Name: Zecken-Fütterung mit künstlicher Membran für Ixodes scapularis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die künstliche Membranfütterung von Zecken für Pathogen-Studien mit Ixodes scapularis. Diese Methode ermöglicht kontrollierte Forschung zu Zecken-Pathogen-Interaktionen ohne Tierwirte.

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5 minutes

1. Vorbereitung der Zeckenmembrankammer
<ol><li>Bereiten Sie eine flache, nicht poröse Oberfläche vor, z. B. eine Ebene aus Glas oder eine keramikbeschichtete Metallbasis eines Armständers, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen und dann mit einer einzigen Schicht Plastikfolie abdecken, wobei Sie darauf achten, dass die Kunststofffolie flach und ohne Blasen oder Falten ist (siehe Abbildung 1A).</li>
	<li>Kleben Sie 100% Viskoselinsen-Reinigungspapier auf die vorbereitete Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass es flach und leicht gespannt ist, mit Klebeband auf allen vier Seiten des Papiers. Zwei Stücke von 4 Zoll x 6 in Linsenpapier können unter Verwendung der in Schritt 1.3 beschriebenen Volumina zu Membranen verarbeitet werden. HINWEIS: Dies reicht aus, um bis zu 12 Fütterungskammern herzustellen (siehe Abbildung 1B). Wenn die Membran für Zeckenlarven gedacht ist, verwenden Sie Unryu-Papier anstelle von Linsenreinigungspapier.</li>
	<li>Bereiten Sie die Silikonmischung mit der Härte 00-10 vor, indem Sie 5 ml jedes Teils des Silikonkits in einen Einwegbehälter abmessen und die beiden Flüssigkeiten leicht mischen, bevor Sie 1,5 ml Hexan hinzufügen. Mischen Sie weiter, bis die Mischung homogen und gründlich gemischt ist. HINWEIS: Wenn Sie Membranen für erwachsene Zecken herstellen, verwenden Sie Silikon mit der Härte 00-50.</li>
	<li>Verwenden Sie einen kleinen Rakel, um die Silikonmischung über das Linsenpapier zu verteilen. 1 Minute stehen lassen, um sicherzustellen, dass das Silikon in das Linsenpapier eingedrungen ist. Überschüssiges Silikon mit dem Rakel mit etwas Druck nach unten zur Seite kratzen. Führen Sie einen zweiten Durchgang mit dem Rakel durch, ohne Druck nach unten auszuüben, um Silikonlinien zu entfernen und eine glatte Schicht zu erzeugen. HINWEIS: Dieser Schritt des Verfahrens kann etwas Übung erfordern, um Membranen mit optimaler Dicke für jedes Lebensstadium herzustellen (Erwachsene: 150-200 μm; Nymphen: 90-120 μm; Larven: 80-100 μm). Eine dickere Membran (innerhalb der Fütterungstoleranzen des Lebensstadiums) führt in der Regel zu besseren Ergebnissen, indem sie die Kondensation in der Kammer reduziert und die Selbstheilungseigenschaften der Membran verbessert.</li>
	<li>Tauchen Sie nur für Larven die Oberseite der Fütterungskammer mehrmals in Fluon-Fluorpolymerharz (PTFE-30), damit sie zwischen den Anwendungen trocknen kann, um eine gleichmäßige Schicht zu erzeugen. HINWEIS: Die Anwendung von Fluon bildet eine Antihaftschicht aus Fluorpolymerharz, ähnlich einer antihaftbeschichteten Kochpfanne. Dadurch wird die Anzahl der Larven reduziert, die auf die Oberseite der Kammerklettern 21.</li>
	<li>Lassen Sie die Membran mindestens 24 Stunden in einer staubfreien Umgebung, z. B. in einer geschlossenen Chemikalien- oder Biosicherheitswerkbank, aushärten, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. In Abbildung 1C sehen Sie , wie das Viskoselinsenpapier aussieht, nachdem das Silikon getrocknet wurde.</li>
	<li>Bereiten Sie die Silikonmischung mit 30 Härten vor, um die Kammern an der Membran zu befestigen, indem Sie zu gleichen Teilen die Silikonmischung A und B mischen.</li>
	<li>Tauchen Sie die Polycarbonatkammern etwa einen Viertelzoll (6 mm) in die Silikonmischung ein und legen Sie sie dann auf die Membranfolie, wobei darauf zu achten ist, dass sich das Klebeband nicht überlappt (Abbildung 1D).</li>
	<li>Lassen Sie das anhaftende Silikon mindestens 24 Stunden aushärten, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.</li>
	<li>Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einem Skalpell um jede der angebrachten Kammern herum und schneiden Sie die Kanten so ab, dass sie ohne großes Abkratzen an den Seiten problemlos in eine Vertiefung der 6-Well-Platte passt (Abbildung 1E). Lassen Sie ausreichend Material außerhalb der Kammer, um die Haftung der Membran zu maximieren. HINWEIS: Wenn zu viel Außenmaterial übrig bleibt, kann das wiederholte Entfernen der Kammer von der 6-Well-Platte dazu führen, dass sich die Membran teilweise von der Kammer löst. Die Reparatur abgelöster Membranen wird in Abschnitt 5 beschrieben.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kleines Stück der übrig gebliebenen Membran aus jeder der Ecken und der Mitte der Membranfolie. Entfernen Sie die Plastikfolie von jedem Stück. Messen Sie die Teile mit einem Mikrometer, um die durchschnittliche Membrandicke zu bestimmen. HINWEIS: Wenn die Membrandicke nicht innerhalb des Toleranzbereichs für das Lebensstadium liegt (siehe Schritt 1.4), sollten die Membranen verworfen und neu hergestellt werden. Die Dicke des Unryu-Papiers ist aufgrund seiner dicken Faserstränge und dünnen Bereiche sehr variabel. Während diese Eigenschaft es Larven ermöglicht, Regionen mit optimaler Dicke zu finden, ist es schwierig, die tatsächliche Membrandicke zu bestimmen.</li>
	<li>Die Fütterungskammern werden zusammen mit einem O-Ring pro Kammer in ein Becherglas gegeben, das bei 121 °C für mindestens 20 Minuten zur Sterilisation autoklaviert wird. Lassen Sie die Kammern abkühlen, bevor Sie sie verwenden.</li>
</ol>2. Einrichten des Tick-Feeds
<ol><li>Bereiten Sie eine Lampe oder einen Raum so vor, dass das Licht für 16 h eingeschaltet und dann für 8 h ausgeschaltet ist. Wenn Sie eine Lampe verwenden, stellen Sie sicher, dass das Wasserbad im nächsten Schritt für diese 8 Stunden im Dunkeln ist.</li>
	<li>Stellen Sie ein Wasserbad bei 34 °C und mit Stützen auf, so dass eine 6-Well-Platte darin sitzen und leicht schwimmen kann. Verwenden Sie kleine Glasbecher, die im Wasserbad versenkt sind, als Stützen. Verwenden Sie eine transparente Abdeckung für das Wasserbad, um einen Hell-Dunkel-Zyklus für die Zecken aufrechtzuerhalten. Verwenden Sie bei Bedarf einen T-Ständer und eine Plastikfolie, um eine Abdeckung herzustellen. Um das Kontaminationsrisiko zu verringern, geben Sie 0,02% Benzalkoniumchlorid in das Wasserbad und stellen Sie ein weiteres Wasserbad auf 36 °C ein, um das gekühlte Blut zu erwärmen.</li>
	<li>Nehmen Sie die vorbereiteten, autoklavierten Membrankammern heraus, legen Sie den O-Ring um die Kammer herum (Abbildung 1F) und füllen Sie dann jede Kammer mit genügend 70% igem Ethanol, um die Membran zu bedecken. Lassen Sie es 5 Minuten in einer 6-Well-Platte gut sitzen und suchen Sie dann nach Leckagen zwischen der Kammer und der Membran und in der Membran selbst. HINWEIS: Wenn die Membran undicht ist, sammelt sich Ethanol im Boden des Bohrlochs an. Undichte Membranen sollten entsorgt werden.</li>
	<li>Entleeren Sie das Ethanol aus den Kammern und lassen Sie es dann in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen. HINWEIS: Dies kann je nach Luftfeuchtigkeit einige Minuten dauern.</li>
	<li>Während der Wartezeit wird das Komplement im Blut durch Erhitzen bei 56 °C für 40 Minuten hitzeinaktiviert. Ergänzen Sie mechanisch defibriniertes Rinderblut mit 2 g/L Glukose.</li>
	<li>Nachdem die Membran trocken ist, tragen Sie ~ 20 μL Phagostimulans auf das Innere der Kammer auf und verteilen Sie es dann auf der Oberfläche, indem Sie die Kammer kippen. Siehe Abschnitt 6 für Anweisungen zur Herstellung eines Phagostimulans aus Zeckenfrass.</li>
	<li>Warten Sie, bis das Phagostimulans trocken ist, bevor Sie die Zecken mit einer Bürste oder einer Pinzette in die Kammer geben. Arbeiten Sie so schnell wie möglich, wenn Sie die Zecken in die Kammer übertragen, um ein Entweichen zu verhindern. Legen Sie die Zecken für 1-2 Minuten in ein Röhrchen auf Eis, bevor Sie sie übertragen, um ihre Fluchtfähigkeit zu verlangsamen. Nachdem die Zecken übertragen wurden, versiegeln Sie die Oberseite mit Parafilm; Überdehnen Sie den Parafilm nicht, da die Hitze des Wasserbades dazu führen kann, dass er reißt. HINWEIS: Pinzetten funktionieren am besten mit Nymphen- und Erwachsenenlebensstadien und Bürsten funktionieren am besten mit Larvenlebensstadien.</li>
	<li>5 ml des wärmeinaktivierten Blutes pro Vertiefung/Kammer in ein konisches Röhrchen geben und in das bei 36 °C eingestellte Wasserbad geben. Bringen Sie gekühltes Blut mindestens auf Raumtemperatur, bevor Sie die Zecken ihm aussetzen. Stellen Sie vier Kammern pro 6-Well-Platte zur Verfügung, um die Handhabung der Kammern zu erleichtern. Mehr Kammern pro Platte sollten vermieden werden, je nach Größe des Wasserbades können jedoch mehr Platten verwendet werden.</li>
	<li>Geben Sie 5 μL 3 mM ATP und 50 μL 100x Penicillin/Streptomycin/Fungizone pro 5 ml Blut in das Röhrchen.</li>
	<li>Übertragen Sie 4,5 ml des Blutes in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und legen Sie dann die Kammer vorsichtig in die Vertiefung, wobei Sie die Höhe des O-Rings auf der Kammer so einstellen, dass die Membran im Blut sitzt, aber der Blutspiegel um die Seite herum nicht über die Vertiefung hinausragt. Platzieren Sie die Vertiefung in einem Winkel im Blut, um die Bildung von Luftblasen zwischen dem Blut und der Membran zu vermeiden. HINWEIS: Eine fertige Platte ist in Abbildung 2 dargestellt.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte auf die Fütterungskammern. Anschließend die 6-Well-Platte mit den Kammern in das vorbereitete 34 °C warme Wasserbad geben und den Deckel schließen. HINWEIS: Der Deckel auf der Oberseite verhindert, dass kondensiertes Wasser mit dem Parafilm in Kontakt kommt und das Blut in den Vertiefungen verdünnt.</li>
</ol>3. Aufrechterhaltung der fütternden Zecken durch Wechsel des Blutes alle 12 Stunden
<ol><li>Aliquot 5 ml des wärmeinaktivierten Blutes pro Vertiefung in ein Röhrchen geben und in einem 36 °C warmen Wasserbad erwärmen. Tauen Sie ATP und Penicillin / Streptomycin / Pilzzone gleichzeitig im Wasserbad auf.</li>
	<li>Geben Sie 5 μL 3 mM ATP und 50 μL 100x Penicillin/Streptomycin/Fungizone pro Vertiefung in das Blutröhrchen. Übertragen Sie 4,5 ml Blut in eine Vertiefung einer frischen 6-Well-Platte.</li>
	<li>Nehmen Sie die 6-Well-Platte mit der Zeckenkammer aus dem Wasserbad. Nehmen Sie die Kammer aus dem Brunnen und spülen Sie die Außenseite der Kammer und der Membran mit 10 ml sterilem 1x PBS, um das Blut zu entfernen.</li>
	<li>Tupfen Sie die Membran und die Kammer mit autoklaviertem Filterpapier vorsichtig trocken, um das überschüssige PBS zu entfernen. Setzen Sie den Parafilm auf der Oberseite der Kammer wieder ein. Wenn sich in der Kammer viel Kondenswasser befindet, tupfen Sie die nassen Stellen mit autoklaviertem Filterpapier ab, bevor Sie sie mit frischem Parafilm verschließen.</li>
	<li>Legen Sie die Zeckenkammer in die neue 6-Well-Platte mit frischem Blut und passen Sie bei Bedarf die Höhe des O-Rings an. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.5 für jede Kammer auf der Platte. Legen Sie den Deckel der 6-Well-Platte über die Oberseite der Kammern. Schieben Sie die neue 6-Well-Platte zurück in das 34 °C warme Wasserbad.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5 alle 12 Stunden bis zum Abschluss des Zeckenfutters. Warten Sie, bis sich die Zecken von selbst von der Membran lösen, wenn sie geschwollen sind, oder entfernen Sie sie vorsichtig mit einer Soft-Touch-Pinzette, während sie noch befestigt sind, um teilweise verstopfte Zecken zu erhalten.</li>
</ol>4. Antimykotische Behandlung
HINWEIS: Nur durchführen, wenn Pilzwachstum auf der Membran zu sehen ist. Es ist wahrscheinlich, dass sich Pilze auf der Blutseite der Membran bilden, wenn die Fütterung von ausreichender Dauer ist. Der erste Hinweis auf eine Pilzkontamination sind kleine (1-3 mm) Flocken aus geronnenem Blut, die auf der Membran sichtbar sind. Wenn eine Pilzkontamination festgestellt wird, können antimykotische Behandlungen die Dauer des Experiments verlängern und den Schwellungserfolg verbessern.
<ol><li>Lösen Sie 10.000 U Nystatin pro ml in destilliertem Wasser auf, 5 ml pro Fütterungskammer. Filtersterilisieren Sie mit einem 0,1 μm Spritzenvorsatzfilter.</li>
	<li>Fügen Sie 5 ml Nystatinlösung pro Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte hinzu, eine Vertiefung für jede Fütterungskammer.</li>
	<li>Legen Sie PBS-gespülte Kammern in die Lösung. 10 min einwirken lassen.</li>
	<li>Spülen Sie die behandelten Membranen mit PBS ab, bevor Sie sie wieder in frisches Blut geben.</li>
	<li>Wiederholen Sie die antimykotische Behandlung alle 2-3 Tage (abhängig vom Ausmaß der Pilzbefallung) bis zum Abschluss des Experiments.</li>
</ol>5. Abgelöste Membranen mit Cyanacrylat-Kleber wieder verkleben
HINWEIS: Nur durchführen, wenn eine Membranablösung bemerkt wird.
<ol><li>Membranen können sich teilweise von den Zuführkammern lösen, insbesondere während der Entnahme von der 6-Well-Platte. Wenn dies geschieht, spülen Sie die Blutmembran mit PBS.</li>
	<li>Trocknen Sie die betroffene Stelle vorsichtig ab. Es muss nicht perfekt trocken sein, aber das Vorhandensein von Feuchtigkeit führt dazu, dass der Klebstoff schneller aushärtet. HINWEIS: Das Wiederverkleben der Membran begrenzt die Arbeitszeit, je nach Ablösungsgröße kann jedoch eine schnellere Abbindezeit wünschenswert sein.</li>
	<li>Drücken Sie eine kleine Menge Cyanacrylat-Kleber in den Spalt, in dem sich die Membran von der Kammer entfernt hat. Halten Sie es für ~ 2 Minuten an Ort und Stelle, damit der Kleber aushärten kann.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer wieder in das Blut in der 6-Well-Platte.</li>
</ol>6. Herstellung von Phagostimulans
HINWEIS: Führen Sie die Durchführung am Ende eines Feeds oder vor dem Start eines Membranfeeds durch.
<ol><li>Sammeln Sie Zeckenkot entweder von einer vorherigen Membranfütterung oder einer anderen Quelle von Zecken. Lagern Sie den Kot bei -20 °C, bevor Sie das Phagostimulans herstellen. Zerkleinern Sie die Pellets von Zeckenkot und mischen Sie 0,1 g pro 1 ml Wasser. Fügen Sie 1 mM Tripeptid reduziertes Glutathion hinzu, lösen Sie es auf und mischen Sie es gründlich durch Vortexen.</li>
	<li>Filtersterilisieren Sie mit einem 0,1 μm Spritzenvorsatzfilter.</li>
	<li>Bei -20 °C einfrieren, bis sie benötigt werden.</li>
</ol>

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Die künstliche Membranfütterung von Zecken ist ein nützliches Werkzeug für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, wird aber wahrscheinlich nicht für alle Anwendungen die Tierfütterung ersetzen. Die Erhaltung großer Zeckenkolonien in allen Lebensstadien ohne Tierfütterung ist in der Regel unhaltbar. Stattdessen ist das künstliche Fütterungssystem für andere Zwecke wertvoll, wie z. B. die Infektion von Zecken mit Krankheitserregern, die nicht von Modellwirten unterstützt werden, die Bewertung der Auswirkungen kontrol...

Durch Zecken übertragene Krankheiten haben weltweit starke Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier und waren von 2004 bis 2016 für mehr als zwei Drittel aller vektorassoziierten Erkrankungen in den USA verantwortlich1. Darüber hinaus sind die Fallzahlen in den letzten Jahren gestiegen, wobei immer mehr Menschen und Nutztiere von Zecken und den damit verbundenen Krankheiten betroffen sind 2,3. Während es wahrscheinlich zahlreiche Ursachen für den Aufwärtstrend bei den Fallzahlen gibt, ist der Klimawandel ein wichtiger Faktor 3,4. Der prognostizierte anhaltende Anstieg der Zahl der durch Zecken übertragenen Krankheitsfälle unterstreicht die Notwendigkeit, neue Instrumente zu entwickeln, um die Beziehungen zwischen Zecken und den von ihnen übertragenen Krankheitserregern zu untersuchen.
Es ist bekannt, dass Zecken während der Fütterung Veränderungen in der Physiologie und Genexpression erfahren und dass diese Veränderungen eine Rolle bei der Übertragung von Krankheitserregern spielen 5,6. Es kann schwierig sein, Studien durchzuführen, die die Auswirkungen der vollständigen und teilweisen Fütterung auf die Übertragung und den Erwerb von Krankheitserregern anhand von Tiermodellen untersuchen, insbesondere in Situationen, in denen Nagetiermodelle nicht anfällig für eine Infektion mit einem bestimmten Erreger sind. Zum Beispiel wird der Stamm Anaplasma phagocytophilum Variant-1 auf natürliche Weise zwischen Ixodes scapularis und Hirschen übertragen, ist aber nicht in der Lage, Mäuse zu infizieren, was die Zeckeninfektion im Labor erschwert7. Künstliche Fütterungssysteme können auch eingesetzt werden, um Krankheitserreger wie Borrelia burgdorferi durch den Einsatz transgener Mutanten zu untersuchen, die Gendeletionen aufweisen, die die Übertragung oder Infektion hemmen8. Die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems hilft den Forschern, die Rolle der Gene zu isolieren, indem eine Infektion oder Übertragung nur auf der Seite der Zecke stattfindet und dadurch jede Wirtsreaktion isoliert wird, die solche Studien verwirren könnte.
In ähnlicher Weise können einige Lebensstadien von Zecken, die an der Übertragung von Krankheiten und Tieren beteiligt sind, nicht dazu veranlasst werden, sich von gängigen Labormodellarten zu ernähren. Ixodes scapularis-Weibchen zum Beispiel müssen mit größeren Tieren, typischerweise Kaninchen, gefüttert werden9. Obwohl sie oft für Laborexperimente zugänglich sind, übersteigen die Verwaltungs- und Haltungsanforderungen für die Verwendung von Kaninchen die von kleinen Nagetieren und können für einige Laboratorien unerschwinglich sein. Andere Zeckenarten, insbesondere solche, die tierärztlich bedenklich sind, müssen mit Rindern oder anderen großen Tieren gefüttert werden, die in den meisten Laboratorien nicht praktikabel sind. In-vitro-Fütterungs - und Infektionsmethoden, wie z. B. künstliche Membranfütterung, bieten Alternativen zur Verwendung großer oder exotischer Wirtstiere.
Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines künstlichen Fütterungssystems bestimmte Analysen, die mit herkömmlichen Tierfütterungsmethoden möglicherweise nicht möglich sind. Ein Beispiel dafür ist, dass durch die Trennung der Blutquelle vom Fütterungsmechanismus die Untersuchung der Rolle, die das Blut verschiedener Wirte bei der Übertragung von B. burgdorferi spielen kann, möglich wird10. Diese Untersuchung des Wirtsblutes und der Rolle, die das Blut selbst in Abwesenheit der Immunantwort des Wirts spielt, ist ein wichtiger Faktor, um die Übertragungszyklen von Krankheitserregern zu verstehen, und einer, den künstliche Fütterungssysteme beantworten können11. Es wird auch möglich, die genauen Übertragungszahlen eines Erregers während einer Fütterung zu quantifizieren, anstatt nur den Übertragungserfolg und die Etablierung in einem Wirtzu untersuchen 8,12.
Einige der ersten künstlichen Futtermembranen für harte Zecken wurden in den 1950er und 1960er Jahren aus Tierhäuten oder tierischen Membranen hergestellt13,14. Aufgrund der biologischen Beschaffenheit dieser Membranen gab es Probleme sowohl bei der Herstellung neuer Membranen als auch bei der Haltbarkeit. In den 1990er Jahren wurden vollständig künstliche Membranen entwickelt, die eine Unterlage aus Netz, Papier oder Gewebe mit Silikonimprägnierung verwendeten15,16. Silikon war ideal, da seine physikalischen Eigenschaften die Dehnbarkeit und leichte Klebrigkeit der Haut sowie seine bioinhärente Natur nachahmen. Darauf aufbauend beschrieben Krober und Guerin, auf deren Arbeit diese Technik basierte, eine silikonimprägnierte Viskosemembran-Fütterungstechnik für die künstliche Ernährung von I. ricinus17.
Die Verfeinerung der Methoden für I. scapularis, eine eng verwandte Art, hat zu bemerkenswerten Unterschieden in der Härte von Silikon geführt, das bei der Membranimprägnierung verwendet wird, das Rezept für die Membranherstellung, die Abmessungen der Kammer und das Bindungsstimulans. Während die in dieser Studie berichteten Verfeinerungen zu ähnlichen Membraneigenschaften geführt haben wie die von Andrade et al., die auch eine Membran auf Silikonbasis auf der Basis von Krober und Guerin für den Einsatz in I. scapularis entwickelt haben, gibt es einen Unterschied in den Silikonimprägnierschritten, der die Flexibilität ermöglicht, dieses Protokoll für unreife Lebensstadien von I. scapularis15 zu verwenden. 18. Auflage. Diese Studie beschreibt auch Ergänzungen und technische Änderungen, die auf der wiederholten Anwendung dieser Methode basieren, Best Practices, die zu einem erfolgreichen Feed führen, und die Behebung von Problemen, die auftreten können. Diese Methode wurde verwendet, um alle aktiven Lebensstadien zu füttern, Zecken mit pathogenen Bakterien zu infizieren und Zecken mehreren Dosierungen von Antibiotika auszusetzen19,20. Während die gezeigte künstliche Membranfütterungsmethode für I. scapularis gilt, ist diese Methode mit geringfügigen Änderungen der Membrandicke leicht an andere Zeckenarten anpassbar.

<table><tbody><tr><td>00-10 Härte Silikon</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-10</td><td>Probiergröße aus dem Smooth-On Store</td></tr><tr><td>00-50 Härte Silikon</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-50</td><td>Probiergröße aus dem Smooth-On Store</td></tr><tr><td>30 Härte Silikon</td><td>Smooth-On</td><td>Mold Star 30</td><td>Probiergröße aus dem Smooth-On Store</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatten</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat (ATP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td>Wird verwendet, um eine wässrige Lösung von 3 mM ATP herzustellen, die über einen 0,2-Mikrometer-Filter gefiltert wurde.</td></tr><tr><td>Rinderblut</td><td>HemoStat</td><td>DBB500</td><td>Mechanisch defibriert; 500 mL sind in der Regel ausreichend für ein Experiment</td></tr>. <tr><td>Frischhaltefolie</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisherbrand</td><td>09-790-2C</td><td>Autoklavieren und vor Gebrauch abkühlen lassen. Kann auch feine Qualität anstelle von Medium verwenden</td></tr><tr><td>Fluon (wässriges Polytetrafluorethylen)</td><td>Bioquip</td><td>2871</td><td>Erhältlich aus anderen Quellen wie https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hexan</td><td>Millipore Sigma</td><td>139386-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Linsenpapier</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td>100% Viskose</td></tr><tr><td>Nystatin &nbsp;</td><td>Gold Biotechnologie</td><td>N-750-10</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisherbrand</td><td>S37440&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin/Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>oder gleichwertiges Generikum mit einer Konzentration wie folgt (10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10.000 &; Mikro; g/ml Streptomycin und 25 &micro; g/ml Amphotericin B)</td></tr><tr><td>Phagostimulans</td><td>Made in House</td><td></td><td>Gesammelt aus früheren Zeckenfütterungen</td></tr><tr><td>Polycarbonat Rohr</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K204&nbsp;</td><td>Schneiden auf 45 mm Länge, 1,25 Zoll Außendurchmesser, 1 Zoll Innendurchmesser. Zum Schneiden wird eine Kappsäge-Schleifscheibe benötigt.</td></tr><tr><td>Gummi O-Ringe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9452K38&nbsp;</td><td>5 mm dick, 1,25 Zoll Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Soft-Touch-Pinzette</td><td>VWR</td><td>470315-238&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Cyanacrylatkleber</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unryu Papier&nbsp;</td><td>Kunstbedarfsgeschäfte</td><td></td><td>Maulbeerfaser 10 g/m2. Gekauft im Wet Paint Art Supply Store, St. Paul, MN, USA</td></tr></tbody></table>

zecken-fütterung mit künstlicher membran für ixodes scapularis

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Zecken und die damit verbundenen Krankheiten sind aufgrund ihrer Belastung für die öffentliche Gesundheit und die Veterinärmedizin ein wichtiges Studienthema. Der Fütterungsbedarf von Zecken sowohl während der Studie als auch während der Aufzucht kann jedoch experimentelle Fragen oder die Fähigkeit von Laboren, Zecken und die damit verbundenen Krankheitserreger zu erforschen, einschränken. Ein künstliches Membranfütterungssystem kann diese Probleme reduzieren und neue Forschungswege eröffnen, die mit herkömmlichen Tierfütterungssystemen möglicherweise nicht möglich gewesen wären. Diese Studie beschreibt ein künstliches Membranfütterungssystem, das für den Fütterungs- und Schwellungserfolg für alle Lebensstadien von Ixodes scapularis verfeinert wurde. Darüber hinaus kann das in dieser Studie beschriebene künstliche Membranfütterungssystem durch einfache Verfeinerung der gewünschten Membrandicke für die Verwendung mit anderen Zeckenarten modifiziert werden. Die Vorteile eines künstlichen Membranfütterungssystems werden durch die Arbeitsintensität des Systems, die zusätzlichen Umweltfaktoren, die sich auf den Fütterungserfolg auswirken können, und die Notwendigkeit, die Technik für jede neue Art und jedes neue Lebensstadium von Zecken zu verfeinern, aufgewogen.

Eine erfolgreiche Fütterung hängt davon ab, ob eine Teil- oder Vollverstopfung gewünscht wird. Erfolgreich gefütterte I. scapularis färben sich für Erwachsene grau und lösen sich von selbst von der Membran. Wenn sie jedoch mindestens erbsengroß sind, können sie sich nach Beendigung der Fütterung von der Membran lösen. Bei unreifen Stadien von I. scapularis variiert die Größe für vollständig geschwollene Zecken, und da sie im Gegensatz zu Erwachsenen keine Farbänderung aufweisen, ist die Ablösung der bes...

Hier wird eine Methode vorgestellt, um Zecken in vitro über ein künstliches Membransystem zu ernähren, um eine teilweise oder vollständige Überfüllung einer Vielzahl von Zeckenlebensstadien zu ermöglichen.

Zecken-Fütterung mit künstlicher Membran für Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Während die künstliche Membranfütterung bereits früher durchgeführt wurde, ist unser Protokoll einfacher einzurichten und mit einigen Modifikationen an andere Zeckenarten anpassbar. Der Hauptvorteil der künstlichen Membranfütterung besteht darin, dass sie eine Exposition gegenüber Krankheitserregern und Behandlungen ermöglicht, die möglicherweise nicht durch Tierfütterung durchführbar sind. Dieses künstliche Membranfütterungssystem kann auf andere Arthropodenarten angewendet werden, wobei einige Tests auf ideale Phagostimulanzien und Modifikationen der idealen Membrandicke durchgeführt werden.Die Herstellung der richtigen Membrandicke erfordert etwas Übung. Achten Sie darauf, ein Mikrometer zu verwenden, um die Dicke an mehreren Stellen auf der Membran zu messen. Benjamin Cull, Postdoc in unserem Labor, wird mir helfen, das Verfahren zu demonstrieren.Wischen Sie zunächst eine flache, nicht poröse Oberfläche wie eine Glasscheibe oder eine keramikbeschichtete Metallbasis eines Armständers mit 70% Ethanol ab und bedecken Sie sie dann mit einer einzigen Schicht Plastikfolie. Stellen Sie sicher, dass die Plastikfolie flach und ohne Blasen oder Falten ist. Kleben Sie 100%iges Rayon-Linsenreinigungspapier auf die vorbereitete Oberfläche.Stellen Sie sicher, dass es flach und leicht gespannt ist, mit Klebeband auf allen vier Seiten des Papiers. Bereiten Sie die 0010-Silikonmischung vor, indem Sie fünf Milliliter jedes Teils des Silikonkits in einen Einwegbehälter abmessen. Mischen Sie die beiden Flüssigkeiten leicht und fügen Sie 1,5 Milliliter Hexan hinzu.Mischen Sie weiter, bis die Mischung homogen und gründlich gemischt ist. Verteilen Sie die Silikonmischung mit einem kleinen Rakel auf dem Linsenpapier und lassen Sie sie eine Minute stehen, um sicherzustellen, dass das Silikon in das Linsenpapier eingedrungen ist. Kratzen Sie das überschüssige Silikon mit dem Rakel mit etwas Druck nach unten zur Seite.Führen Sie einen zweiten Durchgang mit dem Rakel durch, ohne den Druck nach unten auszuüben, um Silikonlinien zu entfernen und eine glatte Schicht zu erzeugen. Tauchen Sie nur für Larven die Oberseite der Fütterungskammer mehrmals in Fluon-Fluorpolymerharz, damit sie zwischen den Anwendungen trocknen kann, um eine gleichmäßige Schicht zu erzeugen. Lassen Sie die Membran mindestens 24 Stunden in einer staubfreien Umgebung aushärten, z. B. in einer geschlossenen Chemikalien- oder Biosicherheitswerkbank.Als nächstes mischen Sie gleiche Teile der Silikonmischung A und B, um die Silikonmischung mit 30 Härten vorzubereiten, um die Kammern an der Membran zu befestigen. Tauchen Sie die Polycarbonatkammern etwa einen Viertelzoll in die Silikonmischung ein und legen Sie sie dann auf die Membranfolie, wobei Sie darauf achten, dass sich keines der Bänder überlappt. Lassen Sie das anhaftende Silikon mindestens 24 Stunden aushärten.Schneiden Sie die Membran vorsichtig mit einem Skalpell um jede der angebrachten Kammern herum und schneiden Sie die Kanten so ab, dass sie problemlos in eine Vertiefung der Sechs-Well-Platte passt, ohne dass die Seiten stark abgekratzt werden. Lassen Sie genügend Material außerhalb der Kammer, um die Zugabe der Membran zu maximieren. Schneiden Sie ein kleines Stück der übrig gebliebenen Membran aus jeder Ecke und der Mitte der Membranfolie.Entfernen Sie die Plastikfolie von jedem Stück und messen Sie die Stücke mit einem Mikrometer, um die durchschnittliche Membrandicke zu bestimmen. Legen Sie die Fütterungskammern zusammen mit einem O-Ring pro Kammer in ein Glasbecherglas und werden mindestens 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius sterilisiert. Lassen Sie die Kammern abkühlen, bevor Sie sie verwenden.Nachdem Sie die vorbereiteten, autoklavierten Membrankammern herausgenommen und den O-Ring um sie herum platziert haben, füllen Sie jede Kammer mit genügend 70% Ethanol, um die Membran zu bedecken. Lassen Sie es fünf Minuten lang in einer Platte mit sechs Vertiefungen stehen und suchen Sie dann nach Leckagen zwischen der Kammer und der Membran sowie in der Membran selbst. Entleeren Sie das Ethanol aus den Kammern und lassen Sie es dann in einer Biosicherheitswerkbank oder einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen.Um das Komplement im Blut zu erhitzen und zu aktivieren, erhitzen Sie es 40 Minuten lang bei 56 Grad Celsius und ergänzen Sie mechanisch defibrilliertes Rinderblut mit zwei Gramm pro Liter Glukose. Sobald die Membran trocken ist, tragen Sie etwa 20 Mikroliter Phagostimulans auf das Innere der Kammer auf und kippen Sie die Kammer, um sie auf der Oberfläche zu verteilen. Wenn das Phagostimulans trocken ist, fügen Sie die Zecken schnell mit einer Bürste oder einer Pinzette in die Kammer hinzu.Versiegeln Sie die Oberseite mit Parafilm, da die Hitze des Wasserbades dazu führen kann, dass sie reißt. Dann fünf Milliliter der Hitze und des aktivierten Blutes pro Vertiefung oder Kammer in ein konisches Röhrchen geben und in das bei 36 Grad Celsius eingestellte Wasserbad geben. Fügen Sie fünf Mikroliter drei Millimolar ATP und 50 Mikroliter 100X Penicillin-Streptomycin-Fungizone pro fünf Milliliter Blut in das Röhrchen hinzu und übertragen Sie 4,5 Milliliter des Blutes in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.Legen Sie die Kammer vorsichtig in die Vertiefung und stellen Sie die Höhe des O-Rings auf der Kammer so ein, dass die Membran im Blut sitzt, aber der Blutspiegel an der Seite die Vertiefung nicht übersteigt. Legen Sie dann den Brunnen in einem Winkel in das Blut, um eine Luftblasenbildung zwischen dem Blut und der Membran zu vermeiden. Setzen Sie den Deckel der sechs Well-Platten auf die Fütterungskammern.Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit den Kammern in das vorbereitete 34 Grad Celsius warme Wasserbad und den Deckel. Fügen Sie fünf Mikroliter drei Millimolar ATP und 50 Mikroliter 100X Vorrat an Penicillin Streptomycin Fungizon pro Vertiefung in die Blutröhre hinzu und übertragen Sie 4,5 Milliliter Blut in eine Vertiefung einer frischen Sechs-Well-Platte, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie die Sechs-Well-Platte mit der Zeckenkammer aus dem Wasserbad und entfernen Sie die Kammer aus dem Brunnen.Spülen Sie die Außenseite der Kammer und der Membran mit 10 Milliliter sterilisiertem 1X PBS, um das Blut zu entfernen. Tupfen Sie die Membran und die Kammer mit autoklaviertem Filterpapier vorsichtig trocken, um das überschüssige PBS zu entfernen. Wenn sich in der Kammer viel Kondenswasser befindet, tupfen Sie die nassen Stellen mit autoklaviertem Filterpapier ab, bevor Sie es mit frischem Parafilm versiegeln.Setzen Sie dann den Parafilm auf der Oberseite der Kammer ein. Legen Sie die Zeckenkammer in die neue Sechs-Well-Platte mit frischem Blut und passen Sie bei Bedarf die Höhe des O-Rings an. Wiederholen Sie diese Schritte für jede Kammer auf der Platte.Zum Schluss legen Sie den Deckel der Sechs-Well-Platte über die Oberseite der Kammern und schieben Sie die neue Sechs-Well-Platte zurück in das 34 Grad Celsius warme Wasserbad. Eine laufende Fütterung mit teilweise verstopften Nymphen von ixodes scapularis ist hier zu sehen. Die schwarzen oder braunen Punkte um die Befestigungsstellen sind der Frost, der während und nach der Fütterung gesammelt werden kann, um das Phagostimulans herzustellen.Teilweise verstopfte Ixodes scapularis-Nymphen sind an der Membran befestigt. Auch eine Schale des verstopften Larvenschimmelpilzes ist hier zu sehen. Die Zeckenschwellungszahlen und die Gewichte der Eiermasse sind in dieser Tabelle dargestellt.Bei der Larven- und Nymphenverstopfung wurde zusätzlich zu den in dieser Technik verwendeten Ergänzungen dem Blut ein Hirschorganhomogenat zugesetzt. Hier wurde eine erfolgreiche Verstopfung entweder als geschwollene Zecken definiert, die sich erfolgreich zum nächsten lebenden Stadium häuteten, oder als verstopfte Weibchen, die erfolgreich Eier legten. Es braucht Übung, um eine akzeptable Dicke zu erhalten, wenn Silikon auf das Linsenpapier aufgetragen wird, daher ist es immer wichtig, die Dicke der Membran vor dem Gebrauch zu messen.Die Membranfütterung kann Zecken Krankheitserregern oder Antibiotika aussetzen. Die Auswirkungen auf Aspekte der Zeckenbiologie wie Häutungserfolg, Eiablage und Überleben können nach der Fütterung beurteilt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Sammlung von infizierten Zecke Hämolymphe, Speicheldrüsen, und Speichel ist wichtig, zu untersuchen, wie durch Zecken übertragene Erreger eine Krankheit verursachen. In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie man Hämolymphe und Speicheldrüsen von der Fütterung...

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Lyme-Borreliose ist die am häufigsten berichteten Vektor-übertragene Krankheit in Nordamerika. Der Erreger ist Borrelia burgdorferi Spirochäten Bakterium übermittelt durch Schildzecken. Übertragung und Erfassung von Infektionen in Tiermodellen durch die Verwendung von Zecken Fütterung, die wir hier beschreiben optimiert.

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Ein Capsule-basiertes Modell für unreife harte Zeckenstadien Befall auf Labormäuse

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Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

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Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

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Zecken-Fütterung mit künstlicher Membran für Ixodes scapularis

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