Name: Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Lernen Sie die dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus bei wachen Ratten mittels Mikrodialyse. Diese Methode ermöglicht die kontinuierliche Überwachung von Krankheitsmarkern im Zentralnervensystem.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82104533), dem Science &; Technology Department der Provinz Sichuan (2021YJ0175) und der China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei Herrn Yuncheng Hong, einem leitenden Ausrüstungsingenieur bei Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Singapur) für die Erbringung technischer Dienstleistungen für die Mikrodialysetechnik.

Das Versuchsprotokoll wurde in Übereinstimmung mit den Anforderungen des Ausschusses für den Einsatz von Labortieren und der institutionellen Tierpflege und -nutzung an der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu durchgeführt (Aktennummer: 2021-11). Für die vorliegende Studie wurden männliche Sprague Dawley (SD) Ratten (280 ± 20 g, 6-8 Wochen alt) verwendet.
1. Mikrodialysesonde des Gehirns, Implantationschirurgie
<ol><li>Verwenden Sie 3 % bzw. 1,5 % Isofluran für die Einleitung bzw. Aufrechterhaltung der Rattenanästhesie unter Verwendung eines Tieranästhesiesystems in einem Luft-Sauerstoff-Gemisch bei 0,6 l/min. Stellen Sie sicher, dass die Ratten tief betäubt werden, ohne dass sowohl ein Schmerzreflex als auch ein Hornhautreflex auftritt. Verwenden Sie tierärztliche Salbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell auf dem Schädel der betäubten Ratte mit einem Elektrorasierer im Präparationsbereich. Fixieren Sie dann die betäubte Ratte auf einem stereotaktischen Brain Locator. Desinfizieren Sie die Operationsstelle vor der Operation, indem Sie Povidon-Jod und Ethanol 3x mit einem sterilen Wattebausch auf den Operationsbereich auftragen. Tragen Sie Bupivacain topisch zur lokalen Analgesie auf. HINWEIS: Der gesamte Prozess der mikrodialysebasierten HECF-Probenentnahme ist in Abbildung 1 dargestellt.</li>
	<li>Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 cm großen kraniofazialen Schnitt in der Mitte und entfernen Sie die Knochenhaut mit einer chirurgischen Schere und einer Augenzange.</li>
	<li>Betrachten Sie das Bregma als basale Position und durchstechen Sie das Endokranium, um mit einem Schädelbohrer eine 2 mm große Öffnung an der anteroposterioren (AP) Position (-2 mm), der mediolateralen (ML) Position (-3,5 mm) und der dorsoventralen (DV) Position (-3,5 mm) (der Hippocampus CA1-Region) zu bohren.</li>
	<li>Fixieren Sie das Kathetermandrin am Greifer eines stereotaktischen Hirnortungsgeräts und passen Sie die Position des Mikrodialysegehäuses an den Positionen AP (-2 mm), ML (-3,5 mm) und DV (0 mm) an. Stellen Sie den DV-Wert des Stereo-Locators im Gehirn ein und implantieren Sie das Mikrodialysegehäuse in einer Tiefe von 3,5 mm in die CA1-Region. Anmerkungen: Halten Sie die Temperatur des Tieres während des Vorgangs mit einem Tiertemperaturhalter auf 37 °C.</li>
	<li>Bohren Sie drei weitere Öffnungen mit einem Durchmesser von 2 mm so, dass die drei Öffnungen ein Dreieck bilden, in dem sich die Sondenöffnung mittig befindet. Das Implantat wird in einer Tiefe von 1 mm in die Öffnungen eingeschraubt.</li>
	<li>Fixieren Sie den Sondenkatheter mit Zahnzement und verwenden Sie eine chirurgische 4-0-Naht, um die Haut zu schließen. Siehe Abbildung 2 für die Platzierung der Sonde.</li>
	<li>Setzen Sie die Ratte 7 Tage lang in Käfige, damit sie sich erholen kann. Bupivacain (1,5 mg/kg) einmal täglich nach der Operation lokal infiltrieren.  Stellen Sie Nahrung und Wasser nach Belieben zur Verfügung. Verwenden Sie 3x täglich Natriumhyaluronat-Augentropfen, um Trockenheit nach der Operation vorzubeugen. Anmerkungen: Führen Sie alle Eingriffe in einem sterilen Operationssaal durch. Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein bei 37 °C aufrechtzuerhalten. Geben Sie das Tier, das operiert wurde, nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es vollständig genesen ist.</li>
</ol>2. Anschluss des Mikrodialysesystems und Überprüfung der Sonde
<ol><li>Schließen Sie die Mikrodialysepumpe, die Mikrospritze, das Gerät für die Aufweckaktivität und den kryogenen Probensammler gemäß den Anweisungen des Herstellers an. Installieren Sie die Mikrospritze mit ACSF an der Mikrodialysepumpe und stellen Sie die Mikrodialysepumpe auf eine Rate von 1 μl/min ein, um die Luft in der Rohrleitung abzulassen.</li>
	<li>Pipeline und Hirnmikrodialysesonde anschließen (Membran: PAES; Membranlänge: 4 mm; Membran-AD: 0,5 mm; Cut-off: 20 kDa; Schaftlänge: 14 mm). Betreiben Sie die Mikrodialysepumpe mit einer Geschwindigkeit von 1 μl/min, um ACSF in die Sonde zu injizieren, bis die Oberfläche der Sonde leicht feucht ist. Tauchen Sie die Sonde zur späteren Verwendung in Heparin-Natrium-Injektionslösung. Anmerkungen: Wenn ein großer Strom des ACSF von der semipermeablen Membran der Sonde fällt, wie mit bloßem Auge unter Schwerkraft, ersetzen Sie die Sonde durch eine neue.</li>
</ol>3. Entnahme von HECF von der wachen Ratte
<ol><li>Führen Sie die Hirndialysesonde in den Sondenkatheter ein und legen Sie die Ratte in eine Kammer (Höhe: 360 mm; Durchmesser: 400 mm) mit Polsterung, um sicherzustellen, dass sich die Ratten frei bewegen können.</li>
	<li>Schließen Sie die Rohrleitung, die Mikrospritzenpumpe und die Mikrodialysesonde für das Gehirn an. Spannen Sie die Ratte über das Loch an der Oberseite der Rattenrückhaltevorrichtung und die Edelstahlwirbel an.</li>
	<li>Schalten Sie den Mehrkanal-Schwenkregler ein, um ein Verflechten der Mikrodialyseleitungen während der freien Bewegung der Ratte zu vermeiden. Schalten Sie die Mikrospritzenpumpe ein und pumpen Sie den ACSF mit einer Rate von 1 μl/min. Sammeln Sie HECF in regelmäßigen Abständen nach einer 60-minütigen Äquilibrierung des Mikrodialyse-HECF-Entnahmesystems.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate der HECF-Proben im Kühlfraktionssammler mit der ACSF-Infusion übereinstimmt. Sammeln Sie 20 μl HECF und wechseln Sie automatisch zum nächsten Probenahmeröhrchen. Achten Sie darauf, dass die Sondenmembran beim Einführen der Sonde beschädigt ist.</li>
</ol>4. Messung des osmotischen Drucks für den HECF
<ol><li>Schalten Sie das Osmometer ein und melden Sie sich beim Detektionssystem an. Klicken Sie auf dem Touchscreen auf die Schaltfläche Cal und dann auf die Schaltfläche Res auf der Seite, um den vorherigen Kalibrierungsspeicher zu löschen.</li>
	<li>Installieren Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit 100 μl reinem Wasser ohne Blasen auf dem Messkopf. Ziehen Sie den Messkopf an den Boden des kalten Hydrazinbehälters.</li>
	<li>Geben Sie die Probennummer 0 auf dem Touchscreen ein und bestätigen Sie den Test. Tauchen Sie die Diodennadel schnell in das Probenröhrchen ein und ziehen Sie sie dann schnell heraus, um die Kristallisation der Probe bei einer Temperatur von -6,2 °C einzuleiten.</li>
	<li>Warten Sie, bis der Bildschirm angezeigt wird: Drücken Sie den Messkopf nach oben und klicken Sie nacheinander auf Cal und Cal 0 , um zu kalibrieren. Führen Sie Messungen mit einer 300 mOsm-Kalibrierlösung durch und messen Sie den osmotischen Druck der HECF-Proben wie oben beschrieben. Anmerkungen: Wischen Sie den Messkopf nach der Kalibrierung oder Messung mit einem weichen Papiertuch ab. Die HECF-Proben ohne Blasen sollten gut gemischt werden.</li>
</ol>5. Wartung des Mikrodialysesystems und der Geräte nach der Probenahme
<ol><li>Nehmen Sie die Hirnmikrodialysesonde nach Beendigung der Probenahme aus dem Sondenkatheter. Tauchen Sie die Sonde in deionisiertes Wasser und spülen Sie sie 12 Stunden lang mit deionisiertem Wasser, um gestrandete Salzablagerungen aus der Rohrleitung und der Sonde zu entfernen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Sonde und legen Sie sie in eine 0,05%ige Trypsinlösung bei 4 °C. Trocknen Sie die Rohrleitungen im lufttrockenen Ofen bei 25 °C und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. HINWEIS: Die Mikrodialysesonden sind teuer und dieser Schritt kann die Wiederverwendbarkeit der Sonden erhöhen. Proteine, die an der Sondenoberfläche haften, können mit Trypsinlösung verdaut werden, um zu verhindern, dass die Sondenmembran durch Proteine blockiert wird, und Trypsin hatte keine Wirkung auf das Sondenmaterial.</li>
</ol>6. Behandlung der Tiere nach der Probenahme
<ol><li>Nach der Probenahme werden die Ratten schmerzlos eingeschläfert, indem Sie sie 1,5 % Isofluran inhalieren lassen, gefolgt von einer Überdosis von 5 % Isofluran in Übereinstimmung mit der Tierethik.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Pathogenese von ZNS-Erkrankungen ist noch nicht vollständig verstanden, was die Entwicklung neuer Therapien und Medikamente behindert. Studien haben gezeigt, dass die meisten ZNS-Erkrankungen eng mit Hippocampusläsionen verbunden sind20,21,22. Die vorgeschlagene Mikrodialysetechnik des Gehirns kann auf bestimmte Regionen des Gehirns abzielen, insbesondere auf den Hippocampus, was sie von der traditionellen Methode der HECF-E...

Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) mit hoher Morbidität, wie neurodegenerative Erkrankungen, Schädel-Hirn-Trauma, Hypoxie-induzierte Hirnverletzungen in großer Höhe und ischämischer Schlaganfall, sind entscheidende Ursachen für die weltweit steigende Sterblichkeit 1,2,3. Die Echtzeitüberwachung von Zytokinen und Proteinveränderungen in bestimmten Hirnregionen trägt zur diagnostischen Genauigkeit von ZNS-Erkrankungen und pharmakokinetischen Untersuchungen des Gehirns nach Medikation bei. In der traditionellen wissenschaftlichen Forschung wird das Homogenat von Hirngewebe oder eine manuelle Entnahme von interstitieller Hirnflüssigkeit von Tieren zum Nachweis spezifischer Substanzen und für pharmakokinetische Studien verwendet. Dies weist jedoch einige Mängel auf, wie z. B. eine begrenzte Stichprobengröße, die Unfähigkeit, die Änderungen der Indikatoren dynamisch zu beobachten, und eine ungleichmäßige Stichprobenqualität 4,5,6. Liquor, eine interstitielle Flüssigkeit, schützt Gehirn und Rückenmark vor mechanischen Schäden. Seine Zusammensetzung unterscheidet sich von der des Serums aufgrund des Vorhandenseins der Blut-Hirn-Schranke (BHS)7. Die direkte Analyse von Liquorproben ist eher geeignet, um den Mechanismus von ZNS-Läsionen und die Entdeckung von Medikamenten aufzudecken. Die Liquorproben, die manuell direkt aus der Cisterna magna und den Hirnventrikeln über eine Spritze entnommen werden, weisen zwangsläufig Nachteile der Blutkontamination, eine zufällige Chance auf Probenentnahme, eine Unsicherheit der Menge und fastkeine Möglichkeit der Mehrfachentnahme auf 8,9. Insbesondere können mit herkömmlichen interstitiellen Methoden zur Entnahme von Hirnflüssigkeit keine Proben aus geschädigten Hirnregionen entnommen werden, was die Erforschung der Pathogenese von ZNS-Erkrankungen in bestimmten Hirnregionen und die Wirksamkeitsbewertung gezielter ethnomedizinischer Therapien behindert 9,10.
Die Mikrodialyse des Gehirns ist eine Technik zur Entnahme von interstitieller Hirnflüssigkeit bei wachen Tieren11. Das Mikrodialysesystem imitiert die Gefäßpermeabilität mit Hilfe einer im Gehirn implantierten Sonde. Die Mikrodialysesonde ist mit einer semipermeablen Membran ausgestattet und wird in bestimmte Hirnregionen implantiert. Nach Perfusion mit isotonischem künstlichem Liquor cerebrospinalis (ACSF) kann die dialysierte interstitielle Hirnflüssigkeit mit den Vorteilen kleiner Probengrößen, kontinuierlicher Probenahme und dynamischer Beobachtung günstig entnommen werden12,13. In Bezug auf die Lokalisation können Hirnmikrodialysesonden selektiv in Gehirnstrukturen oder Schädelzisternen implantiert werden14. Die Beobachtung abnormer Konzentrationen einer körpereigenen Substanz in der extrazellulären Flüssigkeit des Hippocampus (HECF) deutet auf das Auftreten von ZNS-Erkrankungen oder die Pathogenese der Erkrankung hin. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Biomarker für ZNS-Erkrankungen, wie z. B. D-Aminosäuren bei Schizophrenie, β-Amyloid- und Tau-Proteine bei der Alzheimer-Krankheit, Neurofilament-Leichtketten bei traumatischen Hirnverletzungen und Ubiquitin-Carboxy-terminale Hydrolase L1s bei hypoxischer Ischämie-Enzephalopathie, im Liquor cerebrospinalis analysiert werdenkönnen 15,16,17 . Eine chemische Analysemethode, die auf der Mikrodialyse-Probenahmetechnik des Gehirns basiert, kann verwendet werden, um dynamische Veränderungen exogener Verbindungen, wie z. B. Wirkstoffe der Ethnomedizin, zu überwachen, die in bestimmten Hirnregionen diffundieren und verteilen14.
In diesem Artikel wird der spezifische Prozess der dynamischen HECF-Erfassung bei wachen Ratten vorgestellt und der osmotische Druck gemessen, um die Probenqualität sicherzustellen.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Lufttrockenschrank</td><td>Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd</td><td>GHG-9240A</td><td></td></tr><tr><td>Tieranästhesiesystem</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IE</td><td></td></tr><tr><td>Tiertemperaturhalter</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Künstliches Liquor</td><td>Beijing leagene biotech. Co., Ltd</td><td>CZ0522</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialysesonde</td> <td>für das Gehirn&nbsp; CMA Mikrodialyse AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td>Katheter</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td>Covance Infusionsgurt</td><td>Instech Laboratories, Inc.</td><td>CIH95</td><td></td></tr><tr><td>Prothesenbasisharze</td><td>Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd</td><td>190732</td><td></td></tr><tr><td>Elektrischer Schädelbohrer</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>CP-5200</td><td></td></tr><tr><td>Freilauftank für Tiere</td> <td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>CMA120</td><td></td></tr><tr><td>Heparin-Natrium-Injektion</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>H51021208</td><td></td></tr><tr><td>Iodophor</td><td>Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd</td><td>202201</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Katheter-Stilett</td><td> CMA Microdialysis AB</td><td>8011205</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Entnahmeröhrchen</td><td>&nbsp; CMA Mikrodialyse AB</td><td>7431100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Sammler</td><td> CMA Microdialysis AB</td><td>CMA4004 Fep-Schläuche</td><td></td></tr> für <tr><td>Mikrodialyse</td>&<td>nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>3409501</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse in vitro Stand</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>CMA130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Mikroinjektionspumpe</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>788130</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodialyse-Spritze (1,0 mL)</td><td> CMA Microdialysis AB</td><td>8309020</td><td></td></tr><tr><td>Adapter für Mikrodialyseschläuche</td><td> CMA Microdialysis AB</td><td>3409500</td><td></td></tr><tr><td>Nicht resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial</td><td>Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd</td><td>S19004</td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmische Zange</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>L&ouml; ser</td><td>OM 807</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhyaluronat-Augentropfen</td><td>URSAPHARM Arzneimittel GmbH</td><td>H20150150</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxie-Gerät</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>68025</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Rayward Life Technology Co., Ltd</td><td>S14014-15</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td>Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd</td><td>BY-103</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel</td><td>&nbsp; CMA Microdialysis AB</td><td>T56518</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Lösung</td><td>Boster Biological Technology, Ltd.</td><td></td><td></td>PYG0107</tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd</td><td>KMH1-240W8101</td><td></td></tr></tbody></table>

dynamische echtzeit-entnahme von extrazellulärer flüssigkeit aus dem hippocampus von bewussten ratten mit hilfe eines mikrodialysesystems

Real-Time Dynamic Collection of Hippocampal Extracellular Fluid from Conscious Rats Using a Microdialysis System

Eine Vielzahl von Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS) ist mit Veränderungen in der Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit des Hippocampus (HECF) verbunden. Die Schwierigkeit, HECF in Echtzeit von bewussten Ratten zu erhalten, hat jedoch lange Zeit die Bewertung des Fortschreitens der ZNS-Erkrankung und die Wirksamkeit der ethnomedizinischen Therapie eingeschränkt. Ermutigend ist, dass eine Gehirnmikrodialysetechnik für die kontinuierliche Probenahme mit den Vorteilen der dynamischen Beobachtung, der quantitativen Analyse und einer kleinen Stichprobengröße verwendet werden kann. Dies ermöglicht die Überwachung von Veränderungen des extrazellulären Flüssigkeitsgehalts für Verbindungen aus traditionellen Kräutern und deren Metaboliten im Gehirn lebender Tiere. Das Ziel dieser Studie war es daher, eine Mikrodialysesonde für die Zerebrospinalflüssigkeit mit einem dreidimensionalen stereotaktischen Apparat des Gehirns präzise in die Hippocampusregion von Sprague-Dawley-Ratten zu implantieren, die Molekulargewichte von mehr als 20 kDa abschneidet. Das hochwertige HECF wurde dann von bewussten Ratten mit einem Mikrodialyse-Probenahmekontrollsystem mit einer einstellbaren Probenahmerate von 2,87 nL/min - 2,98 mL/min gewonnen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Protokoll eine effiziente, schnelle und dynamische Methode zur Gewinnung von HECF bei wachen Ratten mit Hilfe der Mikrodialysetechnologie bietet, die uns unbegrenzte Möglichkeiten bietet, die Pathogenese von ZNS-bedingten Erkrankungen weiter zu erforschen und die Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten.

Nach dem obigen Versuchsprotokoll und den in Tabelle 1 festgelegten Probenahmeparametern wurde wasserähnliches, farbloses und transparentes Ratten-HECF mit der eingestellten Probenahmerate erhalten (Abbildung 1K). Der osmotische Druck des erhaltenen Ratten-HECF betrug 290-310 mOsm/L, was indirekt die Qualität der Proben sicherstellen kann18,19.
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Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte dynamische Echtzeit-Probenahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus wacher Ratten unter Verwendung eines Mikrodialysesystems.

Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems

A variety of central nervous system (CNS) diseases are associated with changes in the composition of hippocampal extracellular fluid (HECF). However, ...

Die extrazelluläre Flüssigkeit des Hippocampus und die Mikrodialysetechnik des Gehirns tragen zur Überwachung der krankheitsspezifischen Mikro- oder Zentralnervenerkrankungen bei. Die Mikrodialyse des Gehirns ermöglicht eine dynamische und kontinuierliche Inquisition von interstitieller Hirnflüssigkeit in bestimmten Hirnregionen von nicht anästhesierten Ratten. Beginnen Sie damit, die anästhesierte Ratte auf einem stereotaktischen Hirngerät zu fixieren und wischen Sie den rasierten Operationsbereich vor der Operation dreimal mit einem Povidon-Jod- und Ethanoltupfer ab.Machen Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen 1,5 Zentimeter langen kranialen Gesichtsschnitt in der Mitte und entfernen Sie die Knochenhaut mit einer chirurgischen Schere und einer Augenzange. Betrachtet man das Bregma als basale Position, so durchbohrt man mit einem Schädelbohrer das Endokranium, um eine zwei Millimeter große Öffnung in der Hippocampus-CA1-Region zu bohren. Fixieren Sie nun die Katheterstilette am Greifer eines stereotaktischen Hirnortungsgeräts und passen Sie die Position der Mikrodialysehülle an der anteroposterioriren, mediolateralen und dorsalen ventralen Position an.Stellen Sie das dorsoventrale Ventil des Stereo-Locators des Gehirns ein und implantieren Sie das Mikrodialysegehäuse in einer Tiefe von 3,5 Millimetern in die CA1-Region. Bohren Sie drei weitere Öffnungen mit einem Durchmesser von zwei Millimetern so, dass die drei Öffnungen ein Dreieck bilden, in dem sich die Sondenöffnung mittig befindet. Implantieren Sie in einem Millimeter Tiefe Schrauben in die Öffnungen und fixieren Sie den Sondenkatheter mit Zahnzement.Verwenden Sie dann eine chirurgische 4-O-Naht, um die Haut zu schließen. Verbinden Sie die Mikrospritze der Mikrodialysepumpe mit dem ACSF-Wachaktivitätsgerät und dem kryogenen Probensammler gemäß den Anweisungen des Herstellers. Um die Luft in der Rohrleitung abzulassen, stellen Sie die Mikrodialysepumpe auf eine Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute ein.Schließen Sie dann die Rohrleitung und die Gehirn-Mikrodialysesonde an und betreiben Sie die Mikrodialysepumpe mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute, um ACSF in die Sonde zu injizieren, bis die Oberfläche der Sonde leicht feucht ist. Tauchen Sie die Sonde zur späteren Verwendung in eine Heparin-Natrium-Injektionslösung. Um die HECF von der wachen Ratte zu entnehmen, führen Sie die Gehirn-Mikrodialysesonde in den Sondenkatheter ein und legen Sie die Ratte in eine Kammer mit Polsterung, um sicherzustellen, dass sich die Ratten frei bewegen können.Schalten Sie den Mehrkanal-Schwenkregler ein, um ein Verflechten der Mikrodialyseleitungen während der freien Bewegung der Ratte zu vermeiden. Schalten Sie dann die Mikrospritzenpumpe ein und pumpen Sie die ACSF mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute. Nach einer 60-minütigen Äquilibrierung des Mikrodialyse-HECF-Entnahmesystems ist das HECF in regelmäßigen Abständen zu entnehmen.Nehmen Sie nach dem Abschluß der Probenahme die Hirndialysesonde aus dem Sondenkatheter. Tauchen Sie die Sonde in deionisiertes Wasser und spülen Sie sie 12 Stunden lang mit deionisiertem Wasser, um gestrandete Salzablagerungen aus der Rohrleitung und der Sonde zu entfernen. Entfernen Sie die Sonde und legen Sie sie in eine 0,05%ige Tripsin-Lösung bei vier Grad Celsius.Die extrazelluläre Flüssigkeit des Hippocampus, die durch die Mikrodialysetechnik des Gehirns gewonnen wird, ist wasserähnlich, farblos und bei der eingestellten Probenahmerate transparent. Die wichtigsten Verfahren sind die vorsichtige Implantation der Mikrodialyse in den CA1-Bereich und das Einführen der Sonde in den Pop-Katheter. Die einfache Mikrodialysetechnik ermöglicht es, die dynamische Veränderung von Krankheitsmarkern in bestimmten Gehirnregionen, die Substanz der Wirksamkeit des Medikaments und den Gewebekatabolismus von Medikamentenbestandteilen zu unterstützen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Überwachung der extrazellulären Neurotransmitter Ebenen in verschiedenen Hirnregionen der frei beweglichen Tieren bietet Einblicke über den Zusammenhang zwischen Neurotransmittern und Verhalten. In-vivo-Mikrodialyse mit elektrochemischer Detektion gekoppelt bietet eine hervorragende anatomische und chemische Auflösung, und Informationen darüber, wie basale Neurotransmission wird durch pharmakologische oder physiologische Manipulationen verändert.

Survivable stereotaktischen Chirurgie in Nagetiere

Modulation der hippocampally-abhängige räumliche Arbeitsgedächtnis durch direkte intrahippocampal Mikroinjektion, begleitet und gefolgt...

Hippocampus Insulin Mikroinjektion und<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialysis Während Spatial Memory Testing

Das Video zeigt den Prozess der Verwendung einer Mikrodialysesonde, um extrazelluläre Proteine aus der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) eines Mäusegehirns zu sammeln. Eine Mikrodialysesonde, ausgestattet mit einer semipermeablen Membran mit hohem Molekulargewicht, wird über eine implantierte Führungskanüle in das Gehirn einer anästhesierten Maus eingeführt. Die Sonde, die mit Pumpen verbunden ist, ermöglicht es einem physiologischen Puffer, das Hirngewebe zu durchdringen und sich mit dem ISF...

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Tuning in der Hippocampal Theta Band<em&gt; In vitro</em&gt;: Methoden für die Aufnahme aus dem isolierten Nagetier Septohippocampal Circuit

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Aufzeichnung von räumlich eingeschränkt Schwingungen im Hippocampus Verhalten der Mäuse

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Mikrodialyse exzitatorischen Aminosäuren während der EEG-Ableitungen in Ratten frei beweglich

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Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems (Video) | JoVE Journal

Dynamische Echtzeit-Entnahme von extrazellulärer Flüssigkeit aus dem Hippocampus von bewussten Ratten mit Hilfe eines Mikrodialysesystems

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