High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Die Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität, kurz ADCC, kann durch natürliche Killerzellen, sogenannte NK-Zellen, Granulozyten und die Makrophagen, vermittelt werden. Dies sind die Effektorzellen von ADCC. Wenn ein Antikörper wie Trastuzumab, der auf den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor HER2 abzielt, an Tumorzellen bindet, dann binden diese Effektorzellen über ihre FcyR-Rezeptoren an die konstante FC-Region der Antikörper.

Der Antikörper überbrückt die Tumorzellen und die FcyR-Rezeptor-tragenden Effektorzellen und löst die Freisetzung ihrer zytotoxischen Granula aus. Dies führt zur Apoptose der Krebszellen. ADCC kann gegen Tumore wirksam sein, die nicht auf die antiproliferative Wirkung von Trastuzumab ansprechen.

Um das ADCC-System aufzubauen, müssen wir die anti-HER2-positiven JIMT-1-Mammakarzinomzellen mit der NK-92-Zelllinie in Gegenwart des Anti-HER2-Antikörpers Trastuzumab co-inkubieren. Die JIMT-1-Zelllinie, die wir für den Assay verwenden, exprimiert das grün fluoreszierende Protein stabil. Codieren Sie zunächst die 96-Well-High-Content-Screening-Platte mit dem JIMT-Medium.

Pipettieren Sie 50 Mikroliter Medium in jede Vertiefung der Platte. Stellen Sie die Platte für eine Stunde in einen CO2-Inkubator. Die Beschichtung ist entscheidend für die Befestigung von JIMT-1-Zellen an der Glasoberfläche der Platte.

Während des Beschichtungsschritts werden JIMT-1-Zellen trypsinisiert. Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern sterilem PBS. Geben Sie dann einen Milliliter Trypsin-EDTA in den Kolben.

Stellen Sie den Kolben wieder für 10 Minuten in einen CO2-Inkubator. Klopfen Sie nach der Inkubation auf den Kolben, um zu prüfen, ob sich JIMT-1-Zellen gelöst haben. Stoppen Sie den Aufschluss mit zwei Millilitern JIMT-1-Medium und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie dann die JIMT-1-Zellen mit Trypanblau in einer blau gegossenen Kammer. Stellen Sie die Zellenzahl auf 133.000 Zellen pro ml ein. Saugen Sie das Beschichtungsmedium ab und geben Sie dann 75 Mikroliter Zellsuspension in jede Vertiefung.

Lassen Sie die Zellen während einer nächtlichen Inkubation bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator anhaften. Am nächsten Tag wird das Medium angesaugt und 50 Mikroliter frisches JIMT-1-Medium in die Vertiefungen gegeben und die Platte in das Hochdurchsatz-Screening-Labor überführt. Der Roboter wird verwendet, um die Testverbindungen auf die High-Content-Screening-Mikrotiterplatten zu übertragen.

Mit dem Roboterarm greift der Roboter die Stiftwerkzeugeinheit, die für den Transfer von 25 Nanolitern kalibriert ist. Übertragen Sie in vier Schritten insgesamt 100 Nanoliter Testverbindungen von der Compound-Bibliotheksplatte auf die Assay-Platte. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der Testverbindungen 20 Mikromolaren beträgt.

Waschen Sie das Stiftwerkzeug zwischen den einzelnen Schritten zuerst in 50 % DMSO und dann in 70 % Ethanol. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Kultur von NK-Zellen in T25-Gewebekulturflaschen.

Während die medikamentöse Behandlung von JIMT-1-Zellen läuft, sammeln Sie die NK-Zellen aus einem T25-Kolben in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zählen Sie die NK-92-Zellen mit Trypanblau in einer blauen Zählkammer. Stellen Sie die Zellenzahl auf 400.000 Zellen pro ml ein.

Zentrifugieren Sie das Volumen der NK-Zellsuspension, die 400.000 Zellen pro ml bei 150 g enthält, drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie das ADCC-Medium vor, indem Sie 20 Mikrogramm pro ml Anti-HER2-Antikörper Trastuzumab zum JIMT-1-Medium hinzufügen. Pipettieren Sie 20.000 NK-Zellen in 50-Mikroliter-ADCC-Medium auf die JIMT-1-GFP-Zielzellen.

Das Endvolumen beträgt 100 Mikroliter und die endgültige Trastuzumab-Konzentration 10 Mikrogramm pro ml. Legen Sie die Assay-Platte in das High-Content-Analysegerät, das über einen eingebauten Inkubator verfügt, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Die Platten werden zu zwei Zeitpunkten abgebildet.

Zuerst nehmen wir Bilder unmittelbar nach dem Hinzufügen der Effektorzellen zu den Zielzellen auf, und der zweite Satz von Bildern wird drei Stunden nach dem Hinzufügen von NK-Zellen aufgenommen. Wählen Sie zunächst den Typ der Mikrotiterplatte aus. Verwenden Sie 96-Well-High-Content-Screening-Platten.

Wählen Sie diese Option, um den Fokus auszuwählen, da der Assay in Platten mit einem 10x-Objektiv im nicht-konfokalen Modus durchgeführt wird. Wählen Sie Binning zwei, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verdoppeln. Wählen Sie die entsprechenden Kanäle, die Belichtungszeit, die Laserleistung, die Fokusebene und die Wellenlänge.

Nehmen Sie die Hellfeldbilder bei 650-760 Nanometern auf und detektieren Sie die EGFP-transduzierten JIMT-1-Zellen mit 488 Nanometern Anregung und 500-550 Nanometern Emissionswellenlänge. Bevor Sie mit der Messung beginnen, nehmen Sie mit der Snapshot-Funktion Beispielbilder auf, um die korrekten Einstellungen zu überprüfen. Legen Sie abschließend die Anzahl der Felder und die Anzahl der Zeitpunkte für das Imaging fest.

Wählen Sie z. B. neun Felder und zwei Zeitpunkte aus. Um den ADCC-Wirkungsgrad zu analysieren, zählen Sie die lebensfähigen JIMT-1-Zellen im Kontroll-ADCC-Well. Verwenden Sie das Modul feine Zellen, um Bereiche im Bild zu erkennen, die Zellen entsprechen.

Erkennen Sie jede Zelle als einen Bereich auf dem Bild, der eine höhere Fluoreszenzintensität aufweist als die Umgebung. Wählen Sie die Zellen mit dem eingebauten M-Algorithmus mit 80 Mikrometer Durchmesser aus. Legen Sie die Einstellung für die Teilungsempfindlichkeit, mit der ein großes Objekt in kleinere Objekte aufgeteilt wird, auf den Wert 0,5 fest.

Stellen Sie den allgemeinen Schwellenwert, bei dem es sich um die niedrigste Stufe der Pixelintensität handelt, auf Null ein. Schließen Sie die Detektion von Hintergrundflächen mit hoher EGFP-Fluoreszenzintensität in zwei Schritten aus. Wenden Sie zunächst die Funktion "Intensitätseigenschaften berechnen" an, um die EGFP-Fluoreszenzintensität in der zuvor ausgewählten Zellregion zu bestimmen.

Legen Sie anschließend einen minimalen und maximalen Intensitätsschwellenwert fest, indem Sie die Option "Population auswählen" verwenden, so dass wir am Ende des ADCC die Anzahl der lebensfähigen JIMT-1 GFP-Zielzellen erhalten. Berechnen Sie die ADCC-Effizienz, indem Sie die nach drei Stunden erkannte Zellenzahl durch die zum Zeitpunkt Null erkannte Zellenzahl dividieren. Wir möchten die praktische Anwendung unserer Methode mit repräsentativen Ergebnissen demonstrieren.

Wir haben eine Testplatte mit 16 Verbindungen aufgestellt, die nach dem Zufallsprinzip aus den Regalen genommen wurden. Wir schlossen auch drei Verbindungen ein, Colchicin, Vincristin und Podophyllotoxin mit erwarteter ADCC-hemmender Wirkung. Als Negativkontrolle wurde DMSO eingesetzt.

Jede Droge wurde in vier Wiederholungen auf dem Teller verwendet. Die Abbildung zeigt das Ergebnis des Testbildschirms. In der Minus-NK-Gruppe wurde die Toxizität der Wirkstoffe auf JIMT-1-Zellen getestet.

In der Plus-NK-Gruppe wurden NK-Zellen und Trastuzumab hinzugefügt, was eine Zytotoxizität von etwa 50 % verursachte. Die erwartete ADCC-Inhibitorwirkung der drei Testsubstanzen konnte mit dem Assay nachgewiesen werden. Wir haben ein Co-Culture-Assay-System aufgebaut, das die klinisch relevante Interaktion zwischen Brustkrebszellen, NK-Zellen und dem therapeutischen monoklonalen Antikörper Trastuzumab modelliert.

Der Assay basiert auf automatisierter Mikroskopie in Kombination mit Bildanalyse und eignet sich für das Screening chemischer Verbindungsbibliotheken zur Identifizierung von ADCC-modifizierenden Wirkstoffen. Das Verfahren kann potenziell zur Identifizierung von adjuvanten Molekülen eingesetzt werden, die eine Antitumorantwort verstärken, oder zur Identifizierung von Chemikalien mit nachteiliger Wirkung.