Name: Skalierbare, flexible und kostengünstige Keimlingsveredelung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Lernen Sie eine kostengünstige Keimlingsveredelungsmethode für Pflanzenbiologie ohne Vorerfahrung. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Langstreckensignalen mit Standardlabormaterialien.

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Vielen Dank an Javier Brumos für die Erstausbildung und Anleitung bei der Veredelung von Arabidopsis-Sämlingen .

1. Vorbereitung des Geräts
<ol><li>Stellen Sie die Silikonpfropfvorrichtung her, indem Sie die Silikonelastomerlösung in eine quadratische Petrischale (100 mm x 100 mm) gießen. Bereiten Sie 15 ml der Elastomerlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. HINWEIS: Silikonelastomer-Kits enthalten typischerweise eine Flüssigkeit auf Silikonbasis und ein Härtungsmittel, die beim Mischen das Silikon verfestigen lassen.</li>
	<li>Bereiten Sie die quadratische Petrischale vor, indem Sie vier gerade Stücke 29-g-Draht in die quadratische Petrischale legen, die gleich weit voneinander entfernt sind (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass der Draht bündig mit dem Boden der Form abschließt. Um den Draht vollständig zu begradigen, rollen Sie ihn auf einer harten, gleichmäßigen Oberfläche mit einem schweren und flachen Gegenstand (z. B. einem Metallrohrgestell). HINWEIS: Kabelbinder enthalten oft 29 G Draht und können nach dem Entfernen der äußeren Papierbeschichtung mit Aceton verwendet werden.</li>
	<li>Gießen Sie die gemischte Silikonelastomerlösung auf die Drähte und bedecken Sie sie mit der Oberseite der Petrischale. Lassen Sie das Silikon 24-48 h bei Raumtemperatur aushärten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Silikonfolie mit einer sauberen Pinzette aus der Petrischale und bewegen Sie sie auf eine saubere, ebene Fläche.</li>
	<li>Entfernen Sie die Drähte von der Silikonfolie. Entfernen Sie die dünne Silikonschicht, die auf der Außenseite des Kanals verbleibt, mit einer Zange, damit der Kanal auf einer Seite offen ist (Abbildung 1A).</li>
	<li>Schneiden Sie die Silikonfolie senkrecht zu den Kanälen mit einer sauberen Schere in 3 mm dicke Streifen. Legen Sie jeden Streifen in einen Aluminiumfolienumschlag und verschließen Sie ihn mit Autoklavenband.</li>
	<li>Autoklavieren Sie die Streifen mindestens 30 Minuten lang bei 121 °C und lagern Sie sie bis zur Verwendung.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Sämlings
<ol><li>Samen sterilisieren und vernalisieren.<ol><li>Suspendieren Sie bis zu 100 Arabidopsis-Samen in 1 ml 50%iger Bleichlösung, die 0,1% Tween 20 enthält, in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie sie 5-10 Minuten lang. Entfernen Sie die Bleichlösung durch Pipettieren oder Aspirieren unter sterilen Bedingungen. Spülen Sie die Samen mit 1 ml sterilisiertem dH2O. Achten Sie darauf, die Röhrchen umzudrehen, um die Samen ausreichend zu spülen, und entfernen Sie alle Bleichlösung, die oben im Röhrchen verbleibt. Wiederholen Sie das Spülen 4x.</li>
		<li>Lassen Sie ca. 0,25 ml Wasser in den Röhrchen mit den Samen und lagern Sie sie 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln.</li>
	</ol></li>
	<li>Tellern Sie die Samen in Vorbereitung auf das Pfropfen.<ol><li>Bereiten Sie eine 1%ige Agar-MS-Platte wie folgt vor: Mischen Sie für 1 l MS (0,5% Saccharose) festes Medium 4,4 g MS-Salz, 5 g Saccharose und 10 g Agar in 800 ml Wasser, stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 5,7 ein und bringen Sie dann das Gesamtvolumen mit zusätzlichem Wasser auf 1 l. Autoklavieren Sie mindestens 20 Minuten, bevor Sie ~25 ml in die quadratischen Petrischalen gießen.</li>
		<li>Bewegen Sie unter sterilen Bedingungen die entsprechende Anzahl der vorbereiteten Samen auf den Teller, wobei Sie eine 20-μl-Pipettenspitze verwenden, um die Samen abzusaugen und zu übertragen.</li>
		<li>Legen Sie einen sterilen Streifen auf die Plattenoberfläche, um die Samenpositionierung zu steuern, sodass die Samen mit den Kanälen auf dem Streifen ausgerichtet sind. Entfernen Sie den Streifen, sobald die Samen plattiert sind. HINWEIS: Eine quadratische Platte mit den Maßen 100 mm x 100 mm kann zwei Reihen von Sämlingen aufnehmen (Abbildung 1B).</li>
		<li>Sobald die Platten aufstehen, lassen Sie die Flüssigkeit aus dem festen Medium verdampfen und sammeln Sie sich am Boden der Platte. Nachdem die Samen auf den Teller gelegt wurden, legen Sie den Tellerdeckel auf und versiegeln Sie eine Seite des Tellers, die parallel zu den beiden Samenreihen verläuft (gekennzeichnet durch den blau hervorgehobenen Bereich in Abbildung 1B), mit Parafilm. Wickeln Sie atmungsaktives Klebeband auf den Parafilm und um alle anderen Kanten der Platte.</li>
	</ol></li>
	<li>Stellen Sie zwei Platten vorsichtig mit der mit Parafilm versiegelten Seite nach unten auf. Trennen Sie die beiden Platten an der Unterseite, indem Sie ein horizontales 15-ml-Zentrifugenröhrchen dazwischen legen und mit einem Gummiband sichern. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberflächen einen Winkel von 100°-110° zur Tischoberfläche bilden (Abbildung 1C).</li>
	<li>Lagern Sie die Platten in dieser Ausrichtung für 72 h in völliger Dunkelheit bei 21 °C, damit die Hypokotyle des Keimlings ~5 mm lang werden können. Entfernen Sie die Platten nach 72 h aus der Dunkelheit und wachsen Sie vor dem Pfropfen unter 16 h Licht (Intensität von 100 μE m-2 sec-1) und 8 h Dunkelzyklen für weitere 2-4 Tage bei der gleichen Temperatur.</li>
	<li>Pfropfen Sie die Sämlinge zwischen 5 und 7 Tagen nach dem Anplattieren. Legen Sie einen Pfropfstreifen über die Sämlinge und passen Sie ihre Hypokotyle in die Kanäle an. Positionieren Sie den Sämling vorsichtig so, dass der Wurzel-Hypokotyl-Übergang am unteren Rand des Silikonstreifens positioniert ist, um den Sämling für den Schnitt vorzubereiten (Abbildung 1D).</li>
</ol>3. Pfropfverfahren
<ol><li>Bereiten Sie eine sterile Arbeitsumgebung vor, indem Sie ein Dissektionsrohr mit 70% Ethanol desinfizieren und zwei Paar Pinzetten mit feiner Spitze und einen Skalpellgriff autoklavieren. Führen Sie alle Pfropfvorgänge in einer sterilen Haube und bei Bedarf mit Hilfe eines Dissektionszielfernrohrs durch. Führen Sie den größten Teil der Transplantation mit einer 10,5-fachen Vergrößerung durch.</li>
	<li>Bereiten Sie die Sprossen vor. Verwenden Sie eine frische Skalpellklinge, um das Hypokotyl senkrecht zu schneiden, um einen geraden, sauberen Schnitt zu erzielen. Schieben Sie die Klinge nach vorne, anstatt sie nach unten in die Pflanze zu drücken, um zu verhindern, dass der Sämling in den Agar gedrückt wird (Video 1).</li>
	<li>Entfernen Sie den Trieb. Achten Sie darauf, den geschnittenen Teil des Triebs mit Feuchtigkeit zu versorgen, indem Sie den Kontakt mit der Medienoberfläche sicherstellen. Alternativ können Sie den Spross bis zur Verwendung in einen dafür vorgesehenen Haltebereich bringen, z. B. auf die Oberseite einer mit sterilemdH 2O gefüllten Petrischale.</li>
	<li>Bereiten Sie die Wurzelstöcke vor. Ziehen Sie vorsichtig an der Wurzel, indem Sie die Wurzel in dem Raum zwischen den geschlossenen Pinzetten fangen und drehen, wobei der geschnittene Abschnitt der Wurzelstöcke in der Mitte des Streifens verbleibt (Video 2). HINWEIS: Die zerbrechliche Wurzel wird beschädigt, wenn sie direkt zwischen die geschlossene Pinzette gedrückt wird, so dass die Wurzel im scharfen Winkel der Pinzettenenden eingeklemmt werden muss, um das Gewebe zu manipulieren.</li>
	<li>Nehmen Sie den gewünschten Trieb vorsichtig mit der Pinzette mit feiner Spitze auf und führen Sie ihn in die Oberseite des Kanals ein. HINWEIS: Es ist wichtig, den Kontakt zwischen den Sprossen und den Wurzelstöcken visuell zu bestätigen, um ein erfolgreiches Transplantat zu erhalten (Video 3).</li>
	<li>Nachdem alle Transplantate hergestellt wurden, wickeln Sie die Platten mit Parafilm und atmungsaktivem Klebeband ein und stellen Sie die Platten wie zuvor auf, ohne die Sämlinge oder Silikonstreifen zu stören. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine auf 26 °C eingestellte Wachstumskammer mit 16 h hellen/8 h dunklen Zyklen.</li>
	<li>Bewerten Sie die gepfropften Sämlinge nach 7-10 Tagen unter sterilen Bedingungen. Entfernen Sie den Silikonstreifen vorsichtig mit einer Pinzette, indem Sie eine Seite abziehen, damit die Kanäle die Sämlinge befreien können. Entfernen Sie alle zufälligen Wurzeln, die aus dem Spross wachsen, indem Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge vom Spross abschneiden oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze zerdrücken. Beurteilen Sie visuell, ob der Wurzelstock fest mit dem Spross verbunden ist, um ein erfolgreiches Transplantat zu bilden (Abbildung 2).</li>
	<li>Bewegen Sie erfolgreiche Transplantate in den Vermehrungsboden der Sämlinge, um so lange wie nötig zu wachsen. Decken Sie den Boden einige Tage lang mit transparentem Kunststoff ab, während sich die Sämlinge etablieren. Nachdem Sie die Pflanzen in den Boden gebracht haben, wachsen Sie unter den zuvor erwähnten Hell- und Dunkelzyklen bei 21 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Mudge, K., Janick, J., Scofield, S., Goldschmidt, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+history+of+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Reviews%22%5BJournal%5D)">A history of grafting.</a> Horticultural Reviews. 35, 437-493 (2009).</li>
<li>Holbrook, N. M., Shashidhar, V. R., James, R. A., Munns, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+control+in+tomato+with+ABA-deficient+roots%3A+Response+of+grafted+plants+to+soil+drying%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Stomatal control in tomato with ABA-deficient roots: Response of grafted plants to soil drying.</a> Journal of Experimental Botany. 53 (373), 1503-1514 (2002).</li>
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<li>Ko, D., Helariutta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shoot-root+communication+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Shoot-root communication in flowering plants.</a> Current Biology. 27 (17), 973-978 (2017).</li>
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<li>Brumos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+auxin+biosynthesis+is+a+key+regulator+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Local auxin biosynthesis is a key regulator of plant development.</a> Developmental Cell. 47 (3), 306-318 (2018).</li>
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<li>Chen, I. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetics+approach+reveals+a+role+of+brassinolide+and+cellulose+synthase+in+hypocotyl+elongation+of+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A chemical genetics approach reveals a role of brassinolide and cellulose synthase in hypocotyl elongation of etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Plant Science. 209, 46-57 (2013).</li>
<li>An, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+apical+hook+development+by+gibberellins+and+ethylene+in+etiolated+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of apical hook development by gibberellins and ethylene in etiolated Arabidopsis seedlings.</a> Cell Research. 22 (5), 915-927 (2012).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene-induced+Arabidopsis+hypocotyl+elongation+is+dependent+on+but+not+mediated+by+gibberellins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Ethylene-induced Arabidopsis hypocotyl elongation is dependent on but not mediated by gibberellins.</a> Journal of Experimental Botany. 58 (15-16), 4269-4281 (2007).</li>
<li>Vandenbussche, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+mutant+alh1+illustrates+a+cross+talk+between+ethylene+and+auxin%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis mutant alh1 illustrates a cross talk between ethylene and auxin.</a> Plant Physiology. 131 (3), 1228-1238 (2003).</li>
<li>Deslauriers, S. D., Larsen, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FERONIA+is+a+key+modulator+of+brassinosteroid+and+ethylene+responsiveness+in+arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">FERONIA is a key modulator of brassinosteroid and ethylene responsiveness in arabidopsis hypocotyls.</a> Molecular Plant. 3 (3), 626-640 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Zusammenfassung und Bedeutung Die Bildung einer Transplantatvereinigung ist entscheidend für eine erfolgreiche Pfropfung, die einen direkten und ungestörten Kontakt zwischen Wurzelstock und Spross erfordert. Die Miniaturgröße und Zerbrechlichkeit von Sämlingen kleiner Pflanzen wie Arabidopsis macht es technisch schwierig, diese Anforderung zu erfüllen. Eine Technik, die in frühen Arabidopsis-Sämlingspfropfmethoden entwickelt wurde, bestand darin, sowohl den Spross als auch den Wurzelstock in ...

Das Pfropfen ist eine alte Gartenbautechnik, die um 500 v. Chr. zu einer etablierten landwirtschaftlichen Praxis wurde1. Das Pfropfen verschiedener Sorten von Kulturpflanzen zur Verbesserung der Erträge war die erste Anwendung dieser Technik und wird auch heute noch zu diesem Zweck eingesetzt. In den letzten zehn Jahren hat die Veredelung als Werkzeug für Molekularbiologen zur Untersuchung von Fernsignalen in Pflanzen zunehmend Aufmerksamkeit erregt 2,3,4,5. Während das Pfropfen erwachsener Pflanzen relativ einfach ist, ist das Pfropfen von Pflanzen kurz nach der Keimung eine Herausforderung. Trotzdem ist es manchmal erforderlich, die Auswirkungen von Fernsignalen auf Prozesse wie Pflanzenentwicklung, Umweltreaktionen und Blüte zu bewerten 6,7,8.
Arabidopsis thaliana hat sich aus vielen Gründen als Modellorganismus in der Pflanzenbiologie etabliert, unter anderem wegen seiner relativ geringen Größe, die es einfach macht, ihn in einem Labor zu züchten. Die geringe Größe und Zerbrechlichkeit von Arabidopsis-Sämlingen macht das Pfropfen junger Sämlinge jedoch sehr schwierig. In vielen Fällen ist ein umfangreiches praktisches Training erforderlich, um erfolgreich Sämlingstransplantate zu erhalten. Im Laufe der Jahre gab es viele methodische Verbesserungen, die ideale Wachstumsbedingungen und neue Techniken zur Erhöhung der Erfolgsrate der Sämlingsveredelung identifizierthaben 9,10,11. Das zuletzt eingeführte Werkzeug war ein Arabidopsis-Sämlings-Pfropfchip, der es auch unerfahrenen Anwendern ermöglicht, ein akzeptables Maß an Pfropferfolg zu erzielen12. Während dieser Fortschritt die technische Barriere der Keimlingsveredelung erheblich gesenkt hat, ist die Chip-Vorrichtung teuer, und die Anzahl der Transplantate, die parallel durchgeführt werden können, wird schnell unerschwinglich.
Darüber hinaus kann dieses Gerät nur für Arabidopsis-Sämlinge verwendet werden, deren Hypokotylabmessungen denen von Wildtyp-Sämlingen ähneln. Während Arabidopsis die Schlüsselart in der Welt der pflanzlichen Molekulargenetik ist, wurden neuere Arbeiten bei anderen Arten unter Verwendung der Sämlingspfropfung durchgeführt. Beispiele hierfür sind die Veredelung von Sojabohnen und der gemeinen Bohne, Tabak zu Tomaten und Raps zu Arabidopsis und die anschließende Probenahme beider Gewebe auf kleine RNAs13,14. Daher ist eine Pfropfmethode, die für die meisten Laboratorien zugänglich ist und ohne größere technische Änderungen leicht an eine Vielzahl von Pflanzenarten angepasst werden kann, sehr wünschenswert.
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der eine einfache Pfropfvorrichtung im eigenen Haus hergestellt wird, die die vollständige Anpassung des Durchmessers und der Länge des Pfropfkanals ermöglicht, um die Morphologie der Sämlinge bei den meisten Pflanzenarten zu berücksichtigen. Die Herstellung dieser Geräte ist sehr kostengünstig und hochgradig skalierbar, da die einzigen Komponenten, die benötigt werden, Silikonelastomer, Kabel oder Schläuche der richtigen Größe, eine hochpräzise Klinge und ein Behälter sind, der als Form dient. Nach dem hier beschriebenen Pfropfprotokoll können Anwender erfolgreiche Pfropfraten von 45% (n = 105) erreichen, vergleichbar mit den zuvor berichteten Pfropfergebnissen10,12.

<table><tbody><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>VWR International Inc</td><td>10026-076</td><td></td></tr><tr><td>ACETONE (HPLC & ACS-zertifiziertes Lösungsmittel) 4 L</td><td>VWR</td><td>BJAH010-4</td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Sigma</td><td>A1296-500g</td><td></td></tr><tr><td>Dow SYLGARD 184 Silikonverkapselung klar 0,5 kg Kit</td><td>Dow</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>D-Saccharose (Molekularbiologie), 1 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Mikrozentrifuge Flex-Tube Röhrchen (1,5 mL), Packung mit 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>20901-551 / 05-402</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand High Precision #4 Style Skalpellgriff</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-164</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand bleifreies Autoklavenband</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-111</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand quadratische Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>Leica Zoom 2000 Stereomikroskop</td><td>Mikroskop Zentral</td><td>L-Z2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Tape</td><td>3M</td><td>B0082A9FEM</td><td></td></tr><tr><td>Murashige und Skoog Basal</td><td>Medium</td><td>Sigma M5519-10L</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Genesee Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>VWR International Inc</td><td>AA13451-36</td><td></td></tr><tr><td>Redi-Earth Plug and Seedling Mix</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>SUN239274728CFLP</td><td></td></tr><tr><td>Scotts Osmocote Plus</td><td>Hummert International</td><td>7630600</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Design Nr. 22 Carbon Skalpellklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-697</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette DUMONT STYL55 DUMOXEL POLS 110 MM</td><td>VWR</td><td>102091-580</td><td></td></tr></tbody></table>

skalierbare, flexible und kostengünstige keimlingsveredelung

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Die Veredelung von Sämlingen im Frühstadium ist zu einem beliebten Werkzeug in der Molekulargenetik geworden, um Wurzel-Spross-Beziehungen innerhalb von Pflanzen zu untersuchen. Die Veredelung von Sämlingen der kleinen Modellpflanze Arabidopsis thaliana im Frühstadium ist aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit ihrer Sämlinge technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig. Eine wachsende Sammlung von veröffentlichten Methoden beschreibt diese Technik mit unterschiedlichen Erfolgsraten, Schwierigkeitsgraden und damit verbundenen Kosten. In diesem Artikel wird ein einfaches Verfahren beschrieben, um ein internes wiederverwendbares Pfropfgerät unter Verwendung einer Silikonelastomermischung herzustellen, und wie dieses Gerät zum Pfropfen von Sämlingen verwendet wird. Zum Zeitpunkt dieser Veröffentlichung kostet die Herstellung jedes wiederverwendbaren Pfropfgeräts nur 0,47 US-Dollar an Verbrauchsmaterialien. Mit dieser Methode können Anfänger ihre ersten erfolgreich gepfropften Sämlinge in weniger als 3 Wochen von Anfang bis Ende erhalten. Dieses leicht zugängliche Verfahren wird es Labors für Pflanzenmolekulargenetik ermöglichen, die Keimlingsveredelung als normalen Teil ihres experimentellen Prozesses zu etablieren. Aufgrund der vollen Kontrolle, die die Benutzer bei der Erstellung und Gestaltung dieser Pfropfvorrichtungen haben, kann diese Technik auf Wunsch leicht für den Einsatz in größeren Pflanzen wie Tomaten oder Tabak angepasst werden.

Verschiedene Aspekte des Designs des Pfropfstreifens wurden getestet, um die optimalen Pfropfbedingungen zu ermitteln, die das geringste Maß an technischem Geschick erforderten (Tabelle 1). Alle Pfropfversuche wurden mit 0,5% Saccharose-MS-Medium durchgeführt, von dem zuvor berichtet wurde, dass es sich um ein ideales Pfropfmediumhandelt 11,12.
Ein optimales Sämlingswachstum kann mit der Keimung auf dem Streife...

Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Veredelung von Keimlingen, die keine Vorkenntnisse oder Schulungen erfordert und mit sehr geringen Kosten unter Verwendung von Materialien durchgeführt werden kann, die in den meisten molekularbiologischen Labors leicht zugänglich sind.

Skalierbare, flexible und kostengünstige Keimlingsveredelung

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...

Die Pfropfung der Aussaat im Frühstadium ist ein leistungsfähiges Werkzeug zum Einstellen von Fernsignalen in Pflanzen. Wir hoffen, dass diese Methode dazu beitragen wird, die Pfropfung ohne praktisches Training erfolgreich einzuführen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der quadratischen Petrischale mit den Maßen 100 x 100 Millimeter zum Gießen des Silikonelastomers.Nehmen Sie 29-Gauge-Draht in Twist-Binder, nachdem Sie die äußere Papierbeschichtung auf dem Draht mit Aceton entfernt haben. Und richten Sie den Draht vollständig aus, indem Sie ihn auf einer harten, gleichmäßigen Oberfläche mit einem schweren, flachen Gegenstand wie einem Metallrohrgestell rollen. Legen Sie dann vier Stücke begradigter Drähte in gleichem Abstand voneinander in die quadratische Petrischale und stellen Sie sicher, dass die Drähte flach auf dem Boden der Schale liegen.Gießen Sie die gemischte Silikonelastomerlösung auf die Drähte in der Petrischale und legen Sie den Deckel auf die Schale. Nachdem Sie das Silikon 24 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten gelassen haben, entfernen Sie die Silikonfolie mit einer sauberen Pinzette aus der Petrischale und bewegen Sie sie auf eine saubere, ebene Oberfläche. Entfernen Sie die Drähte von der Silikonfolie.Um sicherzustellen, dass die Kanäle auf einer Seite offen sind, verwenden Sie eine Feinspitzzange, um die dünne Silikonschicht zu entfernen, die die offene Seite der Kanäle blockiert. Schneiden Sie die Silikonfolie senkrecht zu den Kanälen mit einer sauberen Schere in drei Millimeter große Streifen. Legen Sie jeden Streifen in einen Aluminiumfolienumschlag und verschließen Sie ihn mit Autoklavenband.Autoklavieren Sie die Streifen mindestens 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius, bevor Sie sie lagern, bis sie benötigt werden. Um die Samen zu sterilisieren und zu vernalisieren, nehmen Sie einen Milliliter 50%ige Bleichlösung mit 0,1% Tween 20 in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und suspendieren Sie bis zu 100 Arabidopsis-Samen darin. Inkubieren Sie die Samensuspension fünf bis 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Nach der Inkubation die Bleichlösung unter sterilen Bedingungen absaugen oder pipettieren. Spülen Sie die Samen mit einem Milliliter sterilisiertem destilliertem Wasser ab. Achten Sie darauf, die Röhrchen beim Spülen der Samen ausreichend umzudrehen.Um die oben auf dem Röhrchen verbliebene Bleichlösung zu entfernen, wiederholen Sie das Spülen viermal. Lassen Sie etwa 250 Mikroliter Wasser mit den Samen in der Tube und lagern Sie die Samen drei Tage lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Als nächstes legen Sie vor dem Anplattieren der Samen die sterilen Streifen auf die Oberfläche der vorbereiteten MS-Platte, um die Samenausrichtung mit den Kanälen auf den Streifen zu führen.Verwenden Sie dann unter sterilen Bedingungen eine 20-Mikroliter-Pipettenspitze, um die entsprechende Anzahl vorbereiteter Samen abzusaugen und auf den Teller zu übertragen. Sobald die Samen plattiert sind, entfernen Sie die sterilen Streifen. Decken Sie den Teller ab.Und versiegeln Sie eine der Seiten des Tellers parallel zu den Samenreihen mit Parafilm. Wickeln Sie atmungsaktives Klebeband auf die Oberseite des Parafilms und um alle anderen Kanten der Platte, um den Luftaustausch während der Inkubation zu ermöglichen. Richten Sie zwei Platten vorsichtig senkrecht aus, wobei die mit Parafolie versiegelten Seiten nach unten zeigen.Trennen Sie sie unten, indem Sie ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen horizontal dazwischen platzieren und oben mit einem Gummiband befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Plattenoberflächen einen Winkel von 100 bis 110 zur Tischfläche bilden. Lagern Sie die Platten in dieser Ausrichtung 72 Stunden lang in völliger Dunkelheit bei 21 Grad Celsius, damit die Hypokotyle der Sämlinge etwa fünf Millimeter lang werden können.Entfernen Sie danach das Setup aus dem Dunkeln und halten Sie es vor dem Pfropfen zwei bis vier Tage lang bei gleicher Temperatur unter einem 16-stündigen Licht- und einem achtstündigen Dunkelzyklus. Pfropfen Sie die Sämlinge zwischen fünf und sieben Tagen nach dem Anplattieren. Legen Sie einen Pfropfstreifen über die Sämlinge und passen Sie ihre Hypokotyle in die Kanäle an.Positionieren Sie den Sämling vorsichtig, so dass der Wurzel-Hypokotyl-Übergang am unteren Rand des Silikonstreifens verbleibt, um den Sämling für den Schnitt vorzubereiten. Arbeiten Sie in einer sterilen Haube mit Hilfe eines Dissektionsfernrohrs und bereiten Sie die Sprossen für die Transplantation vor. Machen Sie mit einer frischen Skalpellklinge einen geraden, sauberen, senkrechten Schnitt über das Hypokotyl.Vermeiden Sie es, den Sämling nach unten zu drücken und in den Agar zu drücken. Entfernen Sie als Nächstes die Rutsche und halten Sie den geschnittenen Teil der Rutsche mit Feuchtigkeit versorgt, indem Sie den Kontakt mit der Medienoberfläche sicherstellen. Alternativ kann die Rutsche in eine mit sterilem destilliertem Wasser gefüllte Petrischale gebracht werden.Um die Wurzelstöcke vorzubereiten, fassen Sie die Wurzel vorsichtig im Raum zwischen den geschlossenen Pinzetten und drehen Sie sie vorsichtig, um sie zu ziehen, wobei der geschnittene Abschnitt der Wurzelstöcke in der Mitte des Streifens verbleibt. Nehmen Sie dann die gewünschte Rutsche vorsichtig mit der Pinzette mit feiner Spitze auf und führen Sie sie in die Oberseite des Kanals ein. Bestätigen Sie visuell den Kontakt zwischen Spross und Wurzelstock, um ein erfolgreiches Transplantat zu erhalten.Nachdem alle Transplantate hergestellt wurden, wickeln Sie die Platten mit Parafilm und atmungsaktivem Klebeband ein und richten Sie die Platten auf die gleiche Weise wie zuvor gezeigt ein, ohne die Sämlinge oder Silikonstreifen zu stören. Bewegen Sie die Platten vorsichtig in eine Wachstumskammer bei 26 Grad Celsius mit einem 16-stündigen Licht- und einem achtstündigen Dunkelzyklus. Bewerten Sie die gepfropften Sämlinge nach sieben bis 10 Tagen unter sterilen Bedingungen, indem Sie den Silikonstreifen vorsichtig von einer Seite abziehen und die Sämlinge von den Kanälen befreien.Entfernen Sie zufällige Wurzeln, die aus dem Spross wachsen, indem Sie sie mit einer frischen Skalpellklinge schneiden oder mit einer Pinzette mit feiner Spitze zerdrücken. Beurteilen Sie noch einmal, ob der Wurzelstock fest mit dem Spross verbunden ist und ein erfolgreiches Transplantat bildet. Bewegen Sie die erfolgreichen Transplantate in die Vermehrungserde der Sämlinge und bedecken Sie die Erde einige Tage lang mit transparentem Kunststoff, während sich die Sämlinge etablieren.Lassen Sie die Pflanzen unter den zuvor erwähnten Hell-Dunkel-Zyklen bei 21 Grad Celsius wachsen. Pfropfversuche zur Bestimmung des optimalen Pfropfprotokolls ergaben eine Gesamterfolgsrate der Pfropfung von 25%, wenn die Samen direkt auf den Silikonstreifen mit geschlossenen Kanälen keimten. Durch die Neuausrichtung der Samen, um die Keimblätter der Embryonen und die Radikale während der Keimung nach unten zu halten, wurde die Pfropfeffizienz leicht auf 33% erhöht.Die Pfropferfolgsrate blieb jedoch bei 31 %, was darauf hindeutet, dass mit der Keimung auf dem Streifen kein optimales Wachstum der Sämlinge erreicht werden konnte. Interessanterweise ergab das demonstrierte Protokoll, bei dem die Sämlinge vertikal auf der Pfropfplatte kultiviert wurden, bevor sie in die offenen Kanäle in den Streifen eingeführt wurden, während der ersten beiden Versuche eine Gesamterfolgsrate der Pfropfung von 48%. Unter Berücksichtigung der geringeren Erfolgsrate des dritten und des relativ kleinen Versuchs, der auf geringfügige Variationen der Pfropfstellen zurückzuführen ist, wurde der Gesamterfolg der Pfropfung mit 45% festgestellt. Dies ist vergleichbar mit der Methode, bei der die Sämlinge auf horizontalen Platten kultiviert, auf einer festen Oberfläche geschnitten und in Pfropfstreifen eingesetzt wurden.Das demonstrierte Protokoll ist jedoch vergleichsweise weniger zeitaufwändig. Mit diesem Protokoll können Labore, die neu in der Pfropfung von Sämlingen sind, schnell eine große Anzahl von Pfropfunterstützungsgeräten erstellen und gleichzeitig das Gerät problemlos an ihre spezifischen Anforderungen anpassen können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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