Name: Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Lernen Sie die simultane Messung von Kalziumeinstrom und Oberflächenphänotyp in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Analyse ohne vorherige Zellisolierung.

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R01AI132419, CU | AMC ImmunoMicro Flow Cytometry Shared Resource, RRID:SCR_021321, Vielen Dank an unsere Kollegen bei Cytek für die kontinuierlichen Diskussionen über die vollständige spektralzytometrische Analyse mit der Aurora- und SpectroFlo-Software. Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.

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<li>Gallagher, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchy+of+signaling+thresholds+downstream+of+the+T-cell+receptor+and+the+Tec+kinase+ITK%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118(2021).</li>
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<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGTA+can+inhibit+vesicular+release+in+the+nanodomain+of+single+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neurosciene%22%5BJournal%5D)">EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels.</a> Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26(2019).</li>
<li>Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: 
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<li>SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cytekbio.com/pages/spectro-flo">https://cytekbio.com/pages/spectro-flo</a> (2022).</li>
<li>FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: 
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<li>Godfrey, D. I., Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+points+in+early+T-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Control points in early T-cell development.</a> Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).</li>
<li>Vossen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+receptor+binding+of+anti-CD3+monoclonal+antibodies+is+not+essential+for+immunosuppression%2C+but+triggers+cytokine-related+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects.</a> European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Assay zur Messung von Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen, die mit titriertem Indo-1-ratiometrischem Indikatorfarbstoff unter Verwendung der Vollspektrum-Durchflusszytometrie beladen sind 7,8. Der Vorteil der Durchführung von Calciumfluss-Assays mit Vollspektrum-Durchflusszytometrie ist die Möglichkeit, die Färbung von Oberflächenzellmarkern in Kombination mit der Beurteilung der Indo-1-Fluoreszenz zu multip...

Der durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) induzierte Kalziumeinstrom ist ein nützliches Maß für die T-Zell-Aktivierung und wird häufig verwendet, um festzustellen, ob eine Population von T-Zellen eine beeinträchtigte Reaktion in den proximalen Schritten des TCR-Signalwegsaufweist 1. Messungen des Kalziumeinstroms werden in der Regel durchgeführt, indem die T-Zellen mit einem oder zwei fluoreszierenden Kalziumindikatorfarbstoffen vormarkiert und dann die Fluoreszenzsignale mittels Durchflusszytometrie in Echtzeit nach TCR-Vernetzung untersuchtwerden 2,3,4. Indo-1, ein ratiometrischer Calciumfarbstoff, wird durch den UV-Laser mit Spitzenemissionen bei zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt, die von der Calciumbindung5 abhängen, und ist ein häufig verwendeter Indikatorfarbstoff für die durchflusszytometrische Analyse von Calciumantworten in lebenden Lymphozyten. Da das Emissionsprofil von Indo-1 recht breit gefächert ist, kann es schwierig sein, die Indo-1-Bewertung mit der gleichzeitigen Analyse mehrerer Zelloberflächenmarker mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu kombinieren. Diese Einschränkung schränkt die Verwendung der durchflusszytometrischen Analyse von Kalziumantworten auf vorgereinigte Populationen von T-Zellen oder auf Populationen ein, die durch einen begrenzten Satz von Zelloberflächenmolekülen identifiziert wurden.
Um die Einschränkungen der Messung von Kalziumantworten auf heterogene Populationen primärer Lymphozyten mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu beheben, wurde ein Protokoll zur Messung der Indo-1-Fluoreszenz mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht das Multiplexing von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, und nutzt so die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Der Vorteil der Vollspektrum-Durchflusszytometrie gegenüber der konventionellen Durchflusszytometrie besteht darin, dass sie die Fluoreszenzsignale von stark überlappenden Farbstoffen unterscheiden kann, wodurch die Anzahl der Oberflächenmarker erhöht wird, die gleichzeitig in jeder Probe bewertet werden können. Die konventionelle Durchflusszytometrie verwendet Bandpassfilter und ist auf ein Fluorochrom pro Detektorsystembeschränkt 6. Bei der Vollspektrum-Durchflusszytometrie werden Signale über das gesamte Spektrum des Fluorochroms mit 64 Detektoren auf einem spektralen Durchflusszytometriesystem mit fünf Lasernerfasst 7,8. Darüber hinaus nutzt die Vollspektrum-Durchflusszytometrie die Vorteile von APD-Detektoren (Avalanche Photo Diode), die eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu Photomultiplier-Röhrendetektoren aufweisen, die auf herkömmlichen Durchflusszytometern vorhanden sind8. Folglich ist dieser Ansatz ideal für die heterogenen Zellpopulationen, wie z.B. mononukleäre Zellen des peripheren Blutes oder sekundäre lymphatische Organzellsuspensionen der Maus, da er die Isolierung spezifischer T-Zellpopulationen vor der Markierung des Kalziumfarbstoffs überflüssig macht. Stattdessen können Expressionsprofile von Zelloberflächenmarkern und durchflusszytometrisches Gating nach der Datenerfassung verwendet werden, um die Kalziumreaktionen in jeder interessierenden Population zu bewerten. Wie in diesem Bericht gezeigt wird, kann Indo-1 problemlos mit acht fluorochrom-konjugierten Antikörpern kombiniert werden, was zu insgesamt 10 einzigartigen spektralen Signaturen führt. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf Mischungen von Zellen aus kongen unterschiedlichen Mauslinien angewendet werden, was die gleichzeitige Analyse der Kalziumantworten in Wildtyp-T-Zellen im Vergleich zu denen einer genspezifischen Mauslinie ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>12 Well TC-behandelte Platten</td><td>Cell Treat</td><td>229111</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisch</td><td>Greiner Bio1</td><td>41-12-17-03</td><td>50 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen mit Kappe</td></tr><tr><td>5 mL Polysteren-Durchflussröhrchen</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>BD Spritze</td><td>309646</td> nur <td>Kolben wird verwendet</td></tr><tr><td>70 μM Filter</td><td>Greiner bio1</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>aCD3 (17A2)</td><td>Biolegend</td><td>100202</td><td></td></tr><tr><td>AKC Lysis Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Aurora Spectral Flowcytometer</td><td>https://cytekbio.com/pages/aurora</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath Beads</td><td>Coleparmer</td><td>Artikel # UX-06274-52</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>Tonbo</td><td>50-0193-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD1d Tetramer APC</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD25 PECy7</td><td>ebioscience</td><td>15-0251</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC Cy7</td><td>Tonbo</td><td>25-0042-U100</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-0081-85</td><td></td></tr><tr><td>Zellinkubator</td><td>Formale wissenschaftliche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionswerkzeuge Pinzette</td><td>McKesson</td><td>#487593</td><td>Gewebezange McKesson Adson 4-3/4 Zoll Länge Edelstahl in Büroqualität Nicht steriler nicht verriegelnder Daumengriff 1 x 2 Zähne</td></tr><tr><td>Dissektionswerkzeuge Schere</td><td>McKesson</td> <td># 970135</td><td>Operationsschere McKesson Argent&trade; 4-1/2 Zoll Chirurgischer Edelstahl Fingerring Griff Gerade Scharfe Spitze / Scharfe Spitze</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>DPBS&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher</td><td>NC1280093</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclond</td><td>SH30071.03</td><td>Lot AE29165301</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Indo1-AM Ester Dye</td><td>ebioscience</td><td>65-085-39</td><td>Calcium Loading Dye&nbsp;</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Millipore</td><td>407951-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Lebender/toter Geist 540</td><td>Tonbo</td><td>13-0879-T100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,7 mL</td><td>Light Labs</td><td>A-7001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PRN694</td><td>Med Chem Express</td><td>Hy-12688</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Anti-Maus-CD16/CD32 (FC-Schild) ( 2.4G2)</td><td>Tonbo</td><td>70-0161-M001</td><td>FC Block</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>1875093</td><td>&nbsp;+ phenolrot</td></tr><tr><td>RPMI phenolfrei</td><td>Gibco</td><td>11835030</td><td>&nbsp;-phenolrot</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra612</td><td></td></tr><tr><td>TCR&beta; PerCP Cy5.5</td><td>ebioscience</td><td>45-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>TCR&gamma;/&delta; Pe Cy5</td><td>ebioscience</td><td>15-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu Reagenzpaket</td><td></td><td>Produkt-Nr: C06019</td><td>Enthält Tripan</td></tr><tr><td>Vi-Cell Blu</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Brand Trockenbad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des t-zellrezeptor-induzierten kalziumeinstroms in primäre murine t-zellen mittels vollspektrum-durchflusszytometrie

Analysis of T-cell Receptor-Induced Calcium Influx in Primary Murine T-cells by Full Spectrum Flow Cytometry

Der Kalziumeinstrom als Reaktion auf die Stimulation durch T-Zell-Rezeptoren ist ein gängiges Maß für die T-Zell-Signalübertragung. Es wurden mehrere Calcium-Indikatorfarbstoffe entwickelt, um die Calcium-Signalübertragung mittels Bandpass-Durchflusszytometrie zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie zu messen. Die gesamten Splenozyten werden mit dem ratiometrischen Calciumindikatorfarbstoff Indo-1 markiert, zusammen mit einer Reihe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern gegen Zelloberflächenmoleküle. Die Nutzung der Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie bietet eine Plattform für die Verwendung einer breiten Palette von Zelloberflächenfärbungen in Kombination mit Indo-1. Die Zellen werden dann in Echtzeit bei 37 °C vor und nach der Zugabe eines Anti-CD3-Antikörpers zur Stimulation des T-Zell-Rezeptors analysiert. Nach der Entmischung der spektralen Signale wird das Verhältnis von calciumgebundenem zu calciumfreiem Indo-1 berechnet und kann über die Zeit für jede Gated Population von Splenozyten visualisiert werden. Diese Technik kann die gleichzeitige Analyse von Kalziumantworten in mehreren Zellpopulationen ermöglichen.

Der experimentelle Arbeitsablauf zur Beurteilung der Kalziumantworten in primären murinen T-Zellen unter Verwendung eines ratiometrischen Indo-1-Farbstoffs mit Multiplex-Oberflächenfärbungen ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Ernte und Aufbereitung der Maus-Splenozyten zu einer Einzelzellsuspension werden die Zellen mit einem Indo-1 AM-Ester gefärbt und mit Fluorochrom-verknüpften Antikörpern oberflächengefärbt. Nach Abschluss der Farbstoffbeladung und der Antikörperfärbung werden die ...

Der Kalziumeinstrom, ein Maß für die T-Zell-Signalübertragung, ist ein effektiver Weg, um Reaktionen auf die Stimulation von T-Zell-Rezeptoren zu analysieren. Dieses Protokoll zum Multiplexen von Indo-1 mit Antikörpern, die auf Zelloberflächenmoleküle gerichtet sind, nutzt die hochflexiblen Möglichkeiten der Vollspektrum-Durchflusszytometrie.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

Calcium influx in response to T-cell receptor stimulation is a common measure of T-cell signaling. Several calcium indicator dyes have been developed to ...

Das Protokoll ermöglicht es den Forschern, gleichzeitig die Kalziumantwort in primären T-Zellen zu messen und gleichzeitig ihre Untergruppe und ihren Oberflächenphänotyp zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Notwendigkeit vermeidet, bestimmte Untergruppen von Zellen zu isolieren, bevor ihre Kalziumreaktionen untersucht werden. Bereiten Sie zunächst eine Stammlösung von Indo-1 AM von einem Mikrogramm pro Mikroliter vor, indem Sie 50 Mikroliter DMSO in eine Durchstechflasche mit 50 Mikrogramm Indo-1 AM geben. Verdünnen Sie die Stammlösung auf ein geeignetes Volumen cRPMI und eine Konzentration von sechs Mikrogramm pro Milliliter.Stellen Sie das Medium in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie dann dieses Medium, um eine zuvor hergestellte Zellsuspension im Verhältnis eins zu eins zu verdünnen, um fünf bis 6 Millionen Zellen pro Milliliter zu erhalten. Als nächstes fügen Sie zu einer 12-Well-Gewebekulturplatte einen Milliliter Zellsuspension pro Well und Versuchsbedingung hinzu.Bereiten Sie eine einzelne gefärbte Kontrollprobe für kalziumfreies Indo-1 vor, indem Sie EGTA zu den mit Farbstoffen beladenen Indo-1-Zellen hinzufügen. Bereiten Sie eine Vertiefung für die biologische Negativkontrolle ohne Fluorophore oder Indo-1-Farbstoff vor. Bereiten Sie eine Indo-1-Positivkontrolle vor, indem Sie Ionomycin in einer Konzentration von 50 Mikromol zur farbstoffbeladenen Zellsuspension am Durchflusszytometer hinzufügen.Bereiten Sie auch eine Vertiefung für die Kontrolle einzelner Färbungen für zusätzliche Zellpopulationen mit Antikörper-konjugierten Fluorophoren vor. Fügen Sie dann zwei Mikrogramm FC-Rezeptor-blockierenden Antikörper pro Million Zellen hinzu und inkubieren Sie die Platte 45 Minuten lang, wobei alle 15 Minuten abgeklopft wird, um die Zellen zu resuspendieren. Mischen Sie nach der Inkubation das gesamte Zellvolumen von der Platte und geben Sie es in 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Zentrifugieren und Dekantieren des Überstands. Sobald die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem cRPMI gewaschen sind, pelletieren Sie erneut und dekantieren Sie den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter cRPMI und inkubieren Sie jedes Röhrchen, wobei die Oberseite des Röhrchens für den Gasaustausch leicht geöffnet bleibt, um eine vollständige Entesterung der intrazellulären AM-Ester zu ermöglichen.Als nächstes bereiten Sie eine Mastermischung aus allen benutzerdefinierten Fluorochrom-konjugierten Antikörpern vor und geben sie für einen Milliliter des Zellvolumens zu den ruhenden Zellen. Nach der Ruhezeit pelletieren Sie die Zellen und waschen Sie das Pellet, indem Sie es in einem Milliliter cRPMI, das auf vier Grad Celsius gekühlt ist, resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Röhrchen auf Eis.Resuspendieren Sie einzelne Proben in 500 Mikrolitern phenolrotfreiem cRPMI unter Verwendung eines Fünf-Milliliter-Polystyrol-Durchflussrohrs mit einer Kappe. Um die Temperatur mit Hilfe der Kalziumflussanalyse zu halten, bereiten Sie ein Perlenbad vor, indem Sie Badeperlen in ein kleines Wasserbad geben und auf 37 Grad Celsius erwärmen. Schneiden Sie vorsichtig ein 50-Milliliter-Chronikröhrchen in zwei Hälften und entsorgen Sie die Oberseite des Röhrchens.Füllen Sie das restliche Röhrchen zu drei Vierteln mit Badeperlen und lassen Sie es im Perlenbad 37 Grad Celsius erreichen. Stellen Sie das Perlenbad zusammen mit einem Styroporgestell in die Nähe eines Durchflusszytometers, um das Röhrchen zu positionieren. Vor der Analyse am Durchflusszytometer erwärmen Sie die Röhrchen einzeln sieben Minuten lang auf 37 Grad Celsius.Melden Sie sich bei der Durchflusszytometer-Software an und klicken Sie auf die Registerkarte Bibliothek. Wählen Sie dann fluoreszierende Tags aus, um kalziumgebundenes Indo-1 und kalziumfreies Indo-1 hinzuzufügen. Wählen Sie dann UV-Laser unter Fluoreszenz-Tag-Gruppen aus und klicken Sie auf Hinzufügen, um einen fluoreszierenden Tag-Namen hinzuzufügen.Wählen Sie die Laseranregung und die Emissionswellenlänge aus und klicken Sie dann auf Speichern. Fahren Sie mit dem Versuchsaufbau fort. Klicken Sie auf die Registerkarte Akquise, Öffnen/Erstellen eines neuen Experiments und fügen Sie dem Experiment die gewünschten fluoreszierenden Tags hinzu.Erstellen Sie eine Referenzgruppe und eine neue Stichprobengruppe für das Experiment, und beschriften Sie beide Gruppen. Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassungen" die Ereignisse auf das Maximum von 10 Millionen, das Stoppvolumen auf das maximale Volumen von 3000 Mikrolitern und die Stoppzeit auf das Maximum von 36.000 Sekunden ein. Erfassen Sie einfach gefärbte Kontrollen für benutzerdefinierte konjugierte Antikörper, die im Multicolor-Panel enthalten sind, und für den funktionellen Indo-1-Farbstoff.Fügen Sie 50 Mikromol Ionomycin zur kalziumgebundenen Indo-1-Positivkontrolle hinzu und wirbeln Sie vor. Fügen Sie das Durchflussrohr zur Probeninjektionsplatine hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen. Fügen Sie dann die kalziumfreie Indo-1-Negativkontrolle zum Durchflusszytometer hinzu und klicken Sie auf Aufzeichnen.Entmischt die einzelnen Stained-Regler, indem Sie auf die Schaltfläche Unmix klicken. Sobald die Entmischung abgeschlossen ist, erstellen Sie sequenzielle Diagramme mit dem ungemischten Arbeitsblatt, z. B. SSC-A im Vergleich zu FSC-A, um Schmutz aus der Probe zu entfernen, und SSC-A im Vergleich zu SSC-H, um Dubletten zu entfernen. Erstellen Sie dann Tore, indem Sie auf Plotten klicken.Fügen Sie dem Arbeitsblatt ein Diagramm hinzu, und doppelklicken Sie in das Tor, um eine nachgelagerte geschlossene Population zu erstellen. Fahren Sie fort, bis alle interessierenden Populationen berücksichtigt sind. Als nächstes erwärmen Sie die zuvor vorbereiteten einzelgefärbten Kontrollproben auf 37 Grad Celsius für die sequenzielle Analyse.Richten Sie die Durchflusszytometrie-Software ein und lassen Sie DI zwei bis drei Minuten lang in Eiswasser laufen, um die fluidische Stabilität des Durchflusszytometers zu gewährleisten. Richten Sie sequenzielle Diagramme auf dem ungemischten Arbeitsblatt ein, indem Sie mit den Schaltflächen Polygonrechteck oder Ellipsentor Tore erstellen, um die gewünschte Grundgesamtheit einzubeziehen. Doppelklicken Sie in das Tor und ändern Sie die Parameter für die y- und x-Achse in SSC-A statt SSC-H.Schließen Sie die Definition der Achsenparameter ab, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Achse klicken. Erstellen Sie ein Diagramm mit SSC-A im Vergleich zum Viabilitätsfarbstoffsignal. Gate die lebenden Zellen, die negativ für die Aminfarbstofffärbung sind.Lebende Zellen, die für die Lebendtotfärbung negativ sind, gruppieren sich sowohl auf der y- als auch auf der x-Achse an der Nullmarkierung. Doppelklicken Sie auf das innere Diagramm, um ein neues Diagramm zu erstellen, das nur einzellige lebende Lymphozyten enthält. Ändern Sie die Y-Achse in Indo-1 über der Zeit auf der x-Achse, um den Kalziumeinstrom zu visualisieren.Als nächstes legen Sie die erwärmte biologische Probe in den SIT der Maschine. Führen Sie die Proben mit 2.500 bis 3000 Ereignissen pro Sekunde bei einer mittleren Flussrate durch, um den Kalziumeinstrom in einer begrenzten Anzahl von Zellpopulationen zu visualisieren. Geben Sie das nächste Röhrchen in das Perlenbad zur Erfassungskontrolle.Drücken Sie die Aufnahmetaste, um die Ausgangsdaten 30 Sekunden lang aufzuzeichnen und einen basalen Calcium-Signalspiegel in der Probe zu erhalten. Klicken Sie dann auf Stopp und entfernen Sie das Röhrchen aus dem Probeninjektionsanschluss. Geben Sie 30 Mikrogramm unkonjugiertes Anti-CD3 direkt in das Probenröhrchen, um den Kalziumeinstrom einzuleiten.Setzen Sie das Röhrchen schnell wieder auf den Probeninjektionsanschluss und drücken Sie in der Software auf Aufnahme. Zeichnen Sie sieben Minuten lang Daten auf und beobachten Sie, wie viel Zeit unter den Erfassungssteuerungen in der Software verstrichen ist. Drücken Sie dann in der Software auf Stopp.Fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter Ionomycin hinzu und zeichnen Sie es 30 Sekunden lang auf, um das maximale Kalziumsignal in den interessierenden Zellen zu erhalten. Fahren Sie mit der nächsten Probe fort und wiederholen Sie den Arbeitsablauf, bis alle Proben gesammelt wurden. Speichern Sie das Experiment und klicken Sie auf die Export-Zip-Datei.Ungemischte Dateien werden in eine externe Durchflusszytometrie-Analysesoftware hochgeladen. Ein stabiles, konsistentes Signal in einem Diagramm von Zeit und Seitenstreuung deutete auf fluidische Stabilität hin. Die Lymphozytenpopulation wurde durch eine anschließende Unterscheidung von Einzelstücken in einem Diagramm der Seitenstreuhöhe über der Fläche kontrolliert.Die Singuletts wurden auf ihre Lebensfähigkeit hin untersucht. Anschließend wurde das Gating auf die CD19-negative Population angewendet. Diese T-Zell-Subpopulationen wurden mit Antikörpern gegen CD4 und CD8 untersucht, indem die kalziumgebundene Indo-1-Fluoreszenz über die Zeit visualisiert wurde.In einzelnen Zellpopulationen zeigte das Diagramm des kalziumgebundenen Indo-1 über der Zeit einen Ausgangswert vor der Stimulation. Eine Spitzenreaktion, wenn der intrazelluläre Kalziumspiegel abnahm und die Kalziumantwort durch Zugabe von Ionomycin ausgelöst wurde. Vor der Zugabe von Anti-CD3-Antikörpern wurde ein schwaches Calcium-gebundenes Indo-1-Signal detektiert.Während der Peakantwort zeigten die Zellen ein starkes kalziumgebundenes Indo-1-Signal und reduzierten kalziumfreies Indo-1. Fünf Minuten nach dem Höhepunkt kehrte die Indo-1-Fluoreszenz fast zum Ausgangswert zurück. Nach Zugabe von Ionomycin konnte ein robustes Signal von Calcium-gebundenem Indo-1 sichtbar gemacht werden, das auf eine adäquate Farbbeladung der Zellen hinweist.Die Analyse der seltenen Populationen wurde durchgeführt, indem kalziumgebundenes Indo-1 im Vergleich zu kalziumfreiem Indo-1 nach Gating auf jede interessierende Population aufgetragen wurde. Und die Analyse der Kalziumantwort über den gesamten Zeitverlauf für jede Teilmenge. Der Kalziumfluss unter Verwendung von Vollspektrumprofilen kann zu einer durchflusszytometrischen Analyse mit hohen Parametern in einer Vielzahl von Immunsubpopulationen führen.Die hochdimensionale Analyse für ein unverzerrtes Clustering von T-Zell-Subpopulationen kann in Kombination mit Hochparameter-Durchflusszytometrie für erweiterte Analysen verwendet werden. Diese Technik wurde für die Analyse mehrerer Immunsubpopulationen in Verbindung miteinander in einer Massenprobe entwickelt.

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Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

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Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu...

Prüfung Thymic positive und negative Selektion mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video zeigt die Beurteilung der B-Zell-Aktivierung durch die Verwendung von antigenen Liposomen. B-Zellen, die mit dem calciumsensitiven Indo-1-Farbstoff behandelt wurden, werden mittels Durchflusszytometrie unterschieden und ihr Fluoreszenzverhältnis von Violett zu Blau analysiert. Wenn die Zellen auf antigene Liposomen treffen, löst es die B-Zell-Aktivierung durch Kalziumeinstrom aus, wodurch das Fluoreszenzsignalverhältnis von Violett zu Blau im Laufe der Zeit schrittweise verbessert...

Überwachung der B-Zell-Aktivierung mit antigenen Liposomen mit einem Calcium-Flux-Assay

Dieses Video analysiert den T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstrom in T-Zellen. Anti-CD3-Antikörper aktivieren die T-Zell-Signalwege, was zu einer Zunahme intrazellulärer Kalziumionen führt, die an den Indo-1-Farbstoff binden. In der Durchflusszytometrie korreliert eine Spektralverschiebung vom kalziumfreien Zustand in den kalziumgebundenen Zustand mit dem T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstrom.

Bewertung des T-Zell-Rezeptor-induzierten Kalziumeinstroms mit einem Kalziumindikatorfarbstoff

Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen unter Verwendung von Mess Cytometry Abbildungsströmung.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow für die qualitative und quantitative Analyse von immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Die Methode basiert auf bildgebende Durchflusszytometrie, ermöglicht die Erfassung und Auswertung von mehreren tausend Zelle Bildern innerhalb relativ kurzer Zeit.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

Bereitstellung von einzelligen Empfindlichkeit, eignet sich in Echtzeit Durchflusszytometrie einzigartig, multimodale Rezeptor Funktionen von lebenden Kulturen zu quantifizieren. Mit Erwachsenen neurale Vorläuferzellen, wurde die P2X7-Rezeptor-Funktion über Kalzium Zustrom von Kalzium Indikatorfarbstoff transmembranen Porenbildung durch Interkalation Bromid Aufnahme und Verwendung von fluoreszierenden Latex-Kügelchen Phagozytose erkannt bewertet.

Echtzeit Live-Zelle Durchflusszytometrie, Calcium Zustrom, Porenbildung und Phagozytose durch P2X7-Rezeptoren im Erwachsenen neurale Vorläuferzellen zu untersuchen

Hier stellen wir das Protokoll für die schrittweise Rekonstitution synthetischer Antigen-präsentierender Zellen unter Verwendung von Bead-Supported Lipid Bilayers und deren Verwendung zur Abfrage der synaptischen Ausgabe von aktivierten T-Zellen vor.

Herstellung von perlengestützten Lipiddoppelschichten zur Untersuchung der partikulären Ausscheidung von T-Zell-Immunsynapsen

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll zur Verfügung, um anfängliche lokale Ca2+ -Signale, sogenannte Ca2+ -Mikrodomänen, in primären murinen und humanen T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie aufzuklären. Dieses Protokoll dient als wertvolle Ressource für Forscher, die die Ca2+ -Signalwege in Immunzellen untersuchen und ihre Funktion weiter entschlüsseln können.

Bildgebung von anfänglichen Ca2+ -Mikrodomänen in primären T-Zellen

Lernen Sie die simultane Messung von Kalziumeinstrom und Oberflächenphänotyp in primären murinen T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Analyse ohne vorherige Zellisolierung.

Analyse des T-Zellrezeptor-induzierten Kalziumeinstroms in primäre murine T-Zellen mittels Vollspektrum-Durchflusszytometrie

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