Name: Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung lang- und kurzfristiger hämatopoetischer Stammzellen mit dem Hoxb5-Reporter-System. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Zellerneuerungsmechanismen und Heterogenität im Stammzellkompartiment.

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Wir danken Hiroshi Kiyonari für die Tierpflege und die Bereitstellung von Empfängermäusen am RIKEN BDR sowie Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka und Masaki Miyahashi für das Labormanagement an der Universität Kobe. Die Autoren schätzen auch die anhaltende Unterstützung für diese Arbeit sehr. Masanori Miyanishi wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 und JP20H03268, der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, der Life Science Foundation of Japan, der Takeda Science Foundation, der Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders und AMED-PRIME, AMED unter der Fördernummer JP18gm6110020 unterstützt. Taro Sakamaki wird von den JSPS KAKENHI Grant Numbers JP21K20669 und JP22K16334 unterstützt und wurde unterstützt von das JSPS Core-to-Core-Programm und das RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi wurde durch die JSPS-Fördernummer KAKENHI JP18J13408 unterstützt.

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research genehmigt.
1. Vorkonditionierung der Empfängermäuse
<ol><li>Männliche C57BL/6 kongene Mäuse im Alter von 8-10 Wochen werden als Empfängermäuse vorbereitet. Die Anzahl der Empfängermäuse hängt vom Versuchsprotokoll ab. Wir bereiten in der Regel 10-20 Mäuse für jede Erkrankung vor.<ol><li>Füttern Sie die Mäuse mit sterilisiertem Wasser, das mit Enrofloxacin (170 mg/l) ergänzt ist. Da bestrahlte Empfängermäuse sehr anfällig für Infektionen sind, sollten die Käfige so sauber wie möglich gehalten werden. HINWEIS: Die Supplementierung mit Antibiotika beginnt 24 Stunden vor der Bestrahlung und wird 3 Wochen nach der Transplantation fortgesetzt, um Infektionen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Ganzkörperbestrahlung<ol><li>Bei der Ganzkörperbestrahlung werden die Knochenmarkzellen des Empfängers zerstört, um die Transplantation der Spenderzellen zu gewährleisten. Übertragen Sie die Empfängermäuse in einen Bestrahlungskäfig. Die Empfängermäuse werden 12-16 h vor der Transplantation mit einer Einzeldosis von 8,7 Gy bestrahlt. Anmerkungen: Die Strahlendosis und -zeit können je nach Gerät variieren. Die tödliche Strahlendosis sollte mit dem Bestrahlungs- und Mausstamm des Forschers bestätigt werden.</li>
		<li>Bringen Sie sie nach der Ganzkörperbestrahlung in ihre Käfige zurück.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Entnahme der gespendeten Knochenmarkszellen
<ol><li>Bereiten Sie eine männliche Hoxb5-tri-mCherry-Maus im Alter von 12 Wochen vor und euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Exposition, gefolgt von einer Zervixluxation oder mit Methoden, die von der örtlichen Tierethikkommission genehmigt wurden. HINWEIS: Das Reagenzvolumen pro Maus wird in den folgenden Schritten beschrieben.</li>
	<li>Entfernen Sie unter sterilen Bedingungen die Haut und legen Sie die Knochen (Oberschenkelknochen, Schienbein, Becken, Oberarmknochen) frei. Schneiden Sie die Hauptmuskeln ab und nehmen Sie die Knochen (Oberschenkelknochen, Schienbein, Becken, Oberarmknochen) von der Maus. Legen Sie sie in sterile Zellkulturschalen mit Ca2+- undMg2+-freiem, eiskaltem PBS.</li>
	<li>Schneiden Sie die Muskeln und das Fasergewebe mit einer Pinzette, einer kleinen Schere und Tüchern von den Knochen ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Achten Sie darauf, dass Sie sich bei diesem Schritt nicht die Knochen brechen. Entsorgen Sie alle gebrochenen Knochen, um die Sterilität zu erhalten.</li>
	<li>Sterilisieren Sie einen Mörser und Stößel mit 70%igem Ethanol (EtOH) und lassen Sie sie vollständig trocknen. Äquilibrat mit Zellfärbepuffer (Ca2+- undMg2+-freies PBS, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS, 2 mM EDTA, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin).</li>
	<li>Legen Sie die Knochen in den Mörser und fügen Sie 3 ml Zellfärbepuffer hinzu. Die Knochen mit dem Stößel aufdrücken. Disaggregieren Sie die Zellklumpen durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 2.5, bis die Lösung klar ist. In der Regel reicht dreimal aus.</li>
</ol>3. Trennung der c-kit+ Zellen durch magnetische Sortierung
<ol><li>Antikörperfärbung für die magnetische Sortierung<ol><li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Zellfärbepuffer. Fügen Sie 10 μl Ratten-IgG (5 mg/ml) hinzu, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren, und pipetieren Sie vorsichtig mit einer P1.000-Pipette auf und ab. 15 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie den c-Kit-Antikörper (Klon 2B8) in einer Konzentration von 4 μg/ml hinzu und mischen Sie ihn mit einer P1.000-Pipette. 15 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 5 ml Zellfärbepuffer hinzu und mischen Sie gut. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl Zellfärbepuffer.</li>
		<li>Fügen Sie 35 μl Anti-APC-Mikrokügelchen hinzu, um die c-Kit+ -Zellen anzureichern, und mischen Sie sie mit einer P1.000-Pipette. 15 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 4-5 ml Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Zellfärbepuffer.</li>
	</ol></li>
	<li>Die c-Kit+ Zellen magnetisch sortieren<ol><li>Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die Zellen zu sortieren. Kurz gesagt, bereiten Sie eine magnetische Sortiersäule mit 3 ml Zellfärbepuffer vor. Filtrieren Sie die Probe (1 ml) durch ein 40-μm-Zellsieb und laden Sie die Probe in die magnetische Sortiersäule.</li>
		<li>Waschen Sie, indem Sie dreimal 3 ml Zellfärbepuffer hinzufügen. Fügen Sie den Zellenfärbepuffer nur hinzu, wenn das Säulenreservoir leer ist.</li>
		<li>Setzen Sie die magnetische Sortiersäule auf ein eiskaltes 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml Zellfärbepuffer hinzu. Spülen Sie die Zellen aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken. Halten Sie den Durchfluss auf Eis. HINWEIS: Im Falle eines versehentlichen Probenverlusts behalten wir den Durchfluss bis zum Ende des Experiments bei.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hämatopoetische Stammzellfärbung
<ol><li>Die in Schritt 3.2.3 vorbereitete Probe wird bei 400 x g und 4 °C für 5 min zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab.</li>
	<li>Den CD34-Antikörper (Klon RAM34) in einer Konzentration von 50 μg/ml in das Pellet geben und 60 Minuten auf Eis inkubieren. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Stützzellen während der ersten Stunde der Inkubation mit CD34 vorzubereiten, um die Verarbeitungszeit zu verkürzen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Antikörper-Mastermischung gemäß Tabelle 1 vor. Geben Sie 100 μl der Mastermischung in die Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Der Antikörper für das CD34-Antigen (Klon; RAM34) benötigt 90 min für eine ausreichende Färbung.</li>
	<li>Fügen Sie 4-5 ml Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 x g und 4 °C für 5 min. Saugen Sie den Überstand ab. Streptavidin-BUV737 in einer Konzentration von 3 μg/ml zum Pellet geben und 30 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 4-5 ml Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 x g und 4 °C für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 400 μl Zellfärbepuffer. Bewahren Sie die Probe auf Eis auf.</li>
</ol>5. Unterstützung der Zellvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine CD45.1+ CD45.2+ kongene Maus im Alter von 12 Wochen vor; Idealerweise sollte diese im gleichen Alter wie die Spendermaus sein. Euthanasieren Sie die Maus durch CO2 -Exposition mit anschließender Zervixluxation oder mit Methoden, die von der örtlichen Tierethikkommission genehmigt wurden. HINWEIS: Im angegebenen Beispiel wurden CD45.1+ CD45.2+ kongene Mäuse intern durch Kreuzung von B6 gezüchtet. CD45.1 kongene Mäuse mit C57BL/6J Mäusen16.</li>
	<li>Unter sterilen Bedingungen werden sowohl Oberschenkelknochen als auch Tibiae entnommen und in sterile Zellkulturschalen mit Ca 2+- und Mg2+-freiem, eiskaltem PBS gelegt. Schneiden Sie die Muskeln und das Fasergewebe mit einer Pinzette und einer kleinen Schere von den Knochen ab.</li>
	<li>Schneiden Sie beide Enden der Knochen mit einer scharfen, sterilen Schere ab. Verwenden Sie eine 23-g-Nadel und eine 5-ml-Spritze, die mit eiskaltem Zellsuspensionspuffer gefüllt ist (Ca 2+- und Mg2+-freies PBS, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin), um das Knochenmark in eine sterile Zellkulturschale mit Zellsuspensionspuffer zu spülen. Disaggregieren Sie die Zellklumpen durch sanftes Pipettieren.</li>
	<li>Filtrieren Sie die Zellsuspension mit einer P1.000-Pipette durch ein 40-μm-Zellsieb. Zählen Sie die Zellzahl der Zellsuspension mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Knochenmarkzellsuspension mit 1 x 106 Zellen/ml vor.</li>
	<li>Übertragen Sie 200 μl der Knochenmarkzellsuspension (2 x 105 Zellen) auf eine 96-Well-Platte mit rundem Boden. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Anmerkungen: Für eine einfache Zellentnahme werden Platten mit rundem Boden empfohlen.</li>
</ol>6. Hoxb5pos oder Hoxb5neg pHSC-Sortierung
<ol><li>Einrichten des Gates<ol><li>Übertragen Sie 400 μl der in Schritt 4.5 vorbereiteten Probe in ein Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden und einer 35-μm-Zellsieb-Schnappkappe. Bereiten Sie das Reagenz für die Totzellfärbung vor und fügen Sie es der Probe vor der Analyse gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.</li>
		<li>Schalten Sie ein Durchflusszytometer ein und starten Sie die Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers. Drücken Sie dann auf Laden, und rufen Sie die Daten ab. HINWEIS: Ein Durchflusszytometer, das mit fünf Lasern und einer 70-μm-Düse ausgestattet ist, wird empfohlen, um die Reinheit der sortierten Zellen zu verbessern.</li>
		<li>Nach dem Ausschluss von Dubletten, toten Zellen und linienpositiven Zellen wird die Fraktion Lineage−c-Kit+Sca-1+ gegatet. Als nächstes wird die Flk2+-Fraktion herausgeklappt. Dann wird das Gatter Hoxb5pos oder Hoxb5neg pHSCs in der CD150+CD34−/niedrigen Fraktion negieren (Abbildung 2). Führen Sie im ersten Experiment eine Kompensation der spektralen Überlappung durch. HINWEIS: Es wird erwartet, dass Hoxb5-positive Zellen 20%-25% der Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/niedrigenFlk2−-Fraktion ausmachen.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos oder Hoxb5neg pHSC-Sortierung<ol><li>Bereiten Sie ein 1,5 ml proteinarmes Bindungsröhrchen mit 600 μl Ca 2+- und Mg2+-freiem PBS zu, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt wird.</li>
		<li>Setzen Sie das 1,5-ml-Röhrchen mit niedrigem Proteinbindungsgehalt auf eine Sortiersammelvorrichtung und sortieren Sie die Hoxb5-pos- oder Hoxb5-neg-pHSCs mit der in Schritt 6.1.3 festgelegten Gating-Strategie in das 1,5-ml-Röhrchen. Verwenden Sie in der ersten Sortierung die Ausbeute aus dem Sortiergenauigkeitsmodus.</li>
		<li>Setzen Sie die 96-Well-Platte mit den in Schritt 5.5 vorbereiteten Stützzellen auf den Tisch der automatischen Zellabscheidungseinheit (ACDU). Setzen Sie das in Schritt 6.2.2 vorbereitete 1,5-ml-Röhrchen mit niedriger Proteinbindung auf die Ladeöffnung eines Durchflusszytometers.</li>
		<li>Sortieren Sie die hoxb5pos oder Hoxb5neg pHSCs in eine 96-Well-Platte mit den unterstützenden Zellen unter Verwendung der in Schritt 6.1.3 festgelegten Gating-Strategie. Sortieren Sie 10 Hoxb5pos oder Hoxb5neg pHSCs, um ihre Selbsterneuerungsfähigkeit zu testen. Anmerkungen: Eine doppelte Sortierung wird empfohlen, um die Reinheit zu erhöhen. Verwenden Sie in der zweiten Sortierung Reinheit als empfohlenen Sortiergenauigkeitsmodus.</li>
		<li>In der Regel werden 500-1.000 Hoxb5pos pHSCs und 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSCs nach doppelter Sortierung geerntet. Fahren Sie so schnell wie möglich nach der HSC-Sortierung mit den Transplantationsverfahren fort, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern (idealerweise innerhalb von 1-2 Stunden).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Transplantation
<ol><li>Legen Sie die in Schritt 6.2.4 vorbereitete HSC-sortierte 96-Well-Platte auf Eis. Behandeln Sie die HSC-sortierte 96-Well-Platte unter sterilen Bedingungen, idealerweise in einer Zellenhaube.</li>
	<li>Betäuben Sie eine Empfängermaus mit 2%igem Isofluran in einer Gasanästhesie-Induktionskammer. Sobald das Tier vollständig betäubt ist, entfernen Sie es und legen Sie es auf die Seite. Um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten, vergewissern Sie sich, dass Sie sich nicht als Reaktion auf einen schädlichen Reiz bewegen.</li>
	<li>Führen Sie nach der Bestätigung der ordnungsgemäßen Anästhesie so schnell wie möglich eine retroorbitale Injektion durch, um zu verhindern, dass die Maus das Bewusstsein wiedererlangt. Die retroorbitale Injektion dauert weniger als 30 s. HINWEIS: Da die Injektionszeit kurz ist, beenden wir den Eingriff, ohne Augensalbe auf die Augen aufzutragen. Wenn der Eingriff jedoch länger dauert, empfehlen wir die Verwendung von Augensalbe.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig in die HSC-sortierte 96-Well-Platte, um sie zu mischen. Sammeln Sie die Spenderzellen mit einer 30-g-Insulinspritze in der Sortierplatte und injizieren Sie sie in den retroorbitalen Venenplexus der Empfängermäuse. Das empfohlene injizierbare Volumen beträgt ≤200 μl.</li>
	<li>Beobachten Sie, bis die Mäuse bei Bewusstsein sind und sich in einem sauberen Käfig bewegen. Bringen Sie sie in ihre Käfige zurück, nachdem Sie ihre Genesung bestätigt haben.</li>
</ol>8. Periphere Blutanalyse
<ol><li>Entnahme von 50 μl peripherem Blut aus der Schwanzvene und resuspendiert es mit 100 μl Ca 2+- und Mg2+-freiem PBS mit 2 mM EDTA. Übertragen Sie alle Proben auf eine 96-Well-Platte. Bei 400 x g und 4 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu und inkubieren Sie ihn 3 Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Antikörper-Mastermix gemäß Tabelle 2 vorbereiten. 50 μl Antikörper-Mastermix zugeben und 30 Minuten auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 150 μl Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 200 μl Zellfärbepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Proben bei 400 x g und 4 °C für 5 min und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie 200 μl Zellfärbepuffer und fügen Sie vor der Analyse gemäß den Anweisungen des Herstellers ein Färbereagenz für tote Zellen hinzu.</li>
	<li>Analysieren Sie den peripheren Blutchimärismus mit einem Durchflusszytometer, wie zuvor beschrieben16. Entnahme von Blut nach 4 Wochen, 8 Wochen, 12 Wochen und 16 Wochen nach der Transplantation, um die Rekonstitution mehrerer Linien zu verfolgen. Repräsentative Diagramme der Durchflusszytometrie sind in Abbildung 3 dargestellt.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
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<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
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<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
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<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.

Traditionell wurden HSCs, die durch Zelloberflächenmarker definiert sind, hergestellt, um die Funktionen von HSCs zu untersuchen, wie z. B. die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Multipotenz 19,20,21. Die immunphänotypisch definierte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSC-Fraktion enthält jedoch zwei diskrete HSZ-Populationen: LT-HSCs und ST-...

Hämatopoetische Stammzellen (HSZ), die über Selbsterneuerungsfähigkeit und Multipotenz verfügen, befinden sich an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie 1,2. 1988 zeigten Weissman und Kollegen erstmals, dass die Isolierung von HSZ bei Mäusen mit Hilfe der Durchflusszytometrie erreicht werden kann3. Anschließend wurde berichtet, dass eine Fraktion, die durch eine Kombination von Zelloberflächenmarkern definiert wurde, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, alle HSCs in Mäusen 4,5,6,7,8 enthält.
Immunphänotypisch definierte (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) HSZ (im Folgenden pHSCs) galten bisher als funktionell homogen. Neuere Einzelzellanalysen haben jedoch gezeigt, dass pHSCs immer noch Heterogenität in Bezug auf ihre Selbsterneuerungskapazität9,10 und Multipotenz 11,12 aufweisen. Konkret scheinen in der pHSC-Fraktion zwei Populationen hinsichtlich ihrer Selbsterneuerungskapazität zu existieren: langfristige hämatopoetische Stammzellen (LT-HSCs), die eine kontinuierliche Selbsterneuerungskapazität aufweisen, und kurzzeitige hämatopoetische Stammzellen (ST-HSCs), die eine transiente Selbsterneuerungskapazität aufweisen 9,10.
Die molekularen Mechanismen der Selbsterneuerungsfähigkeit, die LT-HSZ und ST-HSZ unterscheiden, sind bisher nur unzureichend verstanden. Es ist von entscheidender Bedeutung, beide Zellpopulationen anhand ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit zu isolieren und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu entdecken. Es wurden auch mehrere Reportersysteme eingeführt, um LT-HSCs13,14,15 zu reinigen; Die von jedem Reportersystem definierte LT-HSC-Reinheit ist jedoch variabel, und eine ausschließliche LT-HSC-Reinigung wurde bisher nicht erreicht.
Daher wird die Entwicklung eines Isolationssystems für LT-HSCs und ST-HSCs die Erforschung der Selbsterneuerungsfähigkeit in der pHSC-Fraktion beschleunigen. Bei der Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs wurde in einer Studie mit mehrstufigem, unverzerrtem Screening ein einzelnes Gen, Hoxb5, identifiziert, das heterogen in der pHSC-Fraktion16 exprimiert wird. Darüber hinaus ergab die Knochenmarkanalyse der Hoxb5-Reportermäuse, dass etwa 20%-25% der pHSC-Fraktion aus Hoxb5-pos-Zellen besteht. Ein kompetitiver Transplantationsassay mit Hoxb5 pos pHSCs und Hoxb5 neg pHSCs zeigte, dass nur Hoxb5pos pHSCs eine langfristige Selbsterneuerungskapazität besitzen, während Hoxb5neg pHSCs ihre Selbsterneuerungskapazität innerhalb kurzer Zeit verlieren, was darauf hindeutet, dass Hoxb5 LT-HSCs in der pHSC-Fraktion16 identifiziert.
Hier demonstrieren wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs mit dem Hoxb5-Reportersystem . Darüber hinaus präsentieren wir einen kompetitiven Transplantationsassay zur Beurteilung der Selbsterneuerungskapazität von Hoxb5pos/neg pHSCs (Abbildung 1). Dieses Hoxb5-Reportersystem ermöglicht es uns, LT-HSCs und ST-HSCs prospektiv zu isolieren und trägt zum Verständnis von LT-HSC-spezifischen Eigenschaften bei.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Streifen mit 8 Röhrchen, Dome Cap</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 & Mikro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G Insulinspritze</td><td>BD</td><td>326668</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Schnappkappe für das Zellsieb</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 Well U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator mit Falle Kolben</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotin (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. CD45.1 kongene Mäuse&nbsp;</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II Sonderbestellsystem&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Brillant-Fleckenpuffer</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotin (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -Biotin (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&epsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1/CD45.2 kongene Mäuse</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>gezüchtet im Labor</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotin (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotin (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) ohne Ca und Mg, flüssig&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Version 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Beste Theratronics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mCherry Mäuse (C57BL/6J Hintergrund)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gezüchtet in unserem Labor</td></tr><tr><td>IgG aus Rattenserum, technische Qualität, >=80% (SDS-PAGE), gepufferte wässrige Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes S200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Lyse-Puffer&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte für Gewebekultur (für Adhäsionszelle) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Pie-Cages</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Mehrzweck-Kühlzentrifuge</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Mischlösung</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Porzellanmörtel &phi; 120mm mit Stößel</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen 1,5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Skalpellklinge</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner Suspension für Mäuse Standard</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotin (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml konzentrische Luer-Slip-Spritze</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Injektionsnadel 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische stammzellen

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

Die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und das Differenzierungspotenzial mehrerer Linien gelten allgemein als die bestimmenden Merkmale hämatopoetischer Stammzellen (HSCs). Zahlreiche Studien deuten jedoch darauf hin, dass im HSC-Kompartiment funktionelle Heterogenität besteht. Neuere Einzelzellanalysen haben über HSC-Klone mit unterschiedlichen Zellschicksalen innerhalb des HSC-Kompartiments berichtet, die als biased HSC-Klone bezeichnet werden. Die Mechanismen, die heterogenen oder schlecht reproduzierbaren Ergebnissen zugrunde liegen, sind wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Dauer der Selbsterneuerung, wenn gereinigte HSZ-Fraktionen durch konventionelle Immunfärbung transplantiert werden. Daher ist die Etablierung einer reproduzierbaren Isolationsmethode für Langzeit-HSZ (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSZ (ST-HSCs), definiert durch die Dauer ihrer Selbsterneuerung, entscheidend für die Überwindung dieses Problems. Mit Hilfe eines unverzerrten mehrstufigen Screenings konnten wir einen Transkriptionsfaktor, Hoxb5, identifizieren, der ein exklusiver Marker für LT-HSCs im hämatopoetischen System der Maus sein könnte. Basierend auf diesen Erkenntnissen etablierten wir eine Hoxb5-Reportermauslinie und isolierten erfolgreich LT-HSCs und ST-HSCs. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von LT-HSCs und ST-HSCs unter Verwendung des Hoxb5-Reportersystems . Diese Isolationsmethode wird den Forschern helfen, die Mechanismen der Selbsterneuerung und die biologischen Grundlagen für diese Heterogenität im HSZ-Kompartiment besser zu verstehen.

Bisher wurde die Selbsterneuerungskapazität mit Hilfe von kompetitiven Transplantationsassays gemessen, bei denen angenommen wurde, dass Spender-HSZ ihre Selbsterneuerungsfähigkeit nur dann behalten, wenn Spenderzellen mit mehreren Linien im peripheren Blut des Empfängers beobachtet werden17. Darüber hinaus werden LT-HSZ in mehreren Berichten als Zellen definiert, die auch mehrere Monate nach der zweiten Knochenmarktransplantation noch periphere Blutzellen produzieren10,18<...

Wir stellen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) und Kurzzeit-HSCs (ST-HSCs) mit dem Hoxb5-Reportersystem vor.

Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

Die Langzeit- und Kurzzeitmethode der hämatopoetischen Stammzell- oder HSZ-Isolierung wird den Forschern helfen, die Zellerneuerungsmechanismen und die biologischen Grundlagen der Heterogenität im HSZ-Kompartiment besser zu verstehen. Ein Transkriptionsfaktor, Hoxb5, der ein exklusiver Marker für Langzeit-HSZ sein könnte, wurde identifiziert. Darauf aufbauend wurde eine Hoxb5-Reporter-Mauslinie etabliert und die Langzeit- und Kurzzeit-HSZ erfolgreich isoliert.Um mit der Entnahme der Spenderknochenmarkzellen zu beginnen, sterilisieren Sie einen Mörser und Stößel mit 70%igem Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen. Äquilibrieren Sie diejenigen mit Zellfärbepuffer, der aus kalzium- und magnesiumfreien PBS-haltigen Nahrungsergänzungsmitteln besteht. Legen Sie die Knochen, die von der männlichen Hoxb5-tri-mCherry-Maus isoliert wurden, in den Mörser und fügen Sie drei Milliliter des Zellfärbepuffers hinzu.Bürsten Sie die Knochen mit dem Stößel auf, zerlegen Sie dann die Zellklumpen durch leichtes Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Zellfärbepuffer, bis die Lösung klar wird. In der Regel reicht eine dreimalige Wiederholung aus, um eine klare Lösung zu erhalten.Nach der Isolierung der Femuren und Tibiae von der CD45.1.2-kongenen Maus werden beide Enden der Knochen mit einer scharfen, sterilen Schere abgeschnitten. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 23-Gauge-Nadel, die mit einer Fünf-Milliliter-Spritze ausgestattet ist, die mit eiskaltem Zellsuspensionspuffer gefüllt ist, in eine sterile Zellkulturschale mit Zellsuspensionspuffer. Zerlegen Sie die Zellklumpen durch sanftes Pipettieren und filtern Sie dann die Zellsuspension mit einer P1000-Pipette durch ein 40-Mikron-Zellsieb.Bereiten Sie die Probe für den Gating-Aufbau gemäß den Anweisungen im Text vor und geben Sie 400 Mikroliter davon in ein Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden und einer 35-Mikron-Zellsieb-Schnappkappe. Bereiten Sie vor der Analyse ein Reagenz vor, das tote Zellen abseiht, und fügen Sie es der Probe hinzu, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen. Schalten Sie dann das Durchflusszytometer ein und starten Sie die Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers.Drücken Sie dann auf Laden, um mit der Erfassung der Daten zu beginnen. Nach dem Ausschluss von Dubletten, toten Zellen und linienpositiven Zellen wird die liniennegative, c-kit-positive, Sca-1-positive Fraktion gegatet. Als nächstes wird der Flk2-positive Anteil herausgegatet.Dann werden Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSCs in der CD150-positiven, CD34-negativen oder niedrigen Fraktion gegatet. Als nächstes bereiten Sie ein 1,5-Millimeter-proteinarmes Bindungsröhrchen mit 600 Mikrolitern kalzium- und magnesiumfreiem PBS vor, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt wird. Um die Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSC-Sortierung durchzuführen, legen Sie das vorbereitete 1,5-Milliliter-Low-Protein-Bindungsröhrchen auf eine Sortiersammelvorrichtung und sortieren Sie die Hoxb5-positiven oder Hoxb5-negativen pHSCs unter Verwendung der zuvor erwähnten Anschnittstrategie in das Röhrchen.Verwenden Sie in der ersten Sortierung die Ausbeute aus dem Sortiergenauigkeitsmodus. Setzen Sie die 96-Well-Platte mit den zuvor vorbereiteten Stützzellen auf den Tisch der automatisierten Zellabscheidungseinheit. Stellen Sie dann das 1,5-Milliliter-Binderöhrchen mit niedrigem Proteingehalt auf die Ladeöffnung des Durchflusszytometers.Sortieren Sie die Hoxb5-positiven oder Hoxb5-negativen pHSCs in die 96-Well-Platte mit den Stützzellen unter Verwendung der zuvor erwähnten Gating-Strategie. Sortieren Sie 10 Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSCs, um ihre Selbsterneuerungsfähigkeit zu testen. Die Durchflusszytometrie-Diagramme der Knochenmarkanalyse der Spender-Hoxb5-tri-mCherry-Mäuse zeigten, dass etwa 20 bis 25 % der Zellen in der pHSC-Fraktion, die durch Lineage-negativ, c-kit-positiv, Sca-1-positiv, CD150-positiv, CD34-negativ oder niedrig, Flk2-negativ definiert war, Hoxb5-positive pHSCs waren.Hier sind die repräsentativen Durchflusszytometrie-Plots der peripheren Blutanalyse der Empfängermäuse dargestellt. Darüber hinaus ergab die periphere Blutanalyse der Empfängermäuse nach der Primärtransplantation, dass, obwohl Hoxb5-positive und Hoxb5-negative pHSCs vier Wochen nach der Transplantation einen ähnlichen Spenderchimärismus aufwiesen, nur bei den Hoxb5-positiven pHSC-Empfängern eine kontinuierliche Hämatopoese beobachtet wurde. Die Hoxb5-negativen HSZ verloren acht Wochen nach der Transplantation die Fähigkeit, hämatopoetische Zellen zu produzieren.In der sekundären Transplantationsanalyse wiesen nur die Hoxb5-positiven pHSC-Empfänger eine robuste Hämatopoese auf. Im Gegensatz dazu wurden bei den Hoxb5-negativen pHSC-Empfängermäusen kaum Spenderzellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Hoxb5-negative pHSCs innerhalb von 16 Wochen nach der Primärtransplantation die Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren. Dieses Protokoll dauert in der Regel neun bis 12 Stunden, daher ist es wichtig, die Probe während des gesamten Verfahrens so weit wie möglich bei vier Grad Celsius zu halten, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Hier beschreiben wir die Isolierung von CD133 exprimierenden Leber-Stammzellen und Krebsstammzellen aus ganz murinen Leber, ein Prozess, der Gewebe Verdauung, Anreicherung von Zellen und Durchflusszytometrie Isolierung erfordert. Wir gehören Methoden für fortgeschrittene Einzelzellisolierung und klonalen Expansion.

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Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

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Dieses Video zeigt eine Technik zur Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (HIS). CD34+ hämatopoetische Stammzellen (HSCs) werden aus menschlichen Buffy-Coat-Zellen aus Nabelschnurblut mit Hilfe von Antikörper-beschichteten magnetischen Kügelchen isoliert. Die CD34+ HSCs werden in einem mit Zytokinen angereicherten Wachstumsmedium expandiert und kryokonserviert. Schließlich werden die aufgetauten HSCs in ein immundefizientes Mausjunges injiziert, um das HIS-Mausmodell zu etablieren.

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Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung von ruhenden humanen hämatopoetischen Stammzellen in vitro, indem die Mikroumgebung des Knochenmarks mit reichlich Fettsäuren, Cholesterin, niedrigeren Konzentrationen von Zytokinen und Hypoxie imitiert wird.

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Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen (CD34+ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Hier stellen wir Protokolle vor, die die Isolierung von Stromazellen aus murinem Knochen, Knochenmark, Thymus und menschlichem Thymusgewebe ermöglichen, die mit Einzelzell-Multiomics kompatibel sind.

Isolierung von Stromazellen aus hämatopoetischen Organen

Wir beschreiben ein Protokoll zur Extraktion hochwertiger Zellkerne aus kryokonservierten induzierten pluripotenten Stammzelltypen, die aus Stroma-/Endothel- und Blutzelltypen gewonnen wurden, um Einzelkern-Sequenzierungsanalysen der nächsten Generation zu unterstützen. Die Herstellung hochwertiger, intakter Kerne ist für Multiomics-Experimente unerlässlich, kann aber für einige Labore ein Hindernis für den Einstieg in das Feld darstellen.

Kernisolierung aus kryokonservierten in vitro gewonnenen Blutzellen

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Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

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