Ökotoxikologische Methoden zur Bewertung von Biomarkern auf verschiedenen Skalen in neotropischen Anuren

Während die Techniken zur Bewertung biochemischer Biomarker ausgiebig genutzt werden, enthält dieses Protokoll entscheidende Details für die Standardisierung und Replikation der Methodik bei neotropischen Anuranen. Der Hauptvorteil dieser Technik sind ihre geringen Kosten, ihre Reproduzierbarkeit und ihre Anwendung. Diese Technik kann angewendet werden, um quantitative Daten zur Bewertung von Veränderungen des internen Melanins zu erhalten.

Der Comet-Assay ist eine empfindliche, vielseitige und einfache Technik, die es ermöglicht, genotoxische Wirkungen zu bestimmen, die durch eine bestimmte Verbindung induziert werden. Es kann auf jede Art von eukaryotischen Zellen angewendet werden, um DNA-Schäden, DNA-Reparatur und den antioxidativen Status von Zellen zu überwachen. Öffnen Sie zunächst die Software Image-Pro Plus 6.0 und wählen Sie Menü und Symbolleiste als biologisch.

Um den vom Melanin eingenommenen Bereich zu quantifizieren, wählen Sie Messen und dann die räumliche Kalibrierung der Vergrößerung, die für die Aufnahme der Mikrofotografien verwendet wurde. Nachdem Sie das histologische Bild geöffnet haben, wählen Sie Werkzeuganzahl und dann Objekte messen. Markieren Sie die zu messende Farbgebung im Bild mit dem Werkzeug Farben auswählen und Pipette und schließen Sie dann das Fenster.

Visualisieren Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Anzahl, Ansicht und Statistik klicken. Inkubieren Sie eine Mischung aus PBS, Wasserstoffperoxid und einer Probe in einer drei Milliliter Quarzküvette mit einer Weglänge von einem Zentimeter. Entnehmen Sie dann die in einem 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen aufbewahrte Probe und geben Sie sie in die Quarzküvette.

Lesen Sie die Katalase-Kinetik bei 240 Nanometern zwei Minuten lang in einem UV-Spektralphotometer ab und berechnen Sie die Enzymaktivität anhand der auf dem Bildschirm gezeigten Gleichung. Verdünnen Sie die entnommene Blutprobe mit einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie es neun Minuten lang bei 381 g und resuspendieren Sie das Pellet mit 50 Millilitern PBS.

Mischen Sie 30 Mikroliter der Blutprobe in 70 Mikroliter Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt oder LMPA bei einer Konzentration von 0,5 % Agarose, um die zweite Schicht zu bilden. Legen Sie 50 Mikroliter der zweiten Schicht auf einen Objektträger, der zuvor mit der ersten Schicht beschichtet war, die 100 Mikroliter Agarose mit einem Normalschmelzpunkt von 0,5 % enthält. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab und legen Sie ihn für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in die Kälte, um die zweite Schicht zu verfestigen.

Nach dem Erstarren das Deckglas entfernen. Bilden Sie die dritte Schicht, indem Sie 100 Mikroliter 0,5 % LMPA aufbringen und den Objektträger wieder abdecken. Nachdem die dritte Schicht erstarrt ist, entfernen Sie das Deckglas und tauchen Sie jeden Objektträger in ein 100-Milliliter-Coplin-Glas, das die am selben Tag zubereitete Lyselösung enthält.

Stellen Sie die Coplin-Gläser eine Stunde lang im Dunkeln in ein kaltes Bad bei vier Grad Celsius, damit die Lyse stattfinden kann. Am Ende der Lyse entfernen Sie die Objektträger und tauchen sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius in die Elektrophorese-Pufferlösung im Elektrophoresetank, damit sich die DNA abwickeln kann. Nach dem Abwickeln der Kern-DNA führen Sie die Elektrophorese an demselben Puffer bei vier Grad Celsius für 10 Minuten bei 25 Volt und 250 Milliampere durch.

Am Ende der Elektrophorese neutralisieren Sie die Proben in den Objektträgern, indem Sie fünf Minuten lang dreimal zwei Milliliter Tris-Salzlösung hinzufügen. Geben Sie die Proben in 100-Milliliter-Coplin-Gläser mit 95 % Alkohol bei vier Grad Celsius, um die Proben zu dehydrieren. Färben Sie die Proben, indem Sie 10 Mikroliter DAPI in die Mitte des Objektträgers geben.

Verteilen Sie dann die Farbe mit einem Deckglas auf den Proben. Untersuchen Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenz-Fotomikroskop mit einem NU-Filter. Quantifizieren Sie den DNA-Schaden, indem Sie die Länge der DNA-Migration aus dem Nukleoid bewerten.

Bestimmen Sie es in diesem Fall visuell anhand von 100 zufällig ausgewählten Zellen ohne Überlappung. Klassifizieren Sie dann den DNA-Schaden in vier Klassen, wobei null bis eins für keinen Schaden, zwei für minimalen Schaden, drei für mittleren Schaden und vier für maximalen Schaden steht. Geben Sie die Daten als mittlere Anzahl geschädigter Zellen und den mittleren Kometen-Score für jede Behandlungsgruppe an.

Berechnen Sie schließlich aus diesen Daten den genetischen Schadensindex oder GDI für jeden Testorganismus anhand der auf dem Bildschirm gezeigten Gleichung. In dieser Abbildung ist der skalierte Massenindex von Boana pulchella und Leptodactylus luctator adult. Für die Analyse des skalierten Massenindex wurde eine nichtlineare Regressionsanalyse durchgeführt, die die Leistungsfunktionsbeziehung zwischen dem SVL und der Körpermasse für die Spezies aufzeigt, um den Skalierungsexponenten zu bestimmen.

Der skalierte Massenindex ist nützlich für den Vergleich von Gruppen von adulten oder jungen Tieren derselben Art. Die histologischen Schnitte der Leber von Boana raniceps sind hier dargestellt. Eine größere Menge an c und größere Dimensionen der Hepatozyten und des Nucleus der Hepatozyten können aus diesen Schnitten beobachtet werden.

In dieser Abbildung sind unterschiedliche und komplementäre Reaktionen zytogenetischer Biomarker in einem Herbizidszenario bei Boana pulchella dargestellt. Hier zeigen die schwarzen Balken 48 Stunden und die grauen Balken 96 Stunden an. Der Zeitpunkt der Exposition und die Konzentration sollten hier immer als Faktor berücksichtigt werden, da eine bestimmte Zeit oder Konzentration möglicherweise nicht ausreicht, um Schäden hervorzurufen.

Das repräsentative Bild beschreibt, wie die Biomarker mit dem Biomarker-Response-Index zusammenhängen. Hier zeigt das Blau die Kontrollgruppe an, während die orangefarbenen, gelben und grünen Farben die Expositionsszenarien gegenüber BDE 209 anzeigen. Diese Daten deuten darauf hin, dass Katalase ein wirksamer Biomarker für Stresssituationen ist, in denen der Stressor in den höchsten Konzentrationen vorhanden ist.

Nehmen Sie bei der Berechnung des Body Condition Index konsequent Fotos aus der gleichen Entfernung auf. Messen Sie bei Kaulquappen die SVL-Körperlänge bis zur Kloakenröhre, ohne die Kragenflosse. Dieser Ansatz befasst sich sicher mit der Physiologie der Amphibien und den Auswirkungen der Umweltveränderungen.

Es gibt zwar alternative potenziell invasive Biomarker, aber diese Methoden bieten Einblicke in oxidativen Stress, Toxikodynamik und Toxikogenetik. Zusätzliche Enzymmessungen im Zusammenhang mit oxidativem Stress können als alternative Methoden dienen. Die Technik der Farbdifferenzanalyse bewertet Gewebereaktionen in Mikrofotografien auf der Grundlage von Farbunterschieden.

Stellen Sie für das Pigmentsystem sicher, dass die Kalibrierung des Programms mit der Mikroaufnahme übereinstimmt. Diese fortschrittliche Technik ist maßgeblich daran beteiligt, zu untersuchen, ob Xenobiotika die DNA in verschiedenen Zelltypen direkt beeinflussen, und beantwortet Fragen zu oxidativem Material und Reparaturprozessen, die andere zytogenetische Techniken nicht beantworten können.