abbildung 1C). Insbesondere TRP-Tumoren weisen ein aggressives Wachstum auf, und 3D-Tumorvolumina sind inne...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein präklinisches orthotopes Mausmodell für GBM, das durch intrakranielle Injektion von Zellen aus gentechnisch veränderten Mausmodelltumoren etabliert wurde. Dieses Modell zeigt die Krankheitsmerkmale des humanen GBM. Für translationale Studien wird der Hirntumor der Maus mittels In-vivo-MRT und Histopathologie verfolgt.

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

Genetically engineered mouse (GEM) models for human glioblastoma multiforme (GBM) are critical to understanding the development and progression of brain ...

Wir beschreiben die optimale Technik für die intrakranielle Injektion von GEM-abgeleiteten Glioblastomzellen in ein immunkompetentes Mausgehirn, was zu Tumoren führt, die Schlüsselmerkmale des humanen Glioblastoms rekapitulieren. Diese Technik zur orthotopen Injektion von GEM-abgeleiteten TRP-Zellen liefert hochgradig reproduzierbare, skalierbare und konsistente Ergebnisse für Tumore, die ihren Ursprung im Kortex haben, aber die Invasivität von GEM-Tumoren beibehalten. Glioblastom-Hirntumoren der Maus zeigen ein aggressives Wachstum und dringen in das umgebende Hirnparenchym ein.Daher kann es zur Evaluierung von Therapeutika verwendet werden, die die Tumorinfiltration und -migration bei Patienten unterdrücken können. Dieses Protokoll kann für andere Hirntumormodelle, Viren, Therapeutika angepasst oder für die Injektion in verschiedene Gehirnregionen mit Anpassung der stereotaktischen Koordinaten angepasst werden. Devon Atkinson, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.Platzieren Sie zunächst Oberflächenprotektoren unter dem stereotaktischen Gerät und auf der Arbeitsfläche. Verbinden Sie den Vinylschlauch des Anästhesiegeräts mit dem Eingang der Gasanästhesieplattform des stereotaktischen Geräts und einen weiteren Schlauch mit seinem Ausgang. Schließen Sie die Digitalanzeige an eine Stromquelle und das Gerät an.Befestigen Sie als Nächstes die Mikropumpe am Manipulatorarm des Geräts, nachdem Sie die Mikropumpensteuerung an die Stromquelle angeschlossen haben. Stellen Sie die Mikropumpe auf 5,6 Nanoliter pro Sekunde ein. Schließen Sie das Mausheizkissen an den Temperaturregler und an eine Stromquelle an.Füllen Sie eine 30-Gauge-Präzisionsspritze mit einer Methylmethylcellulose-Zellmischung zurück, indem Sie Blasen vermeiden. Setzen Sie nach dem Einsetzen des Kolbens die Nadel ein und drücken Sie den Kolben, bis die geladene Zellmischung durch die Nadel fällt. Reinigen Sie die Nadel mit einem Zubereitungspad mit 70%igem Alkohol.Sobald die Präzisionsspritze an der Mikropumpe befestigt ist, drehen Sie den Manipulatorarm vom Tisch weg, bevor Sie die Maus platzieren, um ein Verschieben der Spritzennadel zu verhindern. Übertragen Sie die betäubte Maus auf das stereotaktische Instrument und befestigen Sie sie am Nasenkegel, indem Sie die oberen Zähne auf die Nasenkonusstütze legen. Nachdem Sie den Nasenkegel mit einem Knopf festgezogen haben, kneifen Sie einen Zeh zusammen, um die Reflexe zu überprüfen und eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.Setzen Sie dann die Ohrbügel ein und ziehen Sie den Knopf fest, um den Kopf zu sichern. Tragen Sie Augensalbe auf, um die Augen unter betäubten Bedingungen zu befeuchten. Injizieren Sie das Analgetikum Buprenorphin SR subkutan und platzieren Sie eine rektale Maussonde, um die Innentemperatur zu überwachen.Sterilisieren Sie das Operationsfeld mit nach außen gerichteten Kreisen und wechseln Sie dreimal zwischen einem chirurgischen Peeling und Ethanol. Ziehen Sie die straffe Haut mit einer Pinzette ab und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen etwa 1 Zentimeter langen Schnitt zwischen den Augen. Für die Zellinjektion geben Sie den Manipulatorarm mit der an der Maus befestigten Spritze zurück.Nachdem Sie die Noppen festgezogen haben, bewegen Sie die Spritze mit den X- und Y-Noppen in der horizontalen Ebene und montieren Sie sie über dem Bregma. Senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf ab, um die Bregma-Position zu bestätigen, und stellen Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null. Bewegen Sie dann die Nadel mit den X- und Y-Knöpfen und der entsprechenden digitalen Anzeige in die gewünschte Position, wie im Manuskript beschrieben, und bewegen Sie die Nadel mit dem Z-Knopf an die Oberfläche des Schädels.Stechen Sie ein Loch in den Schädel mit einer 1-Milliliter-Spritze und einer angebrachten 25-Gauge-Nadel. Drehen Sie den Manipulatorarm vorsichtig zur Seite, während Sie die Abschrägung der Nadel in Richtung der 30-Gauge-Präzisionsspritze führen. Sobald der Manipulatorarm mit der geladenen Präzisionsspritzennadel über dem Loch positioniert ist, richten Sie die Nadelspitze am Loch aus und senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf in die Dura des Gehirns.Nachdem Sie die digitale Anzeigekonsole auf Null gestellt haben, senken Sie die Nadel mit dem Z-Knopf um 1 Millimeter ab und warten Sie eine Minute. Sobald die Tiefe von 2 Millimetern erreicht ist, stoppen Sie die Mikropumpe und stellen Sie sicher, dass die Pumpe stoppt, wenn 2 Mikroliter Zellsuspension injiziert wurden. Um die Nadel aus dem Schädel zu entfernen, heben Sie sie um einen Millimeter an und warten Sie eine Minute.Nehmen Sie zum Wundverschluss mit dem hölzernen Ende eines Applikators mit Wattespitze ein Stück Knochenwachs und formen Sie es zu einem Kegel. Nachdem Sie das Wachs in die Öffnung im Schädel gegeben haben, schieben Sie es in das Loch. Verwenden Sie die perlensterilisierte Pinzette, um das restliche Wachs auf dem Schädel zu schmelzen.Sobald es glatt wird, geben Sie zwei Tropfen betäubende Bupivacain-Lösung in den Einschnitt und ziehen Sie die Hautränder mit einer Pinzette zusammen. Nachdem Sie die Haut mit einem oder zwei Wundklammern strafft haben, schließen Sie die Haut, legen Sie die Maus in einen sauberen Auffangkäfig auf einem Heizkissen in einem zugfreien Bereich und beobachten Sie die Maus genau. Wöchentliche MRT-Scans zeigten eine zunehmende Tumorlast im Gehirn und Tumorvolumenmessungen.Die MRT-Tumorvolumenmessung ergab auch nach der Bestrahlung keine Unterdrückung des Tumorwachstums und das Überleben der behandelten Mäuse war nicht erhöht. Die GBM-Tumoren in syngenen Modellen schienen aggressiv gewachsen zu sein und durchbrachen den Schädel am terminalen Endpunkt. Wenn in der Bildgebung nach der Zellimplantation ein extrakranielles Wachstum beobachtet wird, deutet dies auf eine Zellleckage während des Injektionsprozesses hin, und beim Herausziehen der Injektionsnadel ist mehr Vorsicht geboten.Die Histopathologie von orthotopen TRP-GBM-Tumoren bestätigte das Vorliegen eines Astrozytoms Grad 4, einschließlich der Rekapitulation der charakteristischen Merkmale bei Tumoren wie Pseudopalisading und Nekrose. Seien Sie präzise, wenn Sie den Nullpunkt bei bregma einstellen, um sicherzustellen, dass die Zellinjektionskoordinaten korrekt sind. Das Absenken und Anheben der Nadel im Gehirn muss langsam erfolgen, um Trauma und Rückfluss zu vermeiden.Nach der Injektion von Tumorzellen können wöchentliche MRT-Scans verwendet werden, um die Ausgangsgröße des Tumors vor Beginn der Behandlung zu bestimmen und die sich ändernde Tumorlast im Gehirn sichtbar zu machen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Wir beschreiben eine integrierte Methode für die präzise, ​​stereotaktische Implantation von humanen Glioblastom multiforme Zellen in den Gehirnen von Nacktmäusen und anschließende...

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Wir haben eine kortikale orthotopen Glioblastom-Modell bei Mäusen für die Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie, die die biophysikalischen Einschränkungen im Spiel während des Wachstums des Tumors rekapituliert normalerweise etabliert. Eine chronische Glasfenster ersetzt den Schädel über dem Tumor ermöglicht die Follow-up der Tumorprogression über die Zeit durch Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Hier beschreiben wir ein effizientes und vielseitiges Protokoll zur Induktion, Überwachung und Analyse neuartiger Glioblastome (GBM) unter Verwendung von Transposon-DNA, die in die Ventrikel von neugeborenen Mäusen injiziert wird. Zellen der subventrikulären Zone, die das Plasmid aufnehmen, transformieren, vermehren und Tumore mit histopathologischen Merkmalen des menschlichen GBM erzeugen.

Transposon-vermittelte Integration von Plasmid-DNA in die Subventrikularzone von neugeborenen Mäusen zu Novel Modelle von Glioblastoma generieren

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Ziel dieses Protokolls ist es, Forschern eine hochgradig reproduzierbare Technik für intrakranielle Implantationen bereitzustellen.

Stereotaktische intrakranielle Implantation von Glioblastom-Patienten-abgeleiteten Xenograftzelllinien bei Mäusen

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Erfahren Sie die orthotope Injektionstechnik für GEM-abgeleitete Glioblastomzellen in immunkompetente Mäuse. Dieses reproduzierbare Modell ermöglicht die Evaluation therapeutischer Strategien gegen Tumorwachstum und Invasion.

Translationale orthotope Modelle des Glioblastoma multiforme

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