Isolationsmethode für lang- und kurzfristige hämatopoetische Stammzellen

Die Langzeit- und Kurzzeitmethode der hämatopoetischen Stammzell- oder HSZ-Isolierung wird den Forschern helfen, die Zellerneuerungsmechanismen und die biologischen Grundlagen der Heterogenität im HSZ-Kompartiment besser zu verstehen. Ein Transkriptionsfaktor, Hoxb5, der ein exklusiver Marker für Langzeit-HSZ sein könnte, wurde identifiziert. Darauf aufbauend wurde eine Hoxb5-Reporter-Mauslinie etabliert und die Langzeit- und Kurzzeit-HSZ erfolgreich isoliert.

Um mit der Entnahme der Spenderknochenmarkzellen zu beginnen, sterilisieren Sie einen Mörser und Stößel mit 70%igem Ethanol und lassen Sie sie vollständig trocknen. Äquilibrieren Sie diejenigen mit Zellfärbepuffer, der aus kalzium- und magnesiumfreien PBS-haltigen Nahrungsergänzungsmitteln besteht. Legen Sie die Knochen, die von der männlichen Hoxb5-tri-mCherry-Maus isoliert wurden, in den Mörser und fügen Sie drei Milliliter des Zellfärbepuffers hinzu.

Bürsten Sie die Knochen mit dem Stößel auf, zerlegen Sie dann die Zellklumpen durch leichtes Pipettieren und übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie den Vorgang mit frischem Zellfärbepuffer, bis die Lösung klar wird. In der Regel reicht eine dreimalige Wiederholung aus, um eine klare Lösung zu erhalten.

Nach der Isolierung der Femuren und Tibiae von der CD45.1.2-kongenen Maus werden beide Enden der Knochen mit einer scharfen, sterilen Schere abgeschnitten. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 23-Gauge-Nadel, die mit einer Fünf-Milliliter-Spritze ausgestattet ist, die mit eiskaltem Zellsuspensionspuffer gefüllt ist, in eine sterile Zellkulturschale mit Zellsuspensionspuffer. Zerlegen Sie die Zellklumpen durch sanftes Pipettieren und filtern Sie dann die Zellsuspension mit einer P1000-Pipette durch ein 40-Mikron-Zellsieb.

Bereiten Sie die Probe für den Gating-Aufbau gemäß den Anweisungen im Text vor und geben Sie 400 Mikroliter davon in ein Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden und einer 35-Mikron-Zellsieb-Schnappkappe. Bereiten Sie vor der Analyse ein Reagenz vor, das tote Zellen abseiht, und fügen Sie es der Probe hinzu, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen. Schalten Sie dann das Durchflusszytometer ein und starten Sie die Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Drücken Sie dann auf Laden, um mit der Erfassung der Daten zu beginnen. Nach dem Ausschluss von Dubletten, toten Zellen und linienpositiven Zellen wird die liniennegative, c-kit-positive, Sca-1-positive Fraktion gegatet. Als nächstes wird der Flk2-positive Anteil herausgegatet.

Dann werden Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSCs in der CD150-positiven, CD34-negativen oder niedrigen Fraktion gegatet. Als nächstes bereiten Sie ein 1,5-Millimeter-proteinarmes Bindungsröhrchen mit 600 Mikrolitern kalzium- und magnesiumfreiem PBS vor, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt wird. Um die Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSC-Sortierung durchzuführen, legen Sie das vorbereitete 1,5-Milliliter-Low-Protein-Bindungsröhrchen auf eine Sortiersammelvorrichtung und sortieren Sie die Hoxb5-positiven oder Hoxb5-negativen pHSCs unter Verwendung der zuvor erwähnten Anschnittstrategie in das Röhrchen.

Verwenden Sie in der ersten Sortierung die Ausbeute aus dem Sortiergenauigkeitsmodus. Setzen Sie die 96-Well-Platte mit den zuvor vorbereiteten Stützzellen auf den Tisch der automatisierten Zellabscheidungseinheit. Stellen Sie dann das 1,5-Milliliter-Binderöhrchen mit niedrigem Proteingehalt auf die Ladeöffnung des Durchflusszytometers.

Sortieren Sie die Hoxb5-positiven oder Hoxb5-negativen pHSCs in die 96-Well-Platte mit den Stützzellen unter Verwendung der zuvor erwähnten Gating-Strategie. Sortieren Sie 10 Hoxb5-positive oder Hoxb5-negative pHSCs, um ihre Selbsterneuerungsfähigkeit zu testen. Die Durchflusszytometrie-Diagramme der Knochenmarkanalyse der Spender-Hoxb5-tri-mCherry-Mäuse zeigten, dass etwa 20 bis 25 % der Zellen in der pHSC-Fraktion, die durch Lineage-negativ, c-kit-positiv, Sca-1-positiv, CD150-positiv, CD34-negativ oder niedrig, Flk2-negativ definiert war, Hoxb5-positive pHSCs waren.

Hier sind die repräsentativen Durchflusszytometrie-Plots der peripheren Blutanalyse der Empfängermäuse dargestellt. Darüber hinaus ergab die periphere Blutanalyse der Empfängermäuse nach der Primärtransplantation, dass, obwohl Hoxb5-positive und Hoxb5-negative pHSCs vier Wochen nach der Transplantation einen ähnlichen Spenderchimärismus aufwiesen, nur bei den Hoxb5-positiven pHSC-Empfängern eine kontinuierliche Hämatopoese beobachtet wurde. Die Hoxb5-negativen HSZ verloren acht Wochen nach der Transplantation die Fähigkeit, hämatopoetische Zellen zu produzieren.

In der sekundären Transplantationsanalyse wiesen nur die Hoxb5-positiven pHSC-Empfänger eine robuste Hämatopoese auf. Im Gegensatz dazu wurden bei den Hoxb5-negativen pHSC-Empfängermäusen kaum Spenderzellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Hoxb5-negative pHSCs innerhalb von 16 Wochen nach der Primärtransplantation die Fähigkeit zur Selbsterneuerung verloren. Dieses Protokoll dauert in der Regel neun bis 12 Stunden, daher ist es wichtig, die Probe während des gesamten Verfahrens so weit wie möglich bei vier Grad Celsius zu halten, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.