Ein "Dual-Addition"-Calciumfluoreszenz-Assay für das Hochdurchsatz-Screening von rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
2. Dezember 2022
In dieser Arbeit wird ein intrazellulärer Hochdurchsatz-Calciumfluoreszenz-Assay für 384-Well-Platten beschrieben, um kleine Molekülbibliotheken auf rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu screenen. Das Ziel, der Kinin-Rezeptor aus der Rinderpestzecke Rhipicephalus microplus, wird in CHO-K1-Zellen exprimiert. Dieser Assay identifiziert Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der gleichen Zellen in einem "Dual-Addition"-Assay.
Der Hochdurchsatz-Screening-Calciumfluoreszenz-Dual-Additions-Assay ermöglicht die Identifizierung neuartiger niedermolekularer Liganden eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors, der durch die intrazelluläre Calciumkaskade signalisiert. Der Hauptvorteil des Dual-Additions-Assays ist der Nachweis von Agonist und Antagonist HTS in einem einzigen Assay mit den gleichen Zellen, vorausgesetzt, das Fluoreszenzsignal dauert zwei Minuten. Diese Methode kann auf jeden GPCR angewendet werden, der durch die Calciumkaskade signalisiert, zu der der größte Teil der Arthropoden-Neuronen-Peptidfamilie, eines GPCRs, gehört.
Für die Reproduzierbarkeit des Assays ist es wichtig, die Zelldichte, die Injektionsgeschwindigkeit und die Konzentration des bekannten Agonisten für die zweite Auflage zu optimieren. Das Verfahren wird von Bianca Henriques-Santos, Postdoktorandin in meinem Labor, demonstriert. Der Calciumfluoreszenztest wird eingeleitet, indem das verbrauchte Medium aus dem T-75-Kolben entnommen wird, der drei Zellen mit 70 bis 90 % konfluentem BMLK enthält.
Waschen Sie die Zellen mit 10 Milliliter Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%igem Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure oder EDTA ablösen und drei bis fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie acht Milliliter selektives Medium hinzu und überführen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 15 Milliliter.
Vor dem Zentrifugieren der Zellsuspension bei 1000 x g für drei Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter F-12K-Medium, das 1% fötales Rinderserum oder FBS und 400 Mikrogramm pro Milliliter G418-Sulfat enthält. Um die Zelldichte der Suspension für eine weitere Verdünnung zu bestimmen, mischen Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in 20 Mikroliter 0,4% Trypanblau und laden Sie dann 20 Mikroliter Gemisch in eine Zellzählkammer, um von einem Zellzähler auf Zelldichte abgelesen zu werden.
Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem gleichen F-12K-Medium und füllen Sie das Endvolumen auf 15 Milliliter bei einer Dichte von viermal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter auf. Zur Aussaat der Zellen in der Poly-D-Lysin- oder PDL-kodierten 384-Well-Platte. Geben Sie 25 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension mit einem Liquid-Handling-System in 384 Vertiefungen der Platte.
Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid im befeuchteten Inkubator. Am nächsten Tag drehen Sie die 90%ige konfluente 384-Well-Platte schnell um. Um das verbrauchte Medium zu entfernen und zwei- bis dreimal vorsichtig auf sterile Papiertücher zu tupfen, um die gesamte Flüssigkeit von der Platte zu entfernen.
Führen Sie die nächsten Schritte im weichen Dämmerlicht im Inneren der Biosicherheitswerkbank durch. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter des Beladungsfarbstoffs in jede Vertiefung mit einem Liquid-Handling-System hinzu, indem Sie 12,5 Mikroliter in jede Vertiefung mit einer Aspirations- und Dosiergeschwindigkeit von 3,8 Mikrolitern pro Sekunde dosieren. Wiederholen Sie diesen Pipettierschritt, um ein Endvolumen von 25 Mikrolitern in jeder Vertiefung zu erreichen.
Wenn Sie fertig sind, decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Umgebungslicht zu schützen, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-befeuchteten Inkubator für 30 Minuten. Nach dem Äquilibrieren der abgedeckten Platte für weitere 30 Minuten sind die Zellen bereit für das Hochdurchsatz-Screening oder HTS. Als nächstes zentrifugieren Sie die Arzneimittelplatte bei 1200 x g in einer Plattenzentrifuge für eine Minute.
Die 10-fache Agonisten-Peptidlösung von Rhimi-K-1 wird in ein autofreundliches 150-Milliliter-Reservoir überführt. Klicken Sie im Plattenleser auf Protokolle verwalten. Wählen Sie dann im Endpunkt-Fluoreszenzintensitätsprotokoll die Option Flow Forte pre-read aus, klicken Sie auf Messung starten, um das Hintergrundsignal für den gesamten HTS-Assay zu messen.
Setzen Sie die Zellplatte in das Plattenlesegerät ein. Klicken Sie in der Instrumententafel auf eine zufällige Vertiefung auf der Platte und dann auf neue Fokushöhe. Klicken Sie auf Fokusanpassung.
Klicken Sie auf Verstärkungseinstellung. Weisen Sie ihm 5 % bis 10 % des maximal messbaren Fluoreszenzwerts zu. Klicken Sie auf Anpassung starten.
Klicken Sie auf Messung starten, um die gesamte Platte für das Hintergrundfluoreszenzsignal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) zu lesen. Klicken Sie während des Lesens der Platte auf den aktuellen Status, um den Messwert in Echtzeit anzuzeigen. Für den Dual-Addition-Assay pipettieren Sie 10 Mikroliter der Arzneimittellösung dreimal mit dem Liquid-Handling-System auf und ab und saugen 1,5 Mikroliter aus jeder Vertiefung der Arzneimittelplatte mit einer Aspirationsgeschwindigkeit von 1,0 Mikrolitern pro Sekunde ab.
0,5 Mikroliter der Verbindungen werden in den Zellassay gegeben, um eine Endkonzentration von zwei Mikromolaren in 0,2%igem Dimethylsulfoxid oder DMSO zu erreichen. Nach Zugabe der Screening-Verbindungen wird die Assay-Platte sofort in den Plattenleser eingesetzt. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung.
Entsorgen Sie einen Mikroliter Arzneimittellösung, der in den Deponien verbleibt, indem Sie die Deponien in ein 150-Milliliter-Abfallreservoir mit etwa 50 Millilitern DPBS eintauchen. Inkubieren Sie die Screening-Verbindungen mit den Zellen für insgesamt fünf Minuten, einschließlich der Zeit im Plattenleser in der Biosicherheitswerkbank bei ausgeschaltetem Licht. Als nächstes werden drei Mikroliter des Agonistenpeptids Rhimi-K-1 aus dem Reservoir in die Testplatte gegeben, wobei das Liquid-Handling-System mit 384 12,5-Mikroliter-Spitzen verwendet wird.
Legen Sie die Platte sofort in den Plattenleser. Klicken Sie auf das voreingestellte Leseprogramm und lesen Sie die Platte in Vorwärts- und Rückwärtsleserichtung. Berechnen Sie den Z'-Faktor für die Qualitätskontrolle jedes Plattenassays manuell.
Wählen Sie die Treffermoleküle manuell aus den Heatmaps auf der Online-HTS-Datenplattform aus und berechnen Sie die normalisierte prozentuale Aktivierung oder NPA und inhibitorische Aktivität oder I0 für die Agonistentreffer und Antagonistentreffer. Zur Demonstration dieses HTS-Assays wurde eine hauseigene Wirkstoffplatte SAC2-34-6170 verwendet, die aus 320 zufälligen kleinen Molekülen besteht. Das HTS hatte eine ausgezeichnete Assay-Qualität mit einem Z'-Faktor von 0,7, was widerspiegelt, dass die Assay-Qualität unabhängig von den getesteten Verbindungen ist.
Es ist wichtig, die Platte sofort nach der Zugabe des Agonisten zu lesen, da das Fluoreszenzsignal nur von kurzer Dauer ist. Nach diesem Verfahren sollte das identifizierte Treffermolekül durch Dosis-Wirkungs-Assays validiert und in Zellen getestet werden, die den Ziel-GPCR nicht exprimieren, um Off-Target-Treffer auszuschließen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt einen Hochdurchsatz-Test für intrazelluläres Calcium mittels Fluoreszenzmessung vor, der für 384-Well-Platten konzipiert ist und zur Untersuchung von kleinen Molekülbibliotheken an rekombinanten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) dient. Der Test ermöglicht die Identifizierung sowohl von Agonisten als auch von Antagonisten mittels einer Zwei-Zugabe-Methode unter Verwendung von CHO-K1-Zellen, die den Kininrezeptor von Rhipicephalus microplus exprimieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Pharmakologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) spielen eine entscheidende Rolle in der zellulären Signalübertragung.
- Die Kalziumsignalisierung ist ein zentraler Signalweg für viele GPCRs.
- Hochdurchsatz-Screening-Methoden (HTS) sind essenziell für die Arzneimittelforschung.
- Mit dem Doppelzugabe-Assay lässt sich die gleichzeitige Detektion von Agonisten und Antagonisten durchführen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines robusten Assays zur Identifizierung kleiner molekularer Liganden von GPCRs.
- Optimierung der Bedingungen für die Reproduzierbarkeit in HTS.
- Aufzeigen der Anwendung des Assays anhand eines spezifischen GPCR-Ziels.
Verwendete Methoden
- High-Throughput-Calcium-Fluoreszenz-Assay in 384-Well-Platten.
- Verwendung von CHO-K1-Zellen, die den Kininrezeptor exprimieren.
- Doppelte Zugabemethode zur gleichzeitigen Detektion von Liganden.
- Optimierung der Zelldichte, Injektionsgeschwindigkeit und Agonistenkonzentration.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Identifizierung neuartiger niedermolekularer Liganden.
- Nachgewiesene Reproduzierbarkeit des Assays unter optimierten Bedingungen.
- Die Dauer des Fluoreszenzsignals unterstützt den Ansatz mit doppelter Zugabe.
- Anwendbar auf verschiedene GPCRs, die über die Kalziumkaskade signalisieren.
Schlussfolgerungen
- Der Dualliganden-Zusatztest ist ein wertvolles Werkzeug für die Liganden-Screening von GPCRs.
- Optimierte Bedingungen erhöhen die Zuverlässigkeit und Effizienz des Assays.
- Diese Methode kann die Arzneimittelentwicklung in der Neurowissenschaft und Pharmakologie unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Calciumfluoreszenz-Assays mit hohem Durchsatz, die auf GPCRs abzielen, sind entscheidend für die frühe Arzneimittelforschung, da sie eine schnelle Identifizierung von kleinen Molekülen sowohl als Agonisten als auch als Antagonisten ermöglichen. Das Format mit zwei Zugaben verbessert die Effizienz des Screenings und die Datenqualität und wirkt sich somit direkt auf die Zielvalidierung sowie auf die Identifizierung von Leitstrukturen aus. Dieser Ansatz trägt zur Risikominimierung über das gesamte Portfolio hinweg bei, indem er robuste, quantitative Ergebnisse für fundierte Entscheidungen liefert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die funktionelle Untersuchung von GPCR-Zielen mittels Echtzeit-Detektion von Kalziumsignalen.
- Unterstützt die biologische Risikominimierung, indem agonistische und antagonistische Wirkungen in einem einzigen Test unterschieden werden.
- Verschafft vorhersagekräftige Sicherheit hinsichtlich Targetbindung und Signalwegsmodulation.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert validierte, reproduzierbare Testbedingungen zur Hochdurchsatz-Evaluierung von Verbindungen.
- Standardisiert quantitative Fluoreszenzmessungen für den Vergleich zwischen Mikrotiterplatten.
- Bereitet robuste biologische Systeme für skalierbare Screening-Kampagnen vor.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Ausrichtung an krankheitsrelevanten GPCR-Signalwegen für eine translationale Kontinuität.
- Bietet eine Plattform, die an verschiedene, bei menschlichen und tierärztlichen Erkrankungen beteiligte GPCR-Ziele angepasst werden kann.
- Ermöglicht die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Kandidatenmolekülen basierend auf deren funktionellen Aktivitätsprofilen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser Kalzium-Fluoreszenz-Assay mit Doppelzugabe integriert sich in die Schnittstelle zwischen früher Entdeckung und Wirkstoffidentifizierung und unterstützt sowohl die Target-Validierung als auch Workflows für Hochdurchsatz-Screenings.
- Entdeckungsbiochemie Ermöglicht die Hypothesenprüfung und die Reduzierung mechanistischer Risiken durch direkte Messung des GPCR-vermittelten Calcium-Flusses.
- Screening: Bietet reproduzierbare, quantitative Ergebnisse für eine zuverlässige Verbindungsklassifizierung und Trefferauswahl.
- Analytik: Bietet normalisierte Prozentwerte für die Aktivierung und hemmende Aktivität als Metriken für die vergleichende Analyse.
- Translationale Forschung Unterstützt die Kontinuität von der In-vitro-Entdeckung bis zur präklinischen Validierung bei Programmen, die auf GPCRs abzielen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Anpassbar an jeden GPCR, der die Kalziumkaskade aktiviert, wodurch die Plattformnutzung über verschiedene Wirkstoffportfolios hinweg maximiert wird.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Entdeckung von GPCR-Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Verbessert Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von HTS-Arbeitsabläufen.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und Kapitalnutzungseffizienz durch die Bereitstellung robuster, handlungsrelevanter Daten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidatenmolekülen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Entwicklung zellbasierten Assays und der Fluoreszenzanalytik.
- Benötigt Zugang zu automatisierter Flüssigkeitshandhabung und Hochdurchsatz-Plattenlesegeräten.
- Setzt eine strenge, übergreifende Standardisierung von Assay-Parametern und Datenanalyse voraus.
- Eignet sich für verschiedene rekombinante GPCRs, die über Calciummobilisierung signalisieren.
- Die Dauer des Fluoreszenzsignals und die unmittelbare Auswertung sind entscheidend für die Datenintegrität.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Calcium Fluorescence Assay and Data Analysis
7:40
Results: High-Throughput, Intracellular Calcium Fluorescence Assay Mediated Screening of Small Molecule Libraries on Recombinant G Protein-Coupled Receptors (GPCRs)
8:08
Conclusion
