Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems
21. Oktober 2022
Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte dynamische Echtzeit-Probenahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus wacher Ratten unter Verwendung eines Mikrodialysesystems.
Die extrazelluläre Flüssigkeit des Hippocampus und die Mikrodialysetechnik des Gehirns tragen zur Überwachung der krankheitsspezifischen Mikro- oder Zentralnervenerkrankungen bei. Die Mikrodialyse des Gehirns ermöglicht eine dynamische und kontinuierliche Inquisition von interstitieller Hirnflüssigkeit in bestimmten Hirnregionen von nicht anästhesierten Ratten. Beginnen Sie damit, die anästhesierte Ratte auf einem stereotaktischen Hirngerät zu fixieren und wischen Sie den rasierten Operationsbereich vor der Operation dreimal mit einem Povidon-Jod- und Ethanoltupfer ab.
Machen Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 Zentimeter langen kranialen Gesichtsschnitt in der Mitte und entfernen Sie die Knochenhaut mit einer chirurgischen Schere und einer Augenzange. Betrachtet man das Bregma als basale Position, so durchbohrt man mit einem Schädelbohrer das Endokranium, um eine zwei Millimeter große Öffnung in der Hippocampus-CA1-Region zu bohren. Fixieren Sie nun die Katheterstilette am Greifer eines stereotaktischen Hirnortungsgeräts und passen Sie die Position der Mikrodialysehülle an der anteroposterioriren, mediolateralen und dorsalen ventralen Position an.
Stellen Sie das dorsoventrale Ventil des Stereo-Locators des Gehirns ein und implantieren Sie das Mikrodialysegehäuse in einer Tiefe von 3,5 Millimetern in die CA1-Region. Bohren Sie drei weitere Öffnungen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern so, dass die drei Öffnungen ein Dreieck bilden, in dem sich die Sondenöffnung mittig befindet. Implantieren Sie in einem Millimeter Tiefe Schrauben in die Öffnungen und fixieren Sie den Sondenkatheter mit Zahnzement.
Verwenden Sie dann eine chirurgische 4-O-Naht, um die Haut zu schließen. Verbinden Sie die Mikrospritze der Mikrodialysepumpe mit dem ACSF-Wachaktivitätsgerät und dem kryogenen Probensammler gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Luft in der Rohrleitung abzulassen, stellen Sie die Mikrodialysepumpe auf eine Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute ein.
Schließen Sie dann die Rohrleitung und die Gehirn-Mikrodialysesonde an und betreiben Sie die Mikrodialysepumpe mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute, um ACSF in die Sonde zu injizieren, bis die Oberfläche der Sonde leicht feucht ist. Tauchen Sie die Sonde zur späteren Verwendung in eine Heparin-Natrium-Injektionslösung. Um die HECF von der wachen Ratte zu entnehmen, führen Sie die Gehirn-Mikrodialysesonde in den Sondenkatheter ein und legen Sie die Ratte in eine Kammer mit Polsterung, um sicherzustellen, dass sich die Ratten frei bewegen können.
Schalten Sie den Mehrkanal-Schwenkregler ein, um ein Verflechten der Mikrodialyseleitungen während der freien Bewegung der Ratte zu vermeiden. Schalten Sie dann die Mikrospritzenpumpe ein und pumpen Sie die ACSF mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute. Nach einer 60-minütigen Äquilibrierung des Mikrodialyse-HECF-Entnahmesystems ist das HECF in regelmäßigen Abständen zu entnehmen.
Nehmen Sie nach dem Abschluß der Probenahme die Hirndialysesonde aus dem Sondenkatheter. Tauchen Sie die Sonde in deionisiertes Wasser und spülen Sie sie 12 Stunden lang mit deionisiertem Wasser, um gestrandete Salzablagerungen aus der Rohrleitung und der Sonde zu entfernen. Entfernen Sie die Sonde und legen Sie sie in eine 0,05%ige Tripsin-Lösung bei vier Grad Celsius.
Die extrazelluläre Flüssigkeit des Hippocampus, die durch die Mikrodialysetechnik des Gehirns gewonnen wird, ist wasserähnlich, farblos und bei der eingestellten Probenahmerate transparent. Die wichtigsten Verfahren sind die vorsichtige Implantation der Mikrodialyse in den CA1-Bereich und das Einführen der Sonde in den Pop-Katheter. Die einfache Mikrodialysetechnik ermöglicht es, die dynamische Veränderung von Krankheitsmarkern in bestimmten Gehirnregionen, die Substanz der Wirksamkeit des Medikaments und den Gewebekatabolismus von Medikamentenbestandteilen zu unterstützen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Echtzeit-Dynamik-Probenahme von hippocampalem extrazellulärem Fluid (HECF) bei wachen Ratten mithilfe einer zerebralen Mikrodialyse-Technik vor. Das Verfahren ermöglicht es Forschern, krankheitsspezifische Marker bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems zu überwachen, indem kontinuierliche Proben aus spezifischen Hirnregionen gewonnen werden, ohne die Versuchstiere zu anästhesieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neurodegenerative Erkrankungen
- Mikrodialyse-Techniken
Hintergrund
- Das Verständnis der Dynamik der extrazellulären Flüssigkeit ist entscheidend für die Erforschung neuronaler Mechanismen und der Plastizität.
- Aktuelle Methoden beinhalten typischerweise invasive Techniken, die den biologischen Kontext beeinflussen können.
- Mittels Mikrodialyse lässt sich Interstitialflüssigkeit sammeln, während das Versuchstier wach ist, wodurch aussagekräftigere Daten gewonnen werden.
- Dieses Protokoll adressiert die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Überwachung der Zusammensetzung der Gehirnflüssigkeit in lebenden Modellen.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Überwachung von Krankheitsmarkern im Hippocampus durch Anwendung eines nicht-invasiven Probennahmeansatzes.
- Vorgabe eines detaillierten methodischen Rahmens, der es Forschern ermöglicht, das Verfahren zu replizieren.
- Einrichtung eines zuverlässigen Systems zur Beobachtung von Arzneimittelwirkungen und Stoffwechselveränderungen über die Zeit.
Verwendete Methoden
- Die Studie nutzt ein Mikrodialysesystem, das im CA1-Bereich des Hippocampus implantiert ist.
- Wache, nicht anästhesierte Ratten dienen als biologisches Modell zur Probenahme der HECF.
- Die Mikrodialyse-Technik misst die Flüssigkeit mit einer Rate von einem Mikroliter pro Minute.
- Kritische Schritte umfassen die präzise Katheterimplantation, die Equilibrierung und regelmäßige Probenahmeintervalle.
- Die Reinigung der Mikrodialyse-Sonde nach der Probenahme wird durchgeführt, um die Datenintegrität sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Das gesammelte HECF ist klar und farblos, was die Analyse von Krankheitsmarkern ermöglicht.
- Eine detaillierte Methodik ermöglicht Experimente zu den dynamischen Veränderungen in neuronalen Umgebungen.
- Die mit dieser Methode gewonnenen Informationen können zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und zum Verständnis des Gewebekatabolismus beitragen.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie zeigt das Potenzial der Mikrodialyse für ein besseres Verständnis der Dynamik von Gehirnflüssigkeiten und Krankheitsprozessen auf.
- Die Möglichkeit der kontinuierlichen Überwachung ermöglicht die Beurteilung von Echtzeitveränderungen in der Wirkung von Arzneimitteln und im Stoffwechselzustand.
- Diese Erkenntnisse sind entscheidend, um Strategien zur Behandlung neurologischer Erkrankungen zu verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Echtzeit-Dynamik-Sammlung von hippocampalem extrazellulärem Fluid (HECF) bei wachen Ratten ermöglicht die direkte Überwachung neurochemischer Veränderungen, die für den Fortschritt von ZNS-Erkrankungen und die Wirksamkeit von Arzneimitteln relevant sind. Diese Fähigkeit erhöht das Vorhersagevertrauen in der translationalen Neurowissenschaft, indem sie quantitative, zeitlich aufgelöste Biomarker-Daten aus für die Erkrankung relevante Hirnregionen bereitstellt. Der Ansatz unterstützt die frühe Entdeckung und die mechanistische Risikominimierung für Neurotherapeutika-Portfolios, die auf hippocampale Signalwege abzielen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der neurochemischen Dynamik, die den Mechanismen zentralnervöser Erkrankungen in vivo zugrunde liegt.
- Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch Quantifizierung der Wirkstoff- und Metabolitenwirkungen im Hippocampus.
- Erleichtert die mechanistische Ent风险bewertung durch direkte Messung krankheitsrelevanter extrazellulärer Marker.
Screening und Assay-Entwicklung
- Ermöglicht validierte, quantitative Probenahme der extrazellulären Flüssigkeit des Gehirns zur nachgeschalteten Wirkstoff-Screening.
- Ermöglicht reproduzierbare, standardisierte Erfassung neurochemischer Daten an wachen Tiermodellen.
- Unterstützt die Assay-Entwicklung zur Bewertung pharmakodynamischer Reaktionen auf zentralwirksame Verbindungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung präklinischer Biomarker-Messungen mit krankheitsrelevanten Endpunkten in der translationalen Neurowissenschaft.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem dynamische Wirkstoffeffekte in vivo verfolgt werden.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung auf Grundlage von Echtzeit-Neurochemie-Messwerten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Mikrodialysenmethode ist in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase integriert, da sie die Echtzeit- und quantitative Analyse der hippocampalen extrazellulären Flüssigkeit bei wachen Ratten ermöglicht.
- Entdeckungsbioanalytik: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen für ZNS-Ziele durch Überwachung dynamischer Biomarker-Veränderungen.
- Screening: Stellt assaysbereite, reproduzierbare neurochemische Daten für die Verbindungsbewertung bereit.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse zum Vergleich von Arzneimittelwirkungen und Krankheitszuständen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet präklinische und translationale Studien, indem die Biomarker-Messung mit klinischen Endpunkten abgestimmt wird.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für Workflows zur ZNS-Arzneimittelforschung und zur Validierung von Biomarkern.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Validierung zentralnervöser Zielstrukturen.
- Operativer Wert: Standardisiert die neurochemische Probenahme und verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen Studien.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Projekten sowie die Kapitaleffizienz, indem handlungsrelevante Biomarker-Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten für neurotherapeutische Wirkstoffe basierend auf dynamischen In-vivo-Ergebnissen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in stereotaktischer Chirurgie und der Implantation von Mikrodialyseson den.
- Benötigt spezialisierte Geräte für die Mikrodialyseprobennahme und quantitative Analyse.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Probenahmeraten und analytischen Protokolle.
- Die Anpassung an verschiedene Hirnregionen oder Krankheitsmodelle kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Die Probennahme ist auf Analyten unterhalb von 20 kDa beschränkt, bedingt durch die Grenzgrößenbestimmung der Sonde.
Biopharma-Häufig gestellte Fragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
