Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren

Der Hochdurchsatz-Screening-Calciumfluoreszenz-Dual-Additions-Assay ermöglicht die Identifizierung neuartiger niedermolekularer Liganden eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der durch die intrazelluläre Calciumkaskade signalisiert. Der Hauptvorteil des Dual-Additions-Assays ist der Nachweis von Agonist und Antagonist HTS in einem einzigen Assay mit den gleichen Zellen, vorausgesetzt, das Fluoreszenzsignal dauert zwei Minuten. Diese Methode kann auf jeden GPCR angewendet werden, der durch die Calciumkaskade signalisiert, zu der der größte Teil der Arthropoden-Neuronen-Peptidfamilie, eines GPCRs, gehört.

Für die Reproduzierbarkeit des Assays ist es wichtig, die Zelldichte, die Injektionsgeschwindigkeit und die Konzentration des bekannten Agonisten für die zweite Auflage zu optimieren. Das Verfahren wird von Bianca Henriques-Santos, Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Der Calciumfluoreszenztest wird eingeleitet, indem das verbrauchte Medium aus dem T-75-Kolben entnommen wird, der drei Zellen mit 70 bis 90 % konfluentem BMLK enthält.