Name: Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Elektroporation zur Transformation von Rickettsia parkeri mit fluoreszierenden Plasmiden in Zeckenzelllinien. Diese Methode ermöglicht gezielte Genfunktionsstudien bei obligat intrazellulären Bakterien.

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Wir danken Timothy J. Kurtti und Benjamin Cull für ihre aufschlussreichen Diskussionen und Anregungen. Diese Studie wurde finanziell durch einen Zuschuss an U.G.M. vom NIH (2R01AI049424) und einen Zuschuss an U.G.M. von der Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078) unterstützt.

1. Vermehrung und Reinigung von R. parkeri aus Zeckenzellkulturen
HINWEIS: Alle Zellkulturverfahren sind in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II durchzuführen.
<ol><li>Vorbereitend R. parkeri-infizierte Zeckenzellen<ol><li>ISE6-Zellen in 25 cm 2-Zellkulturkolben bei 34 °C in 5 ml L15C300 medium17 züchten, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum (FBS), 5% Tryptosephosphatbrühe (TPB) und 0,1% Lipoproteinkonzentrat (LPC). HINWEIS: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) ist eine Zeckenzelllinie, die in vielen Laboratorien ausgiebig verwendet wird und daher ein wesentliches Modell zur Untersuchung von Zecken-Erreger-Interaktionenist 17,18,19. Die Wachstumsrate von ISE6-Zellen ist langsamer als die von Säugetierzellen, mit einer Populationsverdopplungszeit von ≥72 h. Zum Beispiel benötigen ISE6-Zellen, die aus einer 100% konfluenten Kultur im Verhältnis 1:5 subkultiviert werden, 3-4 Wochen, um 100% Konfluenz wiederherzustellen. Gesunde ISE6-Zellen werden im Allgemeinen mit zahlreichen anhaftenden Filamentengerundet 17.</li>
		<li>Zählen Sie die ISE6-Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Lichtmikroskop. Verwenden Sie in einer Konzentration von ~ 106 Zellen / ml (100% konfluent).<ol><li>Spülen Sie die Zellen vorsichtig mit Medium aus dem Kolben und dispergieren Sie die Zellen durch Pipettieren, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen. Fügen Sie 20 μL Zellsuspension zwischen dem Hämozytometer und dem Deckglas hinzu, um die Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen.</li>
		</ol></li>
		<li>Wirtszellfreier Wildtyp R. parkeri 20 (durchschnittliche Anzahl: 5 × 10 7-10 × 107) zu den ISE6-Zellkulturkulturen in 25 cm2 Zellkulturkolben zugeben. Inkubieren infizierter R. parkeri-Zellkulturen bei 34 °C in 5 ml komplettem Medium, bestehend aus L15C300-Medium, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% Natriumbicarbonat (NaHCO3) und 25 mM HEPES, bis 90% -100% der Zellen infiziert sind. HINWEIS: Die Infektionsrate von R. parkeri in ISE6-Zellen wird durch Giemsa-Färbung bestimmt, und die Inkubationszeit bis zum Erreichen einer Infektion von 90% -100% liegt im Durchschnitt zwischen 5 Tagen und 7 Tagen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Infektionsrate über Giemsa-Färbung.<ol><li>Resuspendieren Sie im Biosicherheitswerkkasten die infizierten Zellkulturen und geben Sie 50 μL der Suspension in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
			<li>Die Suspension mit vollständigem Medium (1:5 Verdünnung) verdünnen und 100 μL auf Glasobjektträger mit einer Zentrifuge bei 113 × g für 5 min zentrifugieren. Um R. parkeri am Leben zu halten, verwenden Sie eine Zentrifuge mit einem versiegelten Rotor, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge entfernt werden kann. Dies ermöglicht den Transport des abgedichteten Rotors in und aus der Haube. HINWEIS: Da die R. parkeri vor der Zentrifugation noch am Leben sind, muss die Probe enthalten sein, bis die Rickettsien abgetötet sind. Daher muss die Zentrifuge, mit der die R. parkeri-Kultur auf den Objektträger gedreht wird, einen abgedichteten Rotor haben, der so konzipiert ist, dass er aus der Zentrifuge gehoben werden kann. Wenn sich der Rotor in der Laminar-Flow-Haube befindet, legen Sie die Proben in die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe, verschließen Sie den Rotor wieder und setzen Sie den versiegelten Rotor wieder in die Zentrifuge ein. Dann schalten Sie die Zentrifuge ein und die Proben werden auf die Objektträger gelegt. Nachdem der Lauf beendet ist, entfernen Sie den versiegelten Rotor aus der Zentrifuge und legen Sie ihn in die Laminarströmungshaube. Öffnen Sie dort den Rotordeckel und entladen Sie die Trichtermikroskop-Objektträgerbaugruppe in der Haube. Nach dem Trocknen tauchen Sie die Glasmikroskop-Objektträger in absolutes Methanol, das alle Krankheitserreger abtötet. Die Trichter und die Metallträger werden in verdünntes DMQ getaucht, das R. parkeri tötet.</li>
			<li>Trocknen Sie die Objektträger an der Luft und fixieren Sie sie in absolutem Methanol für 5 min bei Raumtemperatur (RT).</li>
			<li>Die Objektträger mit Giemsa-Färbung (4% im Puffer von Sørenson, pH 6,6) 30 min bei 37 °C färben und 5 s mit Wasser abspülen.</li>
			<li>Bestimmen Sie den Infektionsprozentsatz (Anzahl der mit Rickettsien infizierten Zellen/100 Zellen) durch Lichtmikroskopie. HINWEIS: Abbildung 1 zeigt typische Giemsa-Färbeergebnisse.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung von zellfreiem R. parkeri HINWEIS: Wenn 90% -100% der Zellen in der Kultur infiziert sind, sollten die Rickettsien aus den ISE6-Zellen isoliert und eine Elektroporation durchgeführt werden.<ol><li>Fügen Sie sterile 60-90 Siliziumkarbidkörnung zu sterilen 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf ein Volumen von ca. 0,2 ml hinzu.</li>
		<li>Entfernen Sie 2 ml Medium aus 100% R. parkeri-infizierten Kulturen (Schritt 1.1.3) und resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden 3 ml Medium.</li>
		<li>Gleiche Teile dieser Suspension werden in Röhrchen überführt, die in Schritt 1.2.1 hergestellt wurden.</li>
		<li>Wirbeln Sie jedes Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 30 s und legen Sie die Rohre dann auf Eis. Lassen Sie die Körnung innerhalb von Sekunden durch die Schwerkraft absetzen.</li>
		<li>Halten Sie in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II eine sterile 5-ml-Luer-Lock-Spritze bereit, wobei der Kolben ausgefahren und das Ende des Kolbens in einem Polystyrolboden für 15-ml-konische Röhrchen befestigt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie mit einer sterilen 1-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem geeigneten Pipettor angebracht ist, den Überstand des vortexierten Zelllysats aus dem Röhrchen und achten Sie darauf, keinen Splitt abzusaugen. Führen Sie die Pipetenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.</li>
		<li>Befestigen Sie einen sterilisierten 2-μm-Porenfilter an der Spritzennabe und filtrieren Sie die R. parkeri-Kultur aus Schritt 1.2.6 in sterile 1,5-ml-Röhrchen.</li>
		<li>R. parkeri wird 5 min lang bei 13.600 × g bei 4 °C bei 13.600 g gesammelt und der Überstand entsorgt.</li>
		<li>Das Pellet in 1,2 mL eiskalter 300 mM Saccharose resuspendieren und nochmals bei 13.600 × g bei 4 °C für 5 min zentrifugieren. Wiederholen Sie die Resuspension und Zentrifugation für insgesamt zwei Saccharosewaschgänge.</li>
		<li>Kombinieren Sie die R. parkeri-Pellets zu einem gekühlten, sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in 50 μL eiskalter 300 mM Saccharose pro Umwandlung. Da ein 25 cm2 Kolben R. parkeri genug Rickettsien für zwei bis drei Umwandlungen liefert, fügen Sie 100-150 μL 300 mM kalte Saccharose hinzu. HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Anzahl der Rickettsien mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer berechnet werden. Bei einer anfänglichen Impfung von 5 × 10 7 -10 × 10 7 zellfreien R. parkeri dauert es durchschnittlich 5-7 Tage, um eine 90%-100%ige Infektion zu erreichen, was etwa 5 × 107-10 × 1010 zellfreie R. parkeri ergibt. </li>
		<li>Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig durch Pipettieren, bis es vollständig dispergiert ist. Teilen Sie die Probe in 50-μL-Portionen in gekühlte, sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Falls gewünscht, kann die Rickettsiallebensfähigkeit durch Durchflusszytometrie nach Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff 21 beurteilt werden.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transformation von R. parkeri mit dem pRAM18dSFA-Plasmid
<ol><li>Auf Eis 3 μg endotoxinfreies pRAM18dSFA-Plasmid DNA 13,15,20 in jedes Röhrchen mit 50 μL R. parkeri Suspension geben und die Mischung mit der Pipetenspitze vorsichtig, aber gründlich umrühren. HINWEIS: Verwenden Sie bei der Herstellung von Plasmid-DNA ein Reinigungskit, das einen Schritt zur Entfernung von Endotoxinen enthält, um endotoxinfreie Plasmid-DNA23 zu erhalten. Wir fanden heraus, dass ein Bereich von Plasmidkonzentrationen zwischen 1 μg und 3 μg pro 50 μL R. parkeri Suspension zu erfolgreichen Transformationen führte, während eine Erhöhung der Plasmidmenge auf 10 μg die Transformation hemmte.</li>
	<li>Die obige Mischung aus DNA und R. parkeri wird in eine gekühlte, sterile 0,1 cm Spalt-Elektroporationsküvette überführt (klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, bis die Mischung gleichmäßig verteilt ist) und lassen Sie sie 10-30 min auf Eis sitzen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus einer 100% konfluenten Kultur von ISE6-Zellen und resuspendieren Sie die Zellschichten in 1,5 ml frischem Medium mit NaHCO 3 und HEPES-Puffer (oben in Schritt 1.1.3 beschrieben). Verwenden Sie einen Kolben konfluenter Zellen pro Transformation.</li>
	<li>Die resuspendierten Zellen werden in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt (ein Röhrchen pro 25 cm2-Kolben ISE6-Zellen).</li>
	<li>Elektropolat der R. parkeri/pRAM18dSFA-Mischung bei 1,8 KV, 200 Ohm, 25 μF unter Verwendung eines Elektroporators.</li>
	<li>Mit einer sterilen, verlängerten Feinspitzen-Transferpipette eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension (Schritt 2.4) in die Küvette überführen und die Flüssigkeit vorsichtig auf und ab ziehen, um die Küvette auszuwaschen. Die Mischung wird in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Rest der ISE6-Zellsuspension überführt und das Transformationsgemisch vorsichtig mit den Zellen gemischt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die transformierten Proben bei 700 × g für 2 min bei RT und erhöhen Sie dann die Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 13.600 × g für 1 min mehr bei RT. HINWEIS: Die beiden Zentrifugationsgeschwindigkeiten fördern die Rickettsialbindung mit und den Eintritt in die Zellen: 700 × g werden verwendet, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, während 13.600 × g zum Abziehen der Rickettsien verwendet werden.</li>
	<li>Lassen Sie die Proben 15 min bis 1 h bei RT oder 34 °C ruhen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Transformatoren (zwei oder drei) in ISE6-Zellen mit einer sterilen 2-ml-Barrierepipettenspitze, die an einem Pipettierer angebracht ist, und geben Sie sie in zwei oder drei 25-cm2-Zellkulturkolben mit 3,5 ml frischem Medium mit NaHCO3- und HEPES-Puffer. Alternativ können Sie eine sterile 2-ml-Pasteur-Pipette verwenden, die mit einem Gummikolben betrieben wird.</li>
	<li>Schaukeln Sie die Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie sie dann bei 34 °C.</li>
	<li>Nach 16-24 h werden in Schritt 2.10 10 μl Spectinomycin (50 mg/ml) und 10 μl Streptomycin (50 mg/ml) in jeden Kolben gegeben.</li>
</ol>3. Beobachtung des transformierten R. parkeri
HINWEIS: Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop mit Rhodamin/TRITC-Filtern, um die in Schritt 2.11 hergestellten Kolben nach 3-7 Tagen zu beobachten. Sobald Plaques in den Kulturen sichtbar sind (5-14 Tage), kann man transformierte R. parkeri sehen, die das rot fluoreszierende Protein mKATE exprimieren, das auf dem pRAM18dSFA-Plasmid kodiert ist.
<ol><li>Konfokale Mikroskopie<ol><li>Die Zellkulturen aus den Kolben der Stufe 2.11 werden resuspendiert und 100 μL dieser Zellkulturen mit 5 μL Hoechst 33342 Lösung für 10-30 min bei RT im Dunkeln gemischt. HINWEIS: Hoechst 33342 ist eine zelldurchlässige nukleare Gegenfärbung, die an lebende Zeckenzell-DNA bindet und blaue Fluoreszenz emittiert.</li>
		<li>50 μL der Mischung werden mit einer Zentrifuge bei 5 × g für 3 min auf Glasobjektträger zentrifugiert.</li>
		<li>3 μL 1x PBS an die Stelle der auf dem Objektträger abgelagerten Zellen geben, mit einem Deckglas überlagern und mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) betrachten. Verwenden Sie die folgenden Anregungs- und Emissionsparameter für die Fluoreszenzbildgebung: für 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), Anregung bei 350 nm, Emission bei 470 nm; für Tetramethylrhodamin (TRITC), Anregung bei 557 nm, Emission bei 576 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gillespie, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmids+and+rickettsial+evolution%3A+Insight+from+Rickettsia+felis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis.</a> PLoS One. 2 (3), 266(2007).</li>
<li>Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phylogeny+of+Rickettsia+using+different+evolutionary+signatures%3A+How+tree-like+is+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Biology%22%5BJournal%5D)">The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution.</a> Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).</li>
<li>Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+rickettsioses+around+the+world%3A+Emerging+diseases+challenging+old+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts.</a> Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).</li>
<li>Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsiae+as+emerging+infectious+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rickettsiae as emerging infectious agents.</a> Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).</li>
<li>Von Wintersdorff, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 173(2016).</li>
<li>Winkler, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+species+%28as+organisms%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia species (as organisms).</a> Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).</li>
<li>Wood, D. O., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+rickettsiae%3A+A+preview%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of rickettsiae: A preview.</a> Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).</li>
<li>Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+diversity+of+Rickettsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The emerging diversity of Rickettsia.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+intracellular+bacteria%3A+Progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).</li>
<li>Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Rickettsia+prowazekii+to+rifampin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance.</a> Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).</li>
<li>Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+Rickettsia+typhi+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation.</a> Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).</li>
<li>Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+conorii+O+antigen+is+the+target+of+bactericidal+Weil-Felix+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+shuttle+vectors+for+transformation+of+diverse+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species.</a> PLoS One. 6 (12), 29511(2011).</li>
<li>Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+epitope-tagged+virulence+protein+in+Rickettsia+parkeri+using+transposon+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion.</a> PloS One. 7 (5), 37310(2012).</li>
<li>Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+characteristics+are+altered+for+Rickettsia+bellii+transformed+to+overexpress+a+heterologous+rickA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).</li>
<li>Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+expressing+Rickettsia+buchneri+and+Rickettsia+peacockii+for+tracking+symbiont-tick+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 34(2016).</li>
<li>Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ixodes+scapularis+cell+line+with+a+predominantly+neuron-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype.</a> Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).</li>
<li>Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+reveals+proteins+for+metabolism+and+protein+processing+associated+with+Langat+virus+infection+in+Ixodes+scapularis+%28black-legged+tick%29+ISE6+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).</li>
<li>Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+cell+Lines+in+research+on+tick+control%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tick cell Lines in research on tick control.</a> Frontiers in Physiology. 11, 152(2020).</li>
<li>Wang, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrion-dependent+apoptosis+is+essential+for+Rickettsia+parkeri+infection+and+replication+in+vector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells.</a> mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).</li>
<li>Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+and+interpretation+of+bacterial+viability+by+using+the+LIVE%2FDEAD+BacLight+Kit+in+combination+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).</li>
<li>Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotransformation+and+clonal+isolation+of+Rickettsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species.</a> Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).</li>
<li>Burkhardt, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+rickettsial+host+range+for+shuttle+vectors+based+on+dnaA+and+parA+genes+from+the+pRM+plasmid+of+Rickettsia+monacensis%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).</li>
<li>Kurtti, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rickettsia+buchneri+sp.+nov.%2C+a+rickettsial+endosymbiont+of+the+blacklegged+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Systematic+and+Evolutionary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis.</a> International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965(2015).</li>
<li>Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formulation+of+medium+for+tick+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Formulation of medium for tick cell culture.</a> Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).</li>
<li>Bell-Sakyi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+lines+from+the+tick+Hyalomma+anatolicum+anatolicum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum.</a> The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).</li>
<li>Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cell+lines+and+a+rickettsial+endosymbiont+from+the+soft+tick+Carios+capensis+%28Acari%3A+Argasidae%3A+Ornithodorinae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae).</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).</li>
<li>Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+from+the+soft+tick+Ornithodoros+moubata%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata.</a> Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).</li>
</ol>

Es werden keine Interessenkonflikte deklariert.

Hier demonstrieren wir eine Methode zur Einführung exogener DNA, die auf dem Shuttle-Plasmid pRAM18dSFA kodiert, in Rickettsien mittels Elektroporation. Bei diesem Verfahren wurden zellfreie Rickettsien von Wirtszellen gereinigt, mit einem Rickettsial-Shuttle-Vektor transformiert und zur Infektion auf Zeckenzellen freigesetzt. Ebenfalls beschrieben ist ein konfokales Immunfluoreszenzverfahren zum Nachweis von rotem Fluoreszenzprotein-exprimierendem R. parkeri in Zeckenzellen. Ähnliche Methoden sind auf andere <e...

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien verursacht, die zur Gattung Rickettsia (Familie Rickettsiaceae, Ordnung Rickettsiales) gehören. Die Gattung Rickettsia wird anhand phylogenetischer Merkmale in vier Hauptgruppen eingeteilt1,2: die Fleckfiebergruppe (SFG), die diejenigen Rickettsien enthält, die die schwersten und tödlichsten durch Zecken übertragenen Rickettsiosen verursachen (z. B. Rickettsia rickettsii, der Erreger des Rocky-Mountain-Fleckfiebers), die Typhusgruppe (TG, z. B. Rickettsia prowazekii, der Erreger des epidemischen Typhus), die Übergangsgruppe (TRG, z. B. Rickettsia felis, der Erreger des durch Flöhe übertragenen Fleckfiebers) und die Ahnengruppe (AG, z. B. Rickettsia bellii).
Unter den ältesten bekannten vektorübertragenen Krankheiten werden Rickettsiosen hauptsächlich nach Übertragung der Erreger durch die Bisse infizierter Arthropodenvektoren, einschließlich Zecken, Flöhe, Läuse und Milben erworben 3,4. Obwohl die Entdeckung wirksamer Antibiotika die Behandlungsergebnisse verbesserte, stellen neu auftretende und wieder auftretende epidemische Rickettsiosen weiterhin traditionelle Präventions- und Kontrollstrategien in Frage. Daher würde ein umfassendes Verständnis der Rickettsien/Wirt/Vektor-Interaktionen letztendlich eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze zur Vorbeugung und Heilung dieser alten Krankheiten schaffen.
In der Natur erfolgt der horizontale Gentransfer (HGT) in Bakterien durch Konjugation, Transduktion und Transformation5. Die bakterielle In-vitro-Transformation nutzt diese HGT-Konzepte, obwohl die intrazelluläre Natur von Rickettsien einige Herausforderungen darstellt. Die eingeschränkten Wachstumsbedingungen und schlecht verstandenen Konjugations- und Transduktionssysteme bei verschiedenen Arten von Rickettsien haben die Anwendung von Konjugations- und Transduktionsmethoden bei Rickettsien 6,7,8 verhindert. Im Vergleich zu anderen obligaten intrazellulären Bakteriengattungen (z.B. Chlamydien, Coxiella, Anaplasma und Ehrlichia) unterscheidet sich die Gattung Rickettsia hinsichtlich der Wachstums- und Replikationsstrategien innerhalb des Zellzytoplasmas, was die genetische Veränderung von Rickettsien aufgrund ihrer einzigartigen Lebensweise vor besondere Herausforderungen stellt9.
Die erste Hürde, die es beim Versuch der genetischen Veränderung von Rickettsien zu überwinden gilt, ist eine erfolgreiche Transformation. Daher wäre die Entwicklung eines praktikablen Ansatzes mit hoher Transformationseffizienz äußerst wertvoll für die Entwicklung genetischer Werkzeuge für Rickettsien. Hier konzentrieren wir uns auf die Elektroporation, eine weithin anerkannte Transformationsmethode, die verwendet wurde, um exogene DNA erfolgreich in mehrere Arten von Rickettsien einzuführen, darunter Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii und Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des R. parkeri-Stammes Tate's Hell (Akzession: GCA_000965145.1) mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA, der vom Rickettsia-Amblyommatis-Stamm AaR/SC-Plasmid pRAM18 abgeleitet ist und entwickelt wurde, um mKATE, ein weit rot fluoreszierendes Protein, und aadA zu kodieren, wodurch Spectinomycin- und Streptomycin-Resistenz13,15,20 verliehen wird. Transformierte R. parkeri sind lebensfähig und werden unter Antibiotikaselektion in Zeckenzelllinien stabil gehalten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Lokalisation von transformiertem R. parkeri in lebenden Zeckenzellen mittels konfokaler Mikroskopie genutzt werden kann, um die Qualität von Transformationsraten in Vektorzelllinien zu beurteilen.

<table><tbody><tr><td>0,1 cm Lücke Genpulser Elektroporationsküvette</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; M Porengrößenfilter&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>6783-2520</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Luer-Lock-Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>60-90 Siliziumkarbid-Körnung&nbsp;</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>absolutes Methanol&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptosephosphat Brühe&nbsp;</td><td>BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin-Zentrifuge Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>Der Rotor ist abnehmbar, so dass der gesamte Rotor in die Haube eingesetzt werden kann, um infektiöse Proben zu laden</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>zur Gewinnung von endotoxinfreiem pRAM18dSFA-Plasmid</td></tr><tr><td>mit erweiterter Feinspitzen-Transferpipette&nbsp;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>Die FBS-Charge muss getestet werden, um sicherzustellen, dass ISE6-Zellen darin gut wachsen.</td></tr><tr><td>Gene Pulser II Elektroporator mit Pulse Controller PLUS</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105 & 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Fiji</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td>Rohbildbearbeitung</td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa Färbung</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td></tr><tr><td>Lipoprotein-Konzentrat&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>191476</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Diaphot</td><td>Nikon</td><td></td><td>Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Reagenz&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU) Konfokalmikroskop&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser Zählkammer</td><td>Hausser Scientific</td> <td>&nbsp; Kammer 3900</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

eine elektroporationsmethode zur transformation von rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden protein-exprimierenden shuttle-vektor in zeckenzelllinien

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Rickettsiosen werden durch eine breite Palette von obligaten intrazellulären Bakterien der Gattung Rickettsia verursacht, die durch den Biss infizierter Arthropodenvektoren auf Wirbeltierwirte übertragen werden können. Bis heute bleiben neu auftretende oder wieder auftretende epidemische Rickettsiosen aufgrund der Schwierigkeit bei der Diagnose ein Risiko für die öffentliche Gesundheit, da diagnostische Methoden begrenzt und nicht standardisiert oder allgemein zugänglich sind. Fehldiagnosen, die aus einer mangelnden Erkennung der Anzeichen und Symptome resultieren, können zu einer verzögerten Antibiotikabehandlung und schlechten Gesundheitsergebnissen führen. Ein umfassendes Verständnis der Rickettsienmerkmale würde letztendlich die klinische Diagnose, Bewertung und Behandlung mit verbesserter Kontrolle und Prävention der Krankheit verbessern. 
Funktionelle Studien von Rickettsialgenen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur Elektroporation des Rickettsia parkeri Stammes Tate's Hell mit dem Shuttle-Vektor pRAM18dSFA und die Selektion von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellkultur mit Antibiotika (Spectinomycin und Streptomycin). Es wird auch eine Methode zur Lokalisation von transformiertem R. parkeri in Zeckenzellen unter Verwendung der konfokalen Immunfluoreszenzmikroskopie beschrieben, einer nützlichen Technik zur Überprüfung der Transformation in Vektorzelllinien. Ähnliche Ansätze eignen sich auch für die Transformation anderer Rickettsien.

Die Morphologie von R. parkeri in ISE6-Zellen unter einem Lichtmikroskop nach Giemsa-Färbung ist in Abbildung 1 dargestellt. In Abbildung 2 sind transformierte R. parkeri , die rotes Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie dargestellt. Es gibt einen erheblichen Anstieg der Infektionsrate von transformiertem R. parkeri (rot) in ISE6-Zellen (blau, entspricht den Kernen) von (A) Tag 7...

Die Elektroporation ist eine schnelle, weit verbreitete Methode zur Einführung exogener DNA in die Gattung Rickettsia. Dieses Protokoll bietet eine nützliche Elektroporationsmethode für die Umwandlung von obligaten intrazellulären Bakterien in der Gattung Rickettsia.

Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Funktionelle Studien von Rickettsia-Genen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in der Pathogenese, daher benötigen wir zuverlässige Methoden, um die Gene kontrolliert zu verändern. Unser Protokoll verwendet Elektroporation, um exogene DNA in obligate intrazelluläre Bakterien der Gattung Rickettsia einzuführen, wodurch wir die Auswirkungen der eingeführten DNA untersuchen können. Gemeinsam mit mir wird heute Lisa Price, Forscherin aus dem Labor von Dr. Munderloh und Dr. Kurtti, das Verfahren demonstrieren.Um zu beginnen, bereiten Sie eine 90 bis 100% Rickettsia parkeri-infizierte ISE6-Zellkultur vor, wie im Text beschrieben. Um dann die Infektionsrate durch Giemsa-Färbung zu bestimmen, verdünnen Sie die Zellsuspension auf ein Verhältnis von 1:5 mit vollständigem Medium und geben Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension durch Zentrifugation bei 113 G für fünf Minuten auf einen Glasmikroskopobjektträger. Nachdem Sie den Schieber an der Luft trocknen lassen, fixieren Sie ihn fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit absolutem Methanol.Dann inkubieren Sie den Objektträger und die Giemsa-Färbung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes spülen Sie den Objektträger in Wasser ab und betrachten Sie ihn nach dem Trocknen unter einem Lichtmikroskop mit Ölobjektiven. Bestimmen Sie den Prozentsatz der infizierten Zellen, indem Sie die infizierten und nicht infizierten Zellen zählen.Zur Herstellung der zellfreien Rickettsia parkeri gießen Sie etwa 0,2 Milliliter sterile 60 bis 90 Siliziumkarbidkörnung in zwei zwei Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhrchen und stellen die Röhrchen beiseite. Aus einem zuvor inokulierten Rickettsia parkeri-infizierten Kolben mit fünf Milliliter Medium zwei Milliliter des Mediums entfernen und darauf achten, die Zellschicht nicht zu stören. Dann resuspendieren Sie die Zellen mit den verbleibenden drei Milliliter des Mediums.Teilen Sie diese Aufhängung gleichmäßig auf die beiden vorbereiteten Silikonkarbid-Sandschläuche auf und wirbeln Sie das Rohr 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit durch. Dann legen Sie sie auf Eis. Als nächstes bereiten Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Luer-Lock-Spritze vor, indem Sie den Kolben verlängern und das Kolbenende in eine Polystyrolbasis einführen, die zur Aufnahme konischer 15-Milliliter-Röhrchen verwendet wird.Entfernen Sie mit einer Barriere-Zwei-Milliliter-Pasteur-Pipette, die mit einem Gummikolben betrieben wird, vorsichtig den Überstand der Wirbelzellen, ohne Körnung anzusaugen. Führen Sie dann die Pipettenspitze in die Öffnung der Spritzennabe ein und werfen Sie den Inhalt mit leichtem Druck in die Spritze. Als nächstes filtrieren Sie die Rickettsia parkeri-Kultur in sterile 1,5-Milliliter-Röhrchen durch einen sterilen Zwei-Mikrometer-Porenfilter auf der Spritzennabe und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.600 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Entfernen des Überstands waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 1,2 Milliliter 300-Millimolar-eiskalter Saccharoselösung. Zentrifugieren Sie die Probe und entfernen Sie den Überstand zwischen den Waschgängen. Am Ende der Zentrifugation wird das gepoolte Zellpellet mit 100 bis 150 Mikrolitern eiskalter Saccharoselösung für zwei bis drei Transformationsproben resuspendiert.Dann teilen Sie die Probe in 50-Mikroliter-Aliquots in vorgekühlten, sterilen 1,5-Mikrozentrifugenröhrchen. Zur Umwandlung bei drei Mikrogramm endotoxinfreier pRAM18sSFA-Plasmid-DNA in jedes Röhrchen mit 50 Mikrolitern Rickettsia parkeri auf Eis und vorsichtig mit einer Pipettenspitze umrühren. Die Mischung wird in eine vorgekühlte sterile Elektroporationsküvette mit einer Spaltgröße von 0,1 Zentimetern überführt.Klopfen Sie vorsichtig auf die Küvette, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen, und brüten Sie 10 bis 30 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit entfernen Sie das Medium aus einem vollständig konfluenten zuvor kultivierten ISE6-Zellkulturkolben und resuspendieren die Zellschicht, indem Sie die Zellen vorsichtig mit 1,5 Milliliter frischem Medium spülen, das Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer enthält. Nach der Erzeugung einer homogenen Zellsuspension wird das gesamte Volumen in ein einziges steriles Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Als nächstes elektropolieren Sie die Rickettsia parkeri und die Plasmid-DNA-Mischung unter Verwendung eines Elektroporators. Verwenden Sie nach der Elektroporation eine sterile verlängerte Feinspitzenpipette, um eine kleine Menge der ISE6-Zellsuspension in die Küvette zu überführen, und pipetten Sie vorsichtig auf und ab, um die elektropolierte Rickettsia parkeri zurückzugewinnen. Dann wird der Inhalt der Küvette in das Zwei-Milliliter-Röhrchen überführt, das den Rest der ISE6-Zellsuspension enthält.Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei Raumtemperatur, zuerst bei 700 G für zwei Minuten, um die ISE6-Zellen herunterzuziehen, und dann bei 13, 600 G für eine Minute, um die Rickettsia herunterzuziehen. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 34 Grad Celsius für 15 Minuten bis eine Stunde. Nach der Inkubation wird der resuspendierte Inhalt einer Transformation in einen 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben mit 3,5 Milliliter frischem Medium mit Natriumbicarbonat und HEPES-Puffer überführt.Schaukeln Sie den Kolben, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen und bei 34 Grad Celsius zu inkubieren. Nach 16 bis 24 Stunden jeweils 10 Mikroliter Spectinomycin und Streptomycin in den inkubierten Kolben geben. Schütteln Sie den Kolben, um die Antibiotika gleichmäßig in das Medium zu mischen, bevor der Kolben in den Inkubator zurückgebracht wird.Die erfolgreiche Vermehrung von Wildtyp-Rickettsia parkeri- und ISE6-Zellen wurde durch Giemsa-Färbung nachgewiesen. Die mit Giemsa dunkelviolett gefärbten Kerne der ISE6-Zellen sind sowohl im intrazellulären als auch im extrazellulären Rickettsi sichtbar. Die Transformation von Rickettsia parkeri, die das rote Fluoreszenzprotein in ISE6-Zellen exprimiert, wurde nach sieben Tagen Inkubation durch konfokale Mikroskopie bestätigt.Ein erheblicher Anstieg der Infektionsrate wurde nach 10 Tagen beobachtet. Halten Sie alles während des gesamten Verfahrens steril. Achten Sie auf Details und seien Sie geduldig, da einige Arten von Rickettsien lange brauchen, um sich zu transformieren, insbesondere langsam wachsende Endosymbionten.Dieses Protokoll hat die Untersuchung mehrerer Aspekte der Rickettsienbiologie und ihrer Interaktionen mit ihren Arthropodenvektoren und Säugetierwirten ermöglicht. Zum Beispiel wurden fluoreszierende Protein-exprimierende Rickettsi verwendet, um Motilität und Symbionten-Zeckenzell-Interaktionen zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.

Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut

Quelle: Aigrain, L., et al. Internalisierung und Beobachtung fluoreszierender Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen mittels Elektroporation.  J. Vis. Exp. (2015)Das Video demonstriert die Abgabe von fluoreszierenden Biomolekülen in elektrokompetente mikrobielle Zellen mittels Elektroporation. Der Prozess beginnt mit der Einführung von fluorophor-markierter DNA oder Proteinen in eine gekühlte Zellsuspension. Anschließend wird ein Hochspannungsimpuls angelegt, um temporäre Membranporen zu...

Elektroporationsbasierte Abgabe fluoreszierender Biomoleküle in Bakterienzellen

Dieses Video demonstriert die Elektroporationstechnik, die fluoreszierende Protein-kodierende Plasmid-DNA in primäre Kleinhirn-Körnerzell-Vorläufer der Maus einführt.

Elektroporationsvermittelte In-vitro-Genabgabe: Eine elektrische Impulstechnik zur Einführung von fluoreszierenden Reporterprotein-kodierenden Plasmiden in kultivierte Zellen

In diesem Video beschreiben wir die Nukleofektion, ein auf Elektroporation basierendes Transfektionsverfahren, um fluoreszierende Reporterprotein-kodierende Plasmid-DNA in die Sporozoitenform des Hühner-Eimeria-Parasiten zu bringen.

Nukleofektion von Parasitenformen: Eine auf Elektroporation basierende Transfektionsmethode zur Abgabe von fluoreszierenden Protein-kodierenden Plasmiden in den Sporozoitenkern

In diesem Video demonstrieren wir die Einführung von bakteriellen Effektorproteinen in Säugetierzellen durch Elektroporation. Die intrazelluläre Lokalisation der bakteriellen Effektorproteine wird durch konfokale Mikroskopie nach Färbung mit spezifischen Fluorophor-konjugierten Antikörpern nachgewiesen.

Einbringen von bakteriellen Effektorproteinen in Säugetierzellen durch Elektroporation

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Elektroporation wurde verwendet, um gereinigte bakterielle Virulenzeffektorproteine direkt in lebende eukaryotische Zellen einzubringen. Die Proteinlokalisation wurde durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie überwacht. Diese Methode ermöglicht Studien zum Transport, zur Funktion und zu Protein-Protein-Wechselwirkungen mit aktiven exogenen Proteinen, wodurch die Notwendigkeit einer heterologen Expression in eukaryotischen Zellen vermieden wird.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

Die Effektortranslokation in Wirtszellen über ein Typ-III-Sekretionssystem ist eine gängige Virulenzstrategie bei gramnegativen Bakterien. Es wurde ein auf Beta-Lactamase-Effektorfusion basierender Assay zur quantitativen Analyse der Translokation angewendet. In Yersinien-infizierten Zellen wird die Umwandlung eines FRET-Reporters durch die Beta-Lactamase mittels Laser-Scanning-Mikroskopie überwacht.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Injektion von Zeckenembryonen. Die Embryoinjektion ist die bevorzugte Technik zur genetischen Manipulation, um transgene Linien zu erzeugen.

Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Die Fähigkeit von Bakteriophagen, DNA zwischen Bakterienzellen zu bewegen, macht sie zu wirksamen Werkzeugen für die genetische Manipulation ihrer bakteriellen Wirte. Hier wird eine Methodik zur Induktion, Wiederherstellung und Verwendung von φBB-1, einem Bakteriophagen von Borrelia burgdorferi, vorgestellt, um heterologe DNA zwischen verschiedenen Stämmen der Lyme-Borreliose Spirochäte zu transduzieren.

Phagenvermittelte genetische Manipulation der Borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Erfahren Sie die Elektroporation zur Transformation von Rickettsia parkeri mit fluoreszierenden Plasmiden in Zeckenzelllinien. Diese Methode ermöglicht gezielte Genfunktionsstudien bei obligat intrazellulären Bakterien.

Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien (Video) | JoVE Journal

Eine Elektroporationsmethode zur Transformation von Rickettsien spp. mit einem fluoreszierenden Protein-exprimierenden Shuttle-Vektor in Zeckenzelllinien

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