Name: Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie eine optimierte Ultrazentrifugationsmethode zur Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe. Diese Technik liefert höhere Reinheit als klassische Methoden und unterstützt die Krebsbiologieforschung.

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Die Autoren danken dem First Affiliated Hospital der Gannan Medical University für die Unterstützung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummern 82260422).

Menschliches Leberkrebsgewebe wurde von Patienten gesammelt, bei denen im First Affiliated Hospital der Gannan Medical University eine maligne Lebererkrankung diagnostiziert wurde. Alle Patienten unterschrieben eine Einverständniserklärung, und die Entnahme von menschlichen Gewebeproben wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Gannan Medical University genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Vorbereitung
<ol><li>Stellen Sie den Transferentfärbungsschüttler in den Inkubator und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Siehe Abbildung 1 für alle anderen benötigten Geräte.</li>
	<li>Reinigen Sie das Skalpell und die Pinzette, indem Sie sie mit 75% Alkohol besprühen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Verdauungslösung vor, indem Sie 6 mg Kollagenase D (4 mg/ml) und 24 μl DNase Ι (80 U/ml) messen und zu 1,5 ml RPMI-1640-Basismedium hinzufügen. Durch leichtes Umdrehen mischen, bis sich die Zusätze vollständig aufgelöst haben.</li>
	<li>Vorab 70 μm und 0,22 μm Zellsiebe mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) befeuchten.</li>
	<li>Stellen Sie eine 100 mm sterile Zellkulturschale auf die Kühlbox, um das Lebergewebe nach dem Auftauen zu halten.</li>
	<li>Spülen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Isolierung des hepatozellulären Karzinomgewebes das Blut auf der Oberfläche des Gewebeblocks mit PBS ab, übertragen Sie das Gewebe in ein steriles gefrorenes Röhrchen und lagern Sie es bis zum Experiment bei -80 ° C für nicht mehr als 2 Wochen.</li>
</ol>2. Gewebe-Dissoziation
<ol><li>Die Gewebeprobe wird aus dem Gefrierschrank bei −80 °C entnommen und ca. 400 mg des in 2 mm x 2 mm x 2 mm große Fragmente geschnittenen Gewebes in die 10 cm große Zellkulturschale auf dem Eisfach gegeben.</li>
	<li>Bewegen Sie das Gewebe in eine 6-Well-Platte mit 1,5 ml der Verdauungslösung; Legen Sie dann die Platte auf den Übertragungsentfärbungsschüttler (20 U / min), um sie 20 Minuten lang bei 37 °C zu inkubieren, um das Leberkrebsgewebe vollständig zu dissoziieren und die sEVs freizusetzen.</li>
	<li>Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Kühlbox. Fügen Sie 80 μl Phosphatase-Inhibitor und 200 μl vollständige Proteasehemmer-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Verdauungslösung in das 70-μm-Zellsieb und filtern Sie sie langsam, um große Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie das Filtrat und geben Sie es in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
</ol>3. Differentielle Ultrazentrifugation
HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C durch.
<ol><li>Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 × g für 10 min und sammeln Sie den Überstand in einem neuen 2 mL Zentrifugenröhrchen. Die meisten kleinen Gewebereste können dann entfernt werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.000 × g für 20 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, bis die Spitze der Pipette im Begriff ist, die weiße Substanz auf der Oberfläche zu berühren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die restliche Flüssigkeit bei 3.000 × g für 3 min; Dann saugen Sie den Überstand ab, um das Sammeln von Vesikeln zu erleichtern. Um die Reinheit der sEVs zu gewährleisten, ist darauf zu achten, dass die weiße Substanz nicht abgesaugt wird.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 12.000 × g für 20 min und überführen Sie 900 μl des Überstands in ein 4,7-ml-Ultrazentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die restliche Flüssigkeit bei 12.000 × g für 3 min und sammeln und mischen Sie dann beide Überstände in demselben Ultrazentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Röhrchen vollständig mit PBS.</li>
	<li>Die Überstände werden bei 100.000 × g 60 min zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit PBS füllen und erneut bei 100.000 × g für 60 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet mit 50 μl PBS.</li>
	<li>Die sEV-Suspension wird mit einer sterilen 1-ml-Spritze abgesaugt und durch einen 0,22-μm-Membranfilter filtriert. Sammeln Sie das Filtrat in einem 600-μl-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie es zur weiteren Analyse bei -80 °C.</li>
</ol>4. Bewertung der Anreicherungsqualität
<ol><li>Beobachten Sie die Morphologie der sEVs unter einem Transmissionselektronenmikroskop.<ol><li>Lassen Sie dann 10 μl der sEV-Probe auf ein Kupfernetz fallen, inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur und reinigen Sie sie mit sterilem destilliertem Wasser, wobei Sie absorbierendes Papier verwenden, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
		<li>Lassen Sie 10 μl 2% Uranylacetat auf das Kupfernetz fallen, um sie 1 Minute lang negativ zu färben. Verwenden Sie Filterpapier, um die Flüssigkeit auf der Oberfläche des Kupfernetzes aufzusaugen, und trocknen Sie es 2 Minuten lang unter einer Glühlampe.</li>
		<li>Beobachten Sie das Kupfergewebe unter einem Transmissionselektronenmikroskop und bilden Sie es bei 80 kV ab.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie ein Nanopartikel-Durchflusszytometer, um die Größenverteilung und Reinheit der sEVs zu bestimmen.<ol><li>Bevor die Maschine gestartet wird, bereiten Sie Röhrchen vor, die 200 μl Qualitätskontrolle, 200 μl Siliziumdioxid-Nanokugeln, 2 x 200 μl Reinstwasser, 2 x 200 μl Reinigungslösung und 200 μl PBS enthalten. HINWEIS: Vor dem Testen der sEV-Proben ist es notwendig, eine Qualitätskontrolle am Gerät durchzuführen und den Partikelgrößenstandard zu testen (die Größenverteilung muss anhand von Standardkurven berechnet werden, die mit mehreren Nanomikrokugeln unterschiedlicher Durchmesser [68-155 nm] unter der gleichen Nachweisbedingung erzeugt werden). QC-Kügelchen und Siliziumdioxid-Nanokügelchen wurden 100-fach mit Reinstwasser in einem Gesamtvolumen von 200 μl verdünnt.</li>
		<li>Überprüfen Sie das Volumen der Reinigungslösung (>10 ml) und notieren Sie die Differenz zwischen den Füllständen der Mantelflüssigkeit und der Abfallflüssigkeit (20-30 cm).</li>
		<li>Schalten Sie die Hauptstromversorgung des Instruments aus. Schalten Sie den Computer nach 20 Sekunden ein und warten Sie, bis die Pieptöne anzeigen, die anzeigen, dass das Gerät ordnungsgemäß angeschlossen ist, um die Software auszuführen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Start, um die Kamera, den Laser und die Luftpumpe einzuschalten.</li>
		<li>Klicken Sie auf Sheath Flow-Start Up und geben Sie Reinstwasser auf die Ladefläche. Nach 4 Minuten (Countdown des Instruments) klicken Sie auf Sample-Boosting | Probe-Entladen.</li>
		<li>Legen Sie das leere Röhrchen nach 30 s auf die Ladefläche und klicken Sie auf Sample-Boosting | Probe-Entladen. Stellen Sie dann das Röhrchen mit dem Reinstwasser auf die Ladefläche und klicken Sie gleichzeitig auf Sample-Boosting | Mantel-Strömungsspülung.</li>
		<li>Klicken Sie auf Manuelle Bedienung und stellen Sie das Partikelkonzentrationsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie dann für 1 Minute auf Sample-Boosting und wählen Sie gleichzeitig die Qualitätskontrolle von 250 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf."</li>
		<li>Klicken Sie auf Sample-Sampling und schalten Sie den Detektor ein, indem Sie auf SPCM klicken. HINWEIS: An diesem Punkt ist die Echtzeit-Signalwellenform zu sehen.</li>
		<li>Klicken Sie auf Auto Sampling und geben Sie 1.0 in Sampling SET ein, um den Druck auf 1 KPa zu fixieren. Klicken Sie auf die Symbolleiste und wählen Sie Großes Signal.</li>
		<li>Stellen Sie die horizontale Position des Lasers ein und stellen Sie den Laser auf 2 μm ein. Klicken Sie dann auf L oder R , um sicherzustellen, dass das Signal stark und gleichmäßig ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf Time to Record , um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.</li>
		<li>Legen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladeplattform, klicken Sie auf Sample-Boosting und nach 1 Minute auf Sample-Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie das partikelgroße Standardröhrchen auf die Ladefläche und klicken Sie für 1 Minute auf Sample-Boosting .</li>
		<li>Wählen Sie die Qualitätskontrolle von 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" und klicken Sie auf Sample-Sampling. Klicken Sie dann auf die Symbolleiste und wählen Sie Kleines Signal.</li>
		<li>Klicken Sie auf Time to Record , um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.</li>
		<li>Legen Sie das Reinigungslösungsröhrchen auf die Ladefläche, klicken Sie auf Sample-Boosting und klicken Sie nach 1 Minute auf Sample-Unload . Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.</li>
		<li>Legen Sie das PBS-Rohr auf die Ladefläche. Klicken Sie für 1 Minute auf Sample-Boosting .</li>
		<li>Wählen Sie die Qualitätskontrolle von 68-155 nm Std FL SiNPs in "SAMP. Inf" und klicken Sie auf Sample-Sampling. Klicken Sie dann auf die Symbolleiste und wählen Sie Kleines Signal.</li>
		<li>Klicken Sie auf Time to Record , um Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie die Daten in einer Naf-Datei und klicken Sie auf Sample-Unload.</li>
		<li>Stellen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladefläche, klicken Sie nach 1 min auf Sample-Boosting und Sample-Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Beispielinformationen, wie weiter oben in den Schritten 4.2.17-4.2.20 beschrieben. Ändern Sie den PBS (Schritt 4.2.17) in die sEV-Stichprobe und analysieren Sie die Daten.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifizieren Sie die sEVs weiter durch Western Blot.<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der sEVs und Gewebe mit dem BCA-Proteinquantifizierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Berechnen Sie das Beladungsvolumen von sEVs (z. B. für 5 μg Protein pro Well) basierend auf diesen quantitativen Ergebnissen. Fügen Sie Ladepuffer im Verhältnis 1:4 hinzu und wirbeln Sie die Mischung.</li>
		<li>Nach 10 min Denaturierung in einem 100 °C warmen Metallbad (Trockenthermostat) wird das Protein auf einem 12%igen Polyacrylamid-Gel bei 60 V für 80 min getrennt.</li>
		<li>Das Gel wird 2 h lang mit Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20 % Methanol) auf eine 0,22 μm Polyvinylidendifluoridmembran bei 220 mA übertragen.</li>
		<li>Blockieren Sie die Membran mit 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung Tween (TBST) für 1 h bei Raumtemperatur und inkubieren Sie sie mit Primärantikörpern (monoklonaler Anti-Human-CD9-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-CD63-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-TSG101-Antikörper von Kaninchen, monoklonaler Anti-Human-GM130-Antikörper für Mäuse) über Nacht bei 4 °C. Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% fettfreier Milch im Verhältnis 1:1.000.</li>
		<li>Nach dreimaligem Waschen mit TBST wird die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur 1 h lang inkubiert.</li>
		<li>Erkennen Sie den HRP-verknüpften Antikörper mit ECL-Blotting-Substrat und sammeln und analysieren Sie dann die Bilder.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
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<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt eine wiederholbare Methode zur Extraktion von sEVs aus Leberkrebsgewebe. Hochwertige sEVs werden durch scharfe Gewebeisolierung, Behandlung mit Verdauungsenzymen, differentielle Ultrazentrifugation und 0,22-μm-Filtermembranfiltration und -reinigung erhalten. Für die nachgeschaltete Analyse ist es äußerst wichtig, die hohe Reinheit der sEVs sicherzustellen. Bei der differentiellen Zentrifugation erscheint eine Schicht weißer Substanzen (unbekannte Zusammensetzung) auf der Oberfläche des Übersta...

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) haben einen Durchmesser von etwa 30 nm bis 150 nm und werden von verschiedenen Zellensezerniert 1. Sie können mit Gewebezellen kommunizieren und die lokale oder entfernte Mikroumgebung regulieren, indem sie wichtige biologische Moleküle wie Lipide, Proteine, DNA und RNA zu verschiedenen Organen, Geweben, Zellen und intrazellulären Teilen transportieren. Somit können sie auch das Verhalten von Empfängerzellen 2,3 verändern. Die Isolierung und Aufreinigung spezifischer sEVs ist eine wesentliche Voraussetzung, um ihr biologisches Verhalten während der Entstehung und des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Die differentielle Ultrazentrifugation, die als Goldstandard gilt, wird häufig verwendet, um sEVs von den Geweben zu trennen, in denen sie sich normalerweise befinden4. Gewebetrümmer, Zelltrümmer, große Vesikel und apoptotische Körper können mit dieser Technik entfernt werden, so dass nur die sEVs übrig bleiben.
Es wurde gezeigt, dass Kollagenase D und DNase I die molekularen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln nicht beeinflussen, wobei die Eigenschaften beider Enzyme zur Freisetzung von Vesikeln in der extrazellulären Matrix beitragen 5. Diese Enzyme wurden verwendet, um sEVs aus menschlichem metastasiertem Melanomgewebe, Darmkrebsgewebe und Dickdarmschleimhautgewebe zu extrahieren 5,6,7. Die Konzentration und Verdauungszeit von Kollagenase D und DNase I in diesen Methoden unterscheiden sich jedoch, was zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen führt. Um die Kopräzipitation anderer Subtypen von sEVs zu vermeiden, haben Forscher größere extrazelluläre Vesikel (0,1 μm oder 0,2 μm Durchmesser) durch Filtration und/oder differentielle Zentrifugation entfernt8. Je nach Ausgangsgewebe können unterschiedliche Methoden der Isolierung und Reinigung erforderlich sein 9,10.
Die Verwendung der traditionellen differentiellen Ultrazentrifugationsmethode zur Extraktion von sEVs aus Lebergewebe führt zu einer Schicht weißer Substanz auf der Oberfläche des Überstandes, ohne dass seine Eigenschaften bestimmt werden können. In einer früheren Studie11 wurde festgestellt, dass diese Schicht der weißen Substanz die Reinheit der sEVs beeinflusst. Obwohl die Partikelanzahl und die Proteinkonzentration der mit der traditionellen Methode isolierten Proben höher waren als die der aktuellen Methode, war der Variationskoeffizient groß, möglicherweise weil viele Schadstoffe zu einer schlechten Wiederholbarkeit der Ergebnisse führen können. Das heißt, unter Verwendung von Detergens (d.h. Nachweis der Löslichkeit von Partikeln in 1% Triton X-100) stellten wir fest, dass die Reinheit der mit dieser Methode erhaltenen sEVs größer war. Daher verwenden wir diese Methode, um sEVs aus Darmkrebsgewebe für die Proteomforschung zu isolieren und zu reinigen.
Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung zu sEVs bei Leberkrebs hauptsächlich auf Serum, Plasma und den Überstand der Zellkultur12,13,14. Aus Leberkrebsgewebe gewonnene sEVs können jedoch die physiologische Pathologie und die umgebende Mikroumgebung von Leberkrebs genauer widerspiegeln und den Abbau und die Verschmutzung anderer EVs wirksam verhindern15,16. Durch den Einsatz der differentiellen Ultrazentrifugation kann diese Methode die Ausbeute anreichern und qualitativ hochwertige sEVs erhalten, was eine wichtige Grundlage für die weitere Untersuchung von Leberkrebs darstellt. Diese Methode ermöglicht es, das Leberkrebsgewebe durch scharfe Trennung zu trennen und durch Kollagenase D und DNase I zu dissoziieren. Dann werden die zellulären Trümmer, großen Vesikel und apoptotischen Körper durch Filtration und differentielle Ultrazentrifugation weiter entfernt. Schließlich werden die sEVs isoliert und für spätere Studien gereinigt.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Membranfiltereinheit</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB 1 mL</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Spritze</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr><tr><td>2 % Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4,7 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatte</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Becher</td><td>Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Zellsieb</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Zellkulturschale</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Zentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td> BCA-Proteinquantifizierungskit <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Reinigungslösung</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Kupfernetz</td><td>Henan Zhongjingkeyi Technology Company</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Trockenthermostat</td><td>Hangzhou allsheng instruments company</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti Human CD9 Antikörper</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Glycin Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter sekundärer Anti-Maus-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-gekoppelter sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanopartikel-Durchflusszytometer</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase-Inhibitoren (PhosSTOP)</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyliden-Difluorid-Membran</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Beads</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Basismedium</td><td>Biologische Industrie&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr><tr><td>Skalpell</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumdioxid-Nanokugeln</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Übertragungsentfärbungsschüttler TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

eine anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre vesikel aus leberkrebsgewebe

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus Gewebe gewonnen werden, können den funktionellen Status der Quellzellen und die Eigenschaften des interstitiellen Raums des Gewebes widerspiegeln. Die effiziente Anreicherung dieser sEVs ist eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion und ein Schlüssel für die Entwicklung klinischer Nachweistechniken und therapeutischer Trägertechnologien. Es ist schwierig, sEVs aus Gewebe zu isolieren, da sie in der Regel stark kontaminiert sind. Diese Studie liefert eine Methode zur schnellen Anreicherung von hochwertigen sEVs aus Leberkrebsgewebe. Das Verfahren umfasst einen vierstufigen Prozess: die Inkubation von Verdauungsenzymen (Kollagenase D und DNase Ι) mit Gewebe, die Filtration durch ein 70-μm-Zellsieb, die differentielle Ultrazentrifugation und die Filtration durch einen 0,22-μm-Membranfilter. Aufgrund der Optimierung des differentiellen Ultrazentrifugationsschritts und der Hinzufügung eines Filtrationsschritts ist die Reinheit der mit diesem Verfahren erhaltenen sEVs höher als diejenige, die durch die klassische differentielle Ultrazentrifugation erreicht wird. Es liefert eine wichtige Methodik und unterstützende Daten für die Untersuchung von aus Gewebe gewonnenen sEVs.

sEVs aus menschlichem Leberkrebsgewebe haben eine entscheidende Rolle bei der Diagnose, Behandlung und Prognose von Patienten mit Leberkrebs gespielt. Bei dieser Methode wurden gängige Laborinstrumente verwendet, um sEVs aus Leberkrebsgewebe zu isolieren und zu reinigen. Dies kann eine methodische Unterstützung für die Untersuchung von sEVs bieten. Abbildung 2 veranschaulicht den allgemeinen Prozess der Anreicherung von sEVs aus Leberkrebsgewebe. sEVs in den Interzellularräumen von Geweben w...

Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Diese Methode ermöglicht die Isolierung von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Leberkrebsgewebe mit einer höheren Reinheit als die klassische, differentielle Ultrazentrifugation. Diese Technologie ist einfach, bequem und leicht zu bedienen und kann methodische Unterstützung für die Untersuchung kleiner extrazellulärer Vesikel bieten. Nehmen Sie zunächst die Gewebeprobe aus dem 80-Grad-Celsius-Gefrierschrank.Geben Sie etwa 400 Milligramm des Gewebes in eine 10-Zentimeter-Zellkulturschale auf die Eisbox und zerkleinern Sie das Gewebe mit einem Skalpell fein. Übertragen Sie das Gewebe auf eine Platte mit sechs Vertiefungen mit 1,5 Millilitern der Verdauungslösung. Legen Sie dann die Platte auf den Übertragungsentfärbungsschüttler und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um das Leberkrebsgewebe vollständig zu dissoziieren und die kleinen extrazellulären Vesikel oder sEVs freizusetzen.Legen Sie die Sechs-Well-Platte nach der Inkubation auf die Eisbox. Fügen Sie 80 Mikroliter Phosphatase-Inhibitor und 200 Mikroliter vollständige Proteasehemmer-Lösung hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Übertragen Sie dann die Verdauungslösung in ein 70-Mikrometer-Zellsieb, das auf einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen platziert ist, und filtern Sie es langsam, um große Gewebereste zu entfernen.Zentrifugieren Sie das Filtrat bei 500 g für 10 Minuten, um die kleinen Gewebereste zu entfernen, und sammeln Sie den Überstand in einem neuen Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.000 g für 20 Minuten, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen, bis die Spitze der Pipette die weißen Rückstände am Boden berührt.Nach wiederholter Zentrifugation der restlichen Flüssigkeit den Überstand in das Röhrchen geben, ohne den Schmutz zu stören. Zentrifugieren Sie den gesammelten Überstand bei 12.000 g für 20 Minuten und überführen Sie 900 Mikroliter des Überstands in ein 4,7-Millimeter-Ultrazentrifugenröhrchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation der verbleibenden Flüssigkeit und sammeln und mischen Sie dann beide Überstände in demselben Ultrazentrifugenröhrchen.Füllen Sie das Röhrchen vollständig mit PBS. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 g für 60 Minuten. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Ultrazentrifugenröhrchen mit PBS füllen.Nachdem Sie die Zentrifugation bei 100.000 g für 60 Minuten wiederholt haben, resuspendieren Sie das Pellet mit 50 Mikrolitern PBS. Saugen Sie die sEV-Suspension mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze ab und filtrieren Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Membranfilter in ein 600-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen. Lagern Sie das Filtrat zur weiteren Analyse bei 80 Grad Celsius.Verwenden Sie ein Nanopartikel-Durchflusszytometer, um die Größenverteilung und Reinheit der sEVs zu bestimmen. Überprüfen Sie das Volumen der Reinigungslösung. Beachten Sie dann den Unterschied zwischen den Füllständen der Hülle und der Abfallflüssigkeit.Schalten Sie nach 20 Sekunden Einschalten der Hauptstromversorgung des Instruments den Computer ein. Warten Sie, bis die Signaltöne anzeigen, dass das Gerät ordnungsgemäß angeschlossen ist, um die Software auszuführen. Klicken Sie auf Start, um die Kamera, den Laser und die Luftpumpe einzuschalten.Klicken Sie anschließend auf Sheath Flow und wählen Sie Start Up.Stellen Sie Reinstwasser auf die Ladefläche. Klicken Sie nach vier Minuten auf Sample und Boosting und wählen Sie dann In Sample entladen aus. Legen Sie das leere Rohr nach 30 Sekunden auf die Ladefläche.Klicken Sie auf Sample, wählen Sie Boosting und dann In Sample entladen aus. Stellen Sie dann das Rohr mit dem Reinstwasser auf die Ladefläche. Klicken Sie gleichzeitig auf Sample und Boosting, gefolgt von Sheath Flow und Purge.Klicken Sie auf Manuelle Bedienung und stellen Sie das Partikelkonzentrationsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie dann auf Probe, wählen Sie Boosting für eine Minute und wählen Sie gleichzeitig die Qualitätskontrolle von 250-Nanometer-Standard-Fluoreszenz-Siliziumdioxid-Nanokugeln in den Probeninformationen. Wählen Sie Probenahme aus Probe und schalten Sie den Detektor ein, indem Sie auf SPCM klicken.Klicken Sie dann auf Auto Sampling und geben Sie 1.0 in Sampling Set ein, um den Druck auf ein Kilopascal zu fixieren. Klicken Sie auf die Symbolleiste und wählen Sie Großes Signal. Stellen Sie die horizontale Position des Lasers ein und stellen Sie den Laser auf zwei Mikrometer ein.Klicken Sie dann kontinuierlich auf L und R, um sicherzustellen, dass das Signal stark und gleichmäßig ist. Klicken Sie auf Time to Record, um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in der Nfa-Datei und klicken Sie auf Beispiel, um Entladen auszuwählen.Stellen Sie das Reinigungslösungsrohr auf die Ladefläche. Klicken Sie auf Sample, wählen Sie Boosting und klicken Sie nach einer Minute auf Sample and Unload. Verwenden Sie Reinstwasser, um die restliche Reinigungslösung von der Kapillarspitze zu entfernen.Stellen Sie das Standardröhrchen mit Partikelgröße auf die Ladeplattform und klicken Sie eine Minute lang auf Sample Boosting. Wählen Sie 68 bis 155 S16M-Exo-Qualitätskontrolle unter Probeninformationen aus und klicken Sie auf Probe und dann auf Probenahme. Klicken Sie anschließend auf die Symbolleiste und wählen Sie Small Signal.Klicken Sie auf Time to Record, um die Daten zu sammeln, die nach Abschluss automatisch in den Puffer springen. Speichern Sie dann die Daten in einer Nfa-Datei und klicken Sie auf Beispiel, um Entladen auszuwählen. Nachdem Sie die Rückstände mit der Reinigungslösung entfernt haben, legen Sie das PBS-Rohr auf die Ladefläche und führen Sie die für das Standardrohr mit Partikelgröße gezeigten Schritte aus.Reinigen Sie als Nächstes die Kapillarspitze, wie zuvor gezeigt, und laden Sie die sEV-Probe, um die zuvor beschriebenen Daten für das Standardröhrchen mit Partikelgröße zu analysieren. Die gereinigten sEVs wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop untersucht, das das Vorhandensein von sEVs mit einer becherförmigen Morphologie zeigte. Es wurde eine Durchflusszytometrie für die sEVs durchgeführt.Und die Partikelgröße reichte von 40 bis 200 Nanometern, und die durchschnittliche Partikelgröße betrug 89 Nanometer. Die Reinheit der angereicherten sEVs betrug 68,32%Die Proteinmarker von sEVs wie CD63, CD9 und TSG101 wurden durch Western Blot nachgewiesen. GM130 wurde als Negativkontrollmarker für sEVs verwendet, der in Gewebezellen, aber nicht in den sEVs gefunden wurde.Es ist von entscheidender Bedeutung, die Schritte des enzymatischen Aufschlusses, der differentiellen Ultrazentrifugation und der Membranfiltration mit größter Sorgfalt durchzuführen, um die Reinheit kleiner extrazellulärer Vesikel zu gewährleisten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Die plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung der Biomarker zur Früherkennung und zum Fortschreiten der Krankheit verwendet werden. Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Trennung von Exosomen aus den Plasmaproben von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, die für DNA- und Proteinextraktionen verwendet werden könnten.

Exosomenisolierung: Eine Technik zur Trennung von Exosomen aus dem Plasma von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Eine Exosom ist eine neue Generation von Drug Delivery Träger. Wir etabliert eine Exosom Isolierung Protokoll mit hoher Ausbeute und Reinheit für SiRNA Lieferung. Wir auch Eindringmittel gekennzeichneten unspezifische SiRNA in Exosomen gekapselt und die zelluläre Aufnahme von SiRNA geladen Exosomen in Krebszellen untersucht.

Vorbereitung der Exosomen SiRNA Lieferung an Krebszellen

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die differentielle Zentrifugation zur Isolierung und Charakterisierung repräsentativer EVs (Exosomen und Mikrovesikel) aus kultivierten humanen MSCs. Weitere Anwendungen dieser Elektrofahrzeuge werden ebenfalls in diesem Artikel erläutert.

Isolierung, Charakterisierung und therapeutische Anwendung extrazellulärer Vesikel aus kultivierten humanen mesenchymalen Stammzellen

Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Milz-Exosomen von Mäusen vor, wobei eine Kombination aus Verdau mit Kollagenase Typ I und Ultrazentrifugation verwendet wird.

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Milzgewebe der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Erfahren Sie eine optimierte Ultrazentrifugationsmethode zur Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe. Diese Technik liefert höhere Reinheit als klassische Methoden und unterstützt die Krebsbiologieforschung.

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

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