Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

Organoide und Sphäroide, die sehr zerbrechlich sind, werden bei der Handhabung ernsthaft beschädigt. Unser Protokoll stellt sicher, dass diese 3D-Wachstumsstrukturen während verschiedener Prozesse intakt bleiben, wodurch die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit erhöht wird. Der Forscher kann ganze Organoide und Sphäroide unter verschiedenen Mikroskopen kultivieren, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und untersuchen, während sie in einem Hydrogel in einem einzigen Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Es ermöglicht die Erstellung eines Krankheitsmodells und die Verfolgung sequenzieller Schritte in einem Mehrzweckgerät. Die Technologie bringt mehr Genauigkeit bei der Untersuchung von Biomarkern für die Diagnose und Prognose von Krankheiten. Diese Methode kann auf jedes 3D-Wachstumssystem angewendet werden, einschließlich Organoide, Sphäroide, einzelne Zellen oder lebende Organismen.

Um die Organoid- oder Sphäroidkultur zu beginnen, legen Sie das ordnungsgemäß aufgetaute Hydrogel für 15 Minuten auf Eis in eine Laminar-Flow-Haube. Bewahren Sie auch das Röhrchen mit einem Pellet des hepatozellulären Karzinoms oder HEPG2-Zellen auf Eis auf. Als nächstes Platte 30 bis 35 Mikroliter 100% Hydrogel in der Nische des vorgewärmten Mehrzweckgeräts, um einen Geltropfen zu erzeugen, platzieren Sie 10.000 HEPG2-Zellen in der Mitte der Oberseite des Hydrogeltropfens und inkubieren Sie das Setup bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.

Nach der Inkubation den Hydrogeltropfen mit 200 Mikrolitern Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) abdecken, das 10% fötales Rinderserum oder FBS enthält. Setzen Sie den Deckel ordnungsgemäß auf das Gerät, damit Gas fließen kann, bevor Sie es in den Inkubator legen. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit 200 Mikrolitern DMEM mit 10% FBS.

Überprüfen Sie das Wachstum der Sphäroide unter einem inversen Mikroskop. Bevor Sie mit der Immunfluoreszenzmarkierung der Organoide beginnen, erwärmen Sie die erforderlichen Medien und Lösungen auf 37 Grad Celsius. Saugen Sie das Zellkulturmedium, das den Hydrogeltropfen umgibt, ab, bevor Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd hinzufügen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist, und fixieren Sie es, indem Sie es für 15 bis 30 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius legen.

Dann saugen Sie das Fixiermittel ab und waschen Sie die Lösung für die Immunfluoreszenzmarkierung oder SIF, die dreimal für jeweils 10 Minuten auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Fügen Sie destilliertes Wasser in den Bereich um die Nische hinzu, um Feuchtigkeit bereitzustellen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Saugen Sie das SIF, das den Hydrogeltropfen umgibt, ab und fügen Sie dem Hydrogel 100 Mikroliter der vorgewärmten primären Antikörperlösung in SIF hinzu, bevor Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten inkubieren.

Dann saugen Sie die primäre Antikörperlösung ab und waschen Sie mit SIF, das dreimal für jeweils 10 Minuten auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist. Nach dem Waschen das restliche SIF aspirieren und 100 Mikroliter der vorgewärmten sekundären Antikörperlösung in SIF zum Hydrogel geben. Inkubieren Sie das Hydrogel bei 37 Grad Celsius im Dunkeln für 30 bis 60 Minuten.

Nach der Inkubation saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und waschen Sie den Hydrogeltropfen mit PBS bei 37 Grad Celsius dreimal im Dunkeln für jeweils 10 Minuten. Als nächstes saugen Sie das restliche PBS ab und inkubieren Sie das Hydrogel mit 100 Mikrolitern Kern-DNA-Färbung, der Montagemedium oder Glycerin enthält, bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Füllen Sie die Nische mit Glycerin, um ein Austrocknen zu vermeiden, bevor Sie das Mehrzweckgerät, das das Hydrogel enthält, fest schließen.

Um die Organoide durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen, stellen Sie die Mikroskopparameter gemäß den Anweisungen im Manuskript ein. Um die Organoide einzufrieren, saugen Sie die Zellkulturmedien ab, fügen Sie 200 Mikroliter der vorgewärmten Gefrierlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schließen Sie den Deckel des Geräts fest, bevor Sie es in eine Schaumstoffbox legen.

Legen Sie diese Schaumstoffbox in eine andere Schaumstoffbox und verschließen Sie beide Schaumstoffboxen fest. Bewahren Sie die Box zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius auf und lassen Sie sie dann über Nacht in einem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Um die Organoide länger als sechs Monate zu lagern, nehmen Sie das Mehrzweckgerät mit den Organoiden aus den Boxen und füllen Sie es in den Flüssigstickstofftank.

Um die Organoide aufzutauen, nehmen Sie das Mehrzweckgerät, das die Probe enthält, entweder aus dem Gefrierschrank oder dem Flüssigstickstofftank heraus und legen Sie es bei 37 Grad Celsius direkt in einen Inkubator. Nach dem Auftauen saugen Sie das Medium und die Gefrierlösungsmischung vorsichtig ab, bevor Sie frisches Medium hinzufügen und das gesamte organoide Hydrogel abbilden. In der Live-Bildgebung wurden die wachsenden Organoide im Hydrogel drei bis fünf Tage nach dem Einsetzen des Zellpellets sichtbar, insbesondere an der Peripherie der Hydrogelkuppel.

Die Zeitreihe von Bildern auf verschiedenen Ebenen eines sphäroidhaltigen Hydrogels unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop ist hier dargestellt. Konfokalmikroskopische Bilder der ganzen lebenden Organoide nach Lebendfärbung der Zellmembran und des Zellkerns zeigten eine ähnliche Markierungsdichte in der Peripherie und im Zentrum. Darüber hinaus konnte die Immunfluoreszenzmarkierung der Whole-Mount-Steroide mit einem Antikörper, zwei Antikörpern sowie drei Antikörpern erfolgreich durchgeführt werden, wodurch zusätzliche Behandlungsschritte überflüssig wurden.

Die repräsentative Analyse zeigt zwei immunfluoreszenzmarkierte Atemwegsorganoide in einem Gerät. REM-Bilder der gesamten Sphäroide im Mehrzweckgerät und 10 Bilder von geschnittenen Steroiden zeigten eine gut erhaltene 3D-Architektur von Sphäroide, zytoplasmatischen Organellen und anderen ultrastrukturellen zellulären Merkmalen, was die Wirksamkeit des beschriebenen Protokolls demonstriert. Unregelmäßigkeiten an den Grenzen der Hydrogelkuppel waren nach dem Einfrieren der Proben offensichtlich.

Die Größe und Rundheit der Sphäroide blieb jedoch ähnlich. Nach dem Auftauen der gefrorenen Proben wurde eine Zellmigration auf der Kulturoberfläche beobachtet. Die Technik ist sehr einfach.

Der Forscher sollte jedoch sehr vorsichtig sein, wenn er den Hydrogeltropfen ansaugt oder Flüssigkeiten hinzufügt, um eine Beschädigung der Probe zu verhindern. Der Forscher kann die gleiche Probe in einem einzigen Gerät mit einem High-Tech-Mikroskop betrachten und eine korrelative Studie durchführen.