Name: Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Lernen Sie die schnelle Isolierung von Plastoglobulen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien. Diese Methode ermöglicht effiziente biochemische Analysen und molekulare Untersuchungen.

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Die Forschung in der Lundquist-Laborgruppe wird durch Zuschüsse der NSF (MCB-2034631) und des USDA (MICL08607) an P.K.L. Die Autoren danken Dr. Carrie Hiser (MSU) für die Unterstützung bei der Entwicklung der cyanobakteriellen Plastoglobulen-Isolationsmethode.

1. Isolierung von groben Plastoglobulen
<ol><li>Rohe Plastoglobulenextraktion aus unbelastetem Maisblattgewebe<ol><li>Erwerben Sie sechs gesunde Maissämlinge, die etwa 3 Wochen alt sind und sich fast im V5-Wachstumsstadium befinden und etwa 120 g wiegen.</li>
		<li>Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stiels ab, tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad und transportieren Sie sie in den Kühlraum.</li>
		<li>Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer Schere in kleinere Stücke schneiden (ca. 5 cm x 5 cm).</li>
		<li>Die Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes wird in einem handelsüblichen Mixer in 350 ml Mahlpuffer vorsichtig, aber gründlich gemahlen (Tabelle 1). Starten und stoppen Sie den Mixer 5x-6x, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten sind. Verwenden Sie nicht höher als Stufe 7 auf dem Mixer.</li>
		<li>Das Homogenat wird durch eine Schicht 25 μm Nylongewebe auf einem großen Trichter in vier 250 ml Zentrifugenflaschen filtriert. Wiederholen Sie dann Schritt 1.1.4 mit der zweiten Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes.</li>
		<li>Das Filtrat gleichmäßig auf die vier Flaschen verteilen und 6 min bei 1.840 x g bei 4 °C zentrifugieren. Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe gelagert zu werden.</li>
		<li>Der resultierende Überstand wird abgegossen und das Pellet in 12 ml Medium R 0,2, das 0,2 M Saccharose enthält (Tabelle 1), vorsichtig resuspendiert, indem es mit sanften Bewegungen der Bürste geschwenkt und resuspendiert wird. Nachdem Sie jedes Pellet resuspendiert haben, tragen Sie die Suspension in die nächste Flasche und wiederholen Sie die Resuspension. Fassen Sie die Suspensionen in einer Flasche zusammen.</li>
		<li>Die gepoolte Suspension wird auf sechs 3-ml-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, wobei in jedem Röhrchen ein maximales Volumen von 2,5 ml erreicht wird.</li>
		<li>Beschallen Sie jede Röhre 4x für jeweils 10 s mit einem Spitzenbeschaller mit einer Amplitude von 100%. Achten Sie darauf, das Ultraschallhorn unter Wasser und von der Flüssigkeitsoberfläche fernzuhalten, um ein Aufschäumen zu vermeiden.</li>
		<li>Bewegen Sie das Ultraschallhorn während jeder Runde langsam innerhalb der Aufhängung auf und ab. Wechseln Sie zwischen den vier Röhrchen und geben Sie jedes Röhrchen nach jeder Beschallung in einen Eiskübel zurück, damit die Probe abkühlen kann.</li>
		<li>Die beschallte rohe Thylakoidsuspension wird bei 150.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobulen wird mit einer Spritze und einer 22-G-Nadel von der Oberfläche des Saccharosekissens (leicht als gelbes, öliges Pad erkannt) geerntet, indem die Oberfläche des Kissens mit der Öffnung der Nadel abgeschöpft wird, wobei ca. 500 μl aus jedem Röhrchen gewonnen werden. In ein 2,0 ml Röhrchen geben.</li>
		<li>Sammeln Sie Aliquots des rohen Thylakoids vor und nach der Beschallung und Freisetzung von Plastoglobuli. Fahren Sie mit Schritt 2.1 fort. Alternativ können die rohen Plastoglobuli bei −80 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt gereinigt werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Rohe Plastoglobulenextraktion aus ausgetrocknetem E. nindensis-Blattgewebe<ol><li>Erwerben Sie einen Topf (bestehend aus drei einzelnen Pflanzen pro Topf) mit vollständig ausgetrocknetem, 8-9 Wochen alter E. nindensis (fast 40 g Gewebe).</li>
		<li>Schneiden Sie das gesamte Blattgewebe von der Basis der Pflanze, direkt über dem Boden, mit einer Schere ab und tauchen Sie das Gewebe sofort in ein Eisbad. Transportieren Sie das Gewebe in den Kühlraum.</li>
		<li>Arbeiten Sie unter einer grünen Sicherheitslampe, schneiden Sie das E. Nindensis-Blätter mit einer Schere in kleinere Stücke (ca. 5 cm x 5 cm) zerlegen.</li>
		<li>Mahlen Sie die Blätter vorsichtig, aber gründlich mit 100 ml Mahlpuffer (Tabelle 1) in einem handelsüblichen Mixer. Starten Sie den Mixer mehrmals, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten werden. Verwenden Sie nicht höher als Stufe 7 auf dem Mixer.</li>
		<li>Das Homogenat wird durch eine Schicht 25-μm-Nylongewebe auf einem großen Trichter in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben filtriert. Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe gelagert zu werden.</li>
		<li>Geben Sie die entsprechende Menge Saccharose hinzu, um eine Endkonzentration von 0,5 M zu erreichen, und verteilen Sie die Lösung in 250 ml Zentrifugenröhrchen. HINWEIS: Eine höhere Konzentration von Saccharose im Vergleich zum Z. mays-Präparat wird verwendet, um die Flotation der zytosolischen Lipidtröpfchen vor der anschließenden Beschallung/Freisetzung der Thylakoid-gebundenen Plastoglobulen zu gewährleisten.</li>
		<li>Die Röhrchen werden bei 45.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Eine Mischung aus Plastoglobuli und zytosolischen Lipidtröpfchen ist leicht als gelbes, öliges Pad auf oder nahe der Oberfläche des Saccharosekissens zu sehen (Abbildung 1B). Sammeln Sie das schwimmende Material mit einer Spritze mit einer 22-G-Nadel, indem Sie die Oberfläche des Kissens mit der Öffnung der Nadel abschöpfen und in ein Röhrchen geben.</li>
		<li>Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand nach dem Sammeln des frei schwebenden Plastoglobulen-Lipid-Tröpfchen-Gemischs.</li>
		<li>Um die Plastoglobuli zu isolieren, die mit dem restlichen Thylakoid verbunden sind, resuspendieren Sie das Pellet in 12 ml Medium R 0,2 durch Schwenken und Resuspendieren mit sanften Bewegungen der Bürste. Fassen Sie die Suspensionen in einer Flasche zusammen. Fahren Sie mit Schritt 1.1.8 fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Rohe Plastoglobulenextraktion aus Cyanobakterien<ol><li>Man züchtet eine 50 ml Kultur von Synechocystis sp. PCC 6803 bis zur stationären Phase (ca. 7-10 Tage) und stellt die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf einen OD750 von 2,0 ein. Für Kulturbedingungen verwenden Sie BG-11-Medien und züchten Sie in einem Inkubator bei einer Lichtintensität von 150 μmol Photonen/m2/s, 2% CO2,32 °C und mit kontinuierlichem Schütteln bei 150 U/min.</li>
		<li>Um die Polysaccharide zu entfernen, waschen Sie die Zellen, indem Sie die 50 ml Kultur bei 6.000 x g für 45 min bei 4 °C zentrifugieren und anschließend den Überstand entfernen. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal in 50 ml Puffer A (Tabelle 1). Ein aliquoter Teil des Zellhomogenats wird entfernt und vor dem Zentrifugieren beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtzellprobe aufbewahrt zu werden</li>
		<li>Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 ml Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1.100 psi auf, wiederholen Sie den Vorgang 3x (legen Sie die Probe zwischen jedem Zyklus auf Eis, um eine Proteindenaturierung zu vermeiden), bis sich die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot-blau-grün ändert. Verwenden Sie eine vorgekühlte Zelle und führen Sie diesen Schritt im Kühlraum durch.</li>
		<li>Das resultierende Homogenat wird auf acht 3-ml-Ultrazentrifugenröhrchen verteilt, die mit maximal 2,5 mL gefüllt sind, und dann vorsichtig mit 400 μL Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient erzeugt wird. ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation25,26.</li>
		<li>Die Röhrchen werden bei Bedarf durch Zugabe von zusätzlichem Medium R vorsichtig ausbalanciert und 30 min bei 150.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Das Thylakoid und andere schwerere Organellen (einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper) pelletieren, während Plastoglobulen leicht als gelbes, öliges Pad auf oder nahe der Oberseite des Saccharosegradienten zu sehen sind (Abbildung 1C).</li>
		<li>Ernten Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobuli mit einer Spritze und einer 22G-Nadel und geben Sie es in ein 2-ml-Röhrchen. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit der Nadelspitze seitlich von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.</li>
		<li>Fahren Sie mit Schritt 2.2 fort. Alternativ lagern Sie rohe Plastoglobuli bei -80 °C und reinigen Sie sie später.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Gewinnung von reinen Plastoglobuli
<ol><li>Verarbeitung von pflanzlichem Gewebe<ol><li>Herstellung von Saccharosegradienten in 2,5 mL Ultrazentrifugenröhrchen durch Schichten mit 500 μL rohen Plastoglobulen aus Schritt 1.1 oder Schritt 1.2, gemischt mit 500 μL Medium R 0,7, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erhalten, dann mit 400 μL Medium R 0,2 zu überlagern, gefolgt von einer Überlagerung mit 400 μL Medium R. ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation25,26.</li>
		<li>Wägen Sie die Röhrchen vorsichtig aus, indem Sie bei Bedarf überschüssiges Medium R in die oberste Schicht geben. Anschließend bei 150.000 x g für 1,5 h bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Das resultierende schwimmende Pad aus reinen Plastoglobulen (Abbildung 1A) wird mit einer Spritze und einer 22G-Nadel entnommen und in ein 2-ml-Röhrchen gegeben. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit der Nadelspitze von der Oberseite der Zentrifugenröhrchenwand ab.</li>
		<li>Die reinen Plastoglobuli aliquotieren und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Direkt bei -80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Cyanobakterien-Verarbeitung<ol><li>Es wird ein Saccharosegradient in vier 2,5-ml-Ultrazentrifugenröhrchen hergestellt, die zuerst mit 500 μL der rohen Plastoglobuli aus Schritt 1.3 geschichtet sind, die mit 750 μL des Mediums R 0,7 gemischt sind, und dann mit 750 μL des Mediums R 0,2 überlagert werden. ANMERKUNG: Siehe Yang et al. und Kelekar et al. für detaillierte Beschreibungen der Saccharosegradientenpräparation25,26.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den Saccharosegradienten bei 150.000 x g für 90 min bei 4 °C. Die reinen Plastoglobuli (Abbildung 1C) werden mit einer Spritze und einer 22-g-Nadel aus der oberen Phase des Saccharosegradienten entnommen und in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt.</li>
		<li>Die reinen Plastoglobuli aliquotieren und in flüssigem Stickstoff schockgefrieren. Direkt bei −80 °C lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Um physiologische/biochemische Veränderungen des Materials zu minimieren und bestimmte photo- und thermolabile Prenyl-Lipid-Pigmente zu schützen, die ein reicher Bestandteil von Plastoglobuli sind, ist es wichtig, die Isolierung bei 4 °C und vor Licht geschützt durchzuführen. Wie oben angedeutet, werden die ersten Schritte im Kühlraum unter einer Sicherheitslampe mit einer grün emittierenden Glühbirne durchgeführt. Die weiteren Schritte im Labor erfolgen unter gedimmtem Licht und verwenden Eis oder gekühlte Zentrifugatio...

Das aktuelle Verständnis der Zusammensetzung und Funktion von Plastoglobulen ist durch detaillierte proteomische und lipidomische Studien entstanden 1,2,3,4,5. Solche Studien wurden durch eine schnelle und effektive Isolierungsmethode erheblich unterstützt, die auf ihrer sehr geringen Dichte für eine effiziente Trennung unter Verwendung von Saccharosegradienten beruht. Erste Methoden zur Isolierung von Plastoglobulen wurden von Arten wie Buche (Fagus sylvatica), Ginster (Sarothamnus scoparius), Zwiebel (Allium cepa), Spinat (Spinacia oleracea), Stiefmütterchen (Viola tricolor), Pfeffer (Capsicum annuum) und Erbsen (Pisum sativum) erreicht6,7,8,9,10,11 ,12,13. Eine aktualisierte Methode, um Chloroplasten-Plastoglobuli effizienter und ertragreicher zu isolieren, wurde später von Ytterberg et al.3,14 vorgestellt. Während wir ursprünglich für die Untersuchung der Plastoglobulen von Arabidopsis thaliana Blattchloroplasten eingesetzt wurden, haben wir diese aktualisierte Methode erfolgreich für das gesunde Blattgewebe anderer Pflanzenarten eingesetzt, sowohl für Monokotylen als auch für Dikotylen, einschließlich Mais (Zea mays), Tomate (Solanum lycopersicum), Liebesgras (Eragrostis nindensis), Purpur-Falschbrome (Brachypodium distachyon) und Wildtabak (Nicotiana benthamiana ; unveröffentlichte Ergebnisse). Darüber hinaus wurde die Isolierungsmethode erfolgreich an die Plastoglobulen von Cyanobakterien, einschließlich Synechocystis sp. PCC 6803 und Anabaena sp. PCC 712015, und das ausgetrocknete Blattgewebe der Auferstehungspflanze, E. nindensis, angepasst.
Chloroplasten-Plastoglobuli von gesundem Blattgewebe sind physikalisch mit den Thylakoidmembranenverbunden 16. Trotz dieser physikalischen Kontinuität behalten die beiden Chloroplasten-Unterkompartimente unterschiedliche Lipid- und Proteinzusammensetzungen bei, obwohl der regulierte Austausch von Lipid und Protein zwischen den beiden Kompartimenten vorgeschlagen wurde 2,4,17,18,19. Tatsächlich wurde kürzlich ein interessantes Hemifusionsmodell für den Transport neutraler Lipide zwischen Chloroplasten und Zytosol19 vorgeschlagen. Aufgrund der physikalischen Kontinuität von Plastoglobuli und Thylakoiden beginnt die Isolationsmethode mit gesundem Blattgewebe mit der Entnahme eines pelletierten rohen Thylakoidpräparats, das anschließend beschallt wird, um die Plastoglobulen von den Thylakoiden zu trennen, was im Gegensatz zu Verfahren zur Isolierung zytosolischer Lipidtröpfchensteht 20 . Die Ultrazentrifugation auf einem Saccharosekissen führt dann die Plastoglobuli niedriger Dichte durch die Saccharose nach oben und trennt sie effektiv von den Thylakoiden, Kernen und anderem Material mit hoher Dichte. Im Gegensatz dazu existieren Plastoglobuli in Cyanobakterien, wie auch solche von ausgetrocknetem Blattgewebe, in vivo offenbar in frei schwebender Form. Daher beinhaltet ihre Isolierung ein direktes Schweben auf einem Saccharosegradienten. Dieser Artikel demonstriert die Isolationsmethode aus gesundem Blattgewebe und demonstriert zwei Variationen, die verwendet werden können, um Plastoglobulen aus ausgetrocknetem Blattgewebe oder Cyanobakterienkulturen zu isolieren, was die physiologische Breite und den evolutionären Kontext, in dem Plastoglobulen untersucht werden können, erheblich erweitert.
Isolierte Plastoglobuli können anschließend für beliebig viele nachgeschaltete Analysen zur Untersuchung molekularer Eigenschaften verwendet werden. Wir haben die isolierten Plastoglobuli aus A. thaliana Blattgewebe für umfangreiche proteomische und lipidomische Analysen unter unterschiedlichen Umweltbedingungen oder Genotypen verwendet, um die selektive Modifikation der Protein- und Lipidzusammensetzung bei der Anpassung an Stresszu demonstrieren 2,4,21,22. Darüber hinaus wurden In-vitro-Kinase-Assays durchgeführt, die eine Transphosphorylierungsaktivität im Zusammenhang mit isolierten Plastoglobulen zeigen 22, die oligomeren Zustände von Proteinkomponenten wurden unter Verwendung der nativen Gelelektrophorese untersucht 21 und Protease-Rasier-Assays durchgeführt 23.
Der Hauptvorteil dieser Methode ist die relative Geschwindigkeit des Verfahrens. Unserer Erfahrung nach können die unten beschriebenen Protokolle innerhalb von ca. 4 Stunden vollständig abgeschlossen werden. Es wurde eine alternative Methode zur Isolierung von Plastoglobulen aus Blattgewebe beschrieben, die die gleichzeitige Isolierung anderer Chloroplasten-Unterkompartimenteermöglicht 24. Diese alternative Methode bietet einige klare Vorteile, wenn ein quantitativer Vergleich mit den anderen Chloroplasten-Unterkompartimenten notwendig oder erwünscht ist. Diese alternative Methode ist jedoch auch langwieriger und liefert eine deutlich geringere Ausbeute an isolierten Plastoglobulen aus vergleichbaren Mengen an Blattgewebe. Wenn eine fokussierte Untersuchung von Plastoglobuli das Ziel ist, ist die hier skizzierte Methodik die optimale Wahl. Nichtsdestotrotz können während der Probenvorbereitung Gesamtblatt- und rohe Thylakoid-Aliquots gesammelt werden, und es wird dringend empfohlen, dies zu tun, um Referenzproben für den anschließenden Vergleich zu haben.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbat</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glycerophosphat. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Proliant Biologisch</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Chymostatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Französische Druckzelle (Modell FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Schüttelinkubator</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Cystein</td><td>MP Biochemikalien</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfluorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Natriumorthovanadat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyrophosphat & Middot; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W fluoreszierende Gro-Lux Röhrenglühbirne, 18"</td> <td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Mixer (1,2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Kommerzieller Mixer</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von plastoglobulen-lipidtröpfchen aus pflanzlichem blattgewebe und cyanobakterien

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobuläre Lipidtröpfchen sind ein dynamisches Unterkompartiment von pflanzlichen Chloroplasten und Cyanobakterien. Es wird angenommen, dass sie ubiquitär unter photosynthetischen Arten vorkommen und eine zentrale Rolle bei der Anpassung und dem Umbau der Thylakoidmembran unter sich schnell ändernden Umweltbedingungen spielen. Die Fähigkeit, Plastoglobulen von hoher Reinheit zu isolieren, hat ihre Untersuchung durch proteomische, lipidomische und andere Methoden erheblich erleichtert. Mit Plastoglobuli von hoher Reinheit und Ausbeute ist es möglich, ihre Lipid- und Proteinzusammensetzung, enzymatische Aktivität und Proteintopologie sowie andere mögliche molekulare Eigenschaften zu untersuchen. Dieser Artikel stellt ein schnelles und effektives Protokoll für die Isolierung von Plastoglobuli aus Chloroplasten von pflanzlichem Blattgewebe vor und stellt methodische Variationen für die Isolierung von Plastoglobulen und verwandten Lipidtröpfchenstrukturen aus Maisblättern, dem ausgetrockneten Blattgewebe der Auferstehungspflanze, Eragrostis nindensis, und dem Cyanobakterium, Synechocystis , vor PCC 6803. Die Isolierung beruht auf der geringen Dichte dieser lipidreichen Partikel, was ihre Reinigung durch Saccharosedichteflotation erleichtert. Diese Methodik wird sich bei der Untersuchung von Plastoglobuli verschiedener Arten als wertvoll erweisen.

Nach Abschluss von Schritt 1 des Protokolls sollte man in der Lage sein, eine beträchtliche Menge an Plastoglobulen-/Lipidtröpfchenmaterial auf (oder in der Nähe) der obersten Schicht des Saccharosekissens zu sehen (Abbildung 1B-C). In dieser Phase könnten auch andere Fraktionen gesammelt werden. Zum Beispiel werden die Thylakoide pelletiert und können für nachfolgende Analysen mit dem Medium R 0,2 resuspendiert werden. Nach anschließender Zentrifugation wer...

Es wird ein schnelles und effizientes Protokoll für die Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen vorgestellt, die mit verschiedenen photosynthetischen Organismen assoziiert sind. Die erfolgreiche Herstellung isolierter Plastoglobuli ist ein entscheidender erster Schritt, der detaillierten molekularen Untersuchungen wie proteomischen und lipidomischen Analysen vorausgeht.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

Die Isolierung hochreiner Plastoglobuli ist für ihre Untersuchung entscheidend. Ein schnelles und effektives Protokoll für ihre Isolierung, das ihre nachgelagerte biochemische Untersuchung erleichtert, wird hier vorgestellt. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in der relativen Geschwindigkeit des Verfahrens und ihrer Anpassungsfähigkeit an zahlreiche Pflanzenarten und Umweltbedingungen.Bei der Beschallung von Thylakoid-Resuspensionen ist besondere Vorsicht geboten, um eine ausreichende Kraft zum Entfernen von Plastoglobulen aus Thylakoiden und bei der anschließenden Extraktion von Plastoglobulen aus dem Saccharosegradienten zu gewährleisten. Dieses Verfahren wird von Dr. Elsinraju Devadasu, einem Postdoktoranden in meinem Labor, und Febri Susanto, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit dem Erwerb von drei Wochen alten Sämlingen von sechs gesunden Maissorten mit V5-Wachstumsstadium und einem Gewicht von etwa 120 Gramm.Schneiden Sie alle Blätter an der Basis des Stängels ab und tauchen Sie sie schnell in ein Eisbad, bevor Sie sie in den Kühlraum transportieren. Unter einer grünen Sicherheitslampe die Maisblätter aus dem Eisbad nehmen und mit einer Schere in kleinere, fünf mal fünf Zentimeter große Stücke schneiden. Mahlen Sie vorsichtig und gründlich die Hälfte des abgeschnittenen Blattgewebes in 350 Milliliter des Mahlpuffers auf einem Niveau von weniger als sieben auf einem handelsüblichen Mixer.Starten und stoppen Sie den Mixer fünf- bis sechsmal, um sicherzustellen, dass alle Blätter geschnitten sind. Filtrieren Sie das Homogenat durch eine Schicht 25-Mikron-Nylontuch auf einem großen Trichter zu vier 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen. Nachdem Sie den Mischschritt mit dem verbleibenden abgeschnittenen Blattgewebe wiederholt haben, verteilen Sie das Filtrat gleichmäßig auf die vier Flaschen.Ein aliquoter Teil des Blattfiltrats wird entfernt und beiseite gestellt, um als repräsentative Gesamtblattprobe aufbewahrt zu werden. Anschließend wird das Filtrat sechs Minuten lang bei 1,840 g und vier Grad Celsius zentrifugiert. Gießen Sie den resultierenden Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet mit sanften Wirbelbewegungen der Bürste in 12 Milliliter Medium R 0,2, das 0,2 molare Saccharose enthält.Nachdem Sie das Pellet in einer Flasche resuspendiert haben, geben Sie die Suspension in die nächste Flasche und wiederholen Sie die Resuspension, um die Suspensionen in einer Flasche zu sammeln. Verteilen Sie die gepoolte Suspension auf sechs Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, wobei in jedem Röhrchen ein maximales Volumen von 2,5 Millilitern erreicht wird. Verwenden Sie dann den Spitzenbeschaller mit einer Amplitude von 100%, um jede Röhre viermal für jeweils 10 Sekunden zu beschallen.Stellen Sie sicher, dass das Ultraschallhorn unter Wasser und von der Flüssigkeitsoberfläche ferngehalten wird, um ein Aufschäumen zu vermeiden. Bewegen Sie das Ultraschallhorn während jeder Runde langsam innerhalb der Aufhängung auf und ab. Während Sie die vier Röhrchen abwechseln, geben Sie jedes Röhrchen nach jeder Beschallung in einen Eiskübel zurück, damit die Probe abkühlen kann.Anschließend wird die beschallte rohe Thylakoidsuspension bei 150.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Schöpfen Sie die Kissenoberfläche mit einer Spritze und einer 22-Gauge-Nadel ab und entnehmen Sie das resultierende gelbe und ölige Schwimmkissen aus rohen Plastoglobulen aus dem Saccharosekissen. Gewinnen Sie ca. 500 Mikroliter aus jedem Röhrchen zurück und geben Sie sie in ein 2,0-Milliliter-Röhrchen.Sammeln Sie rohe Thylakoid-Aliquots vor und nach der Beschallung und Freisetzung von Plastoglobuli. Danach setzen Sie entweder die Verarbeitung des Pflanzengewebes fort oder lagern Sie die rohen Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius und reinigen Sie sie später. Züchten Sie 50 Milliliter Synechocystis-Spezies PCC 6802-Kultur in BG11-Medien für 7 bis 10 Tage, um die stationäre Phase zu erreichen.Stellen Sie die Zelldichte mit einem Spektralphotometer auf eine optische Dichte von 2,0 bei 750 Nanometern ein. Um die Polysaccharide zu entfernen, zentrifugieren Sie 50 Milliliter Kultur und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie das Waschen der Zellen in 50 Milliliter Puffer A zweimal.Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 25 Milliliter Puffer A und brechen Sie die Zellen mit einer französischen Druckzelle bei 1, 100 Pfund Quadratzoll. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal unter kalten Bedingungen, bis die lysierte Farbe unter weißem Licht von grün zu rot, blau, grün wechselt. Das aliquot des Zellhomogenats wird entfernt und beiseite gestellt, um es als repräsentative Gesamtzellprobe aufzubewahren.Verteilen Sie das resultierende Homogenat in acht Drei-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen, die in jedem Röhrchen maximal 2,5 Milliliter gefüllt sind. Dieses Homogenat wird mit 400 Mikrolitern Medium R überlagert, wodurch ein Stufengradient entsteht. Die Röhrchen sorgfältig ausbalancieren, indem Sie bei Bedarf zusätzliches Medium R hinzufügen, bevor Sie die Röhrchen zentrifugieren.Das Thylakoid und andere schwerere Organellen, einschließlich aller Polyhydroxyalkanoatkörper, zeigen eine Pelletbildung, während Plastoglobulen ein gelbes öliges Pad auf oder nahe der Oberseite des Saccharosegradienten bilden. Ernten Sie das resultierende schwimmende Pad aus rohen Plastoglobulen mit einer Spritze, wie bereits gezeigt, und legen Sie die Ernte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Kratzen Sie die Plastoglobuli bei Bedarf mit einer Nadelspitze seitlich von der Wand des Ultrazentrifugenröhrchens ab.Entweder mit der Cyanobakterien-Verarbeitung fortfahren oder rohe Plastoglobuli bei minus 80 Grad Celsius lagern und später reinigen. Um die reinen Plastoglobulen unter Verwendung der Methode der Pflanzengewebeverarbeitung zu ernten, bereiten Sie den zuvor beschriebenen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern roher Plastoglobuli, 400 Mikrolitern Medium R 0,2 und 400 Mikrolitern Medium R vor.Nach der Zentrifugation wird das resultierende schwimmende Pad aus reinen Plastoglobulen in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen geerntet. Nach dem Aliquotieren der reinen Plastoglobuli und dem Schockgefrieren der Aliquoten in flüssigem Stickstoff lagern Sie sie entweder bei minus 80 Grad Celsius oder lyophilisieren Sie sie zu einem trockenen Pulver.Um reine Plastoglobulen aus Cyanobakterien zu ernten, erzeugen Sie, wie bereits erwähnt, einen Saccharosegradienten unter Verwendung von 500 Mikrolitern der rohen Plastoglobuli, 750 Mikroliter Medium R 0,7 und 750 Mikroliter Medium R 0,2. Nach der Zentrifugation werden die reinen Plastoglobuli in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt und die reinen Plastoglobuli aliquotiert. Anschließend die reinen Plastoglobuli aliquot in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und direkt bei minus 80 Grad Celsius lagern oder zu einem trockenen Pulver gefrieren.Bei dieser Methode wurde eine signifikante Menge an Plastoglobulen- oder Lipidtröpfchenmaterial auf der obersten Schicht des Saccharosekissens schwimmend gesehen. Nach anschließender Zentrifugation wurden gereinigte Plastoglobulen an oder nahe der Oberfläche des Saccharosegradienten erhalten. Nach der erfolgreichen Isolierung von Plastoglobuli zeigten Immunoblots, die zur Reinheitsbeurteilung mit Antikörpern gegen Arabidopsis thaliana Fibrillin 1a und Arabidopsis thaliana Photosystem II Untereinheit D1 entwickelt wurden, dass die Fibrillin-Homologe primär mit Thylakoiden assoziiert waren als die Plastoglobuli.Um eine effiziente und konzentrierte Extraktion des schwimmenden Pads zu gewährleisten, platzieren Sie die Spritzennadelöffnung direkt unter der Flüssigkeitsoberfläche des Puffers, während Sie vollständig eingetaucht sind, und ziehen Sie sie dann vorsichtig nach oben. Isolierte Plastoglobulenproben sind für nachfolgende proteomische oder lipidomische Studien geeignet und wurden verwendet, um die Veränderungen in der angestrebten Protein-Lipid-Zusammensetzung unter verschiedenen Umweltbedingungen nachzuweisen. Diese Technik hat neue Studien der Plastoglobule ermöglicht, einschließlich der Entdeckung der assoziierten Proteinkinaseaktivität und des Vorhandenseins von oligomeren Proteinkomplexen durch nachfolgende biochemische Untersuchungen.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zusammensetzung der polaren Lipid-Extrakte und der Fettsäure-Zusammensetzung der einzelnen Glycerolipide sind in einem einfachen und robusten Lipid-Profiling Experiment bestimmt. Zu diesem Zweck sind Glycerolipide durch Dünnschicht-Chromatographie isoliert und Transmethylierung ihrer Acylgruppen. Fatty Acyl Methylester durch Gas-Flüssigkeits-Chromatographie quantifiziert.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Gas-Flüssigkeits-Chromatographie (GLC) Coupled

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Quelle: Shivaiah, K., et al. Isolierung von Plastoglobuli-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die Isolierung von Plastoglobuli aus Cyanobakterien mittels Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, wobei ihre lipidreiche Natur mit geringer Dichte hervorgehoben und ihre strukturelle Erhaltung für die nachgelagerte Analyse sichergestellt wird.

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Hier beschreiben wir eine Methode, um intakte Chloroplasten aus Arabidopsis Blättern und ihre drei Sub-Hauptfächer (Umschlag, Stroma und Thylakoids), reinigen mit einer Kombination von differenziellen Centrifugations, kontinuierliche Percoll Gradienten und diskontinuierliche Saccharose Steigungen. Die Methode ist wertvoll für Subplastidial und subzelluläre Lokalisierung der Proteine durch Immunoblotting und Proteomik.

Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Dieses Protokoll stellt eine neuartige Methode der Lipid Droplet Isolation und Reinigung von Maus Lebern, mit einem etablierten endoplasmatische Retikulum Isolierung-Kit.

Rasche Lipid Droplet Isolation Protokoll verwendet eine gut etablierte Organell-Isolierungskit

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Isolierung und Charakterisierung intakter Phycobilisomen in Cyanobakterien

Lernen Sie die schnelle Isolierung von Plastoglobulen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien. Diese Methode ermöglicht effiziente biochemische Analysen und molekulare Untersuchungen.

Isolierung von Plastoglobulen-Lipidtröpfchen aus pflanzlichem Blattgewebe und Cyanobakterien

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