Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Unser Protokoll ist bedeutsam, weil es eine Generation von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen beschreibt, und dieses Modell repräsentiert die reale Tumorbiologie besser als Zelllinien. Dieser Ansatz ist auf eine Vielzahl von soliden Tumoren anwendbar. Es ist auch kostengünstig, da es von Anfang bis Ende in einem typischen zellbiologischen Labor durchgeführt werden kann.

Die mit diesem Ansatz erstellten 3D-Tumormodelle unterstützen die Erforschung der Sensitivität und Resistenz von Tumoren gegenüber Krebstherapien oder einer Kombination von Therapien. Dieser Ansatz generiert 3D-Modelle aus primären Krebszellen. Daher könnte es identifizieren, welche Therapie für einen bestimmten Patienten wahrscheinlich wirksam ist, und so dazu beitragen, seine Behandlung zu personalisieren.

Das Verfahren wird von Ella Itzhaki, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst einen kleinen T25-Kolben mit einer einzelligen adhärenten primären Zellkultur und entfernen Sie das Zellkulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie einen Milliliter 1x Accutase für drei Minuten bei 37 Grad Celsius hinzu, um eine Einzelzellsuspension von adhärenten Primärtumorzellkulturen von 75 bis 100% Konfluenz herzustellen.

Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung durch Zugabe von fünf Millilitern Zellkulturmedium. Aspirieren Sie die Zellen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie das Zellkulturmedium, geben Sie acht Milliliter frisches Zellkulturmedium auf das Zellpellet und mischen Sie es dann vorsichtig. Um die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen, nehmen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern der Zellsuspension und mischen Sie es mit 50 Mikrolitern Trypanblau. Zählen Sie dann die lebenden Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Suspension.

Als nächstes bereiten Sie das 3D-Nährmedium vor. Nachdem Sie die Anzahl der für den Assay benötigten Zellen und das erforderliche Gesamtvolumen berechnet haben, bereiten Sie die Zellsuspension mit der gewünschten Anzahl von Zellen in 200 Mikrolitern des 3D-Kulturmediums vor. Vorsichtig mit der Pipette mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.

Übertragen Sie die Suspension in ein Pipettierreservoir und geben Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und einer Mehrkanalpipette. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Clusterbildung der Zellen zu erzwingen und dadurch die Zellaggregation zu verbessern, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach erneutem Zentrifugieren mit 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur 50 % des Mediums vorsichtig entfernen und verwerfen und 100 Mikroliter frisches 3D-Nährmedium hinzufügen, um die vorhandene Lösung zu ersetzen.

Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Platte wieder in den mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Untersuchen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage unter dem Mikroskop, um die Sphäroidbildung zu überwachen. Messen Sie den Durchmesser der gebildeten Sphäroide mit dem Skalenwerkzeug in der Bildgebungssoftware.

Und sobald der Sphäroiddurchmesser 100 bis 200 Mikrometer erreicht, führen Sie die Experimente zur Wirksamkeit des Arzneimittels durch. Verwenden Sie für die Sphäroidsammlung eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Sphäroide aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.

Fügen Sie 0,5 Milliliter des Zellkulturmediums hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, aber vorsichtig. Um eine Sphäroidzählung durchzuführen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und zeichnen Sie ein Pluszeichen auf die Unterseite eines Wells, um das Well-Loch in Quadranten zu unterteilen. Geben Sie 50 Mikroliter der Suspension in die Vertiefung.

Und mit einer 10-fachen Objektivlinse können Sie die Sphäroide manuell unter dem Mikroskop zählen. Zählen Sie die Sphäroide in jedem Quadranten und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide im Bohrloch. Berechnen Sie dann die Sphäroidkonzentration, indem Sie die Sphäroidzahl durch Zählen des Volumens verdoppeln, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide in der Suspension.

In einem neuen Röhrchen wird eine Sphäroidsuspension in einer Konzentration von 200 Sphäroiden pro 200 Mikroliter Zellkulturmedium hergestellt. Bereiten Sie für jede medikamentöse Behandlung den Vorrat an Sphäroiden in einem anderen Röhrchen vor. Berechnen Sie die Gesamtmenge, die für jedes Medikament benötigt wird, anhand der Anzahl der Vertiefungen, die für Wiederholungen benötigt werden, und geben Sie das Medikament bis zur erforderlichen Endkonzentration in das Röhrchen.

Übertragen Sie 200 Mikroliter der Sphäroidsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nachdem Sie die Sphäroide 24 bis 72 Stunden lang mit dem Studienmedikament inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig 170 Mikroliter des Zellkulturmediums, wobei 30 Mikroliter am Boden der Vertiefung verbleiben. Bereiten Sie die MTT-Lösung vor und geben Sie 70 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Vertiefung.

Die endgültige MTT-Konzentration im Bohrloch beträgt 0,05 Milligramm pro 100 Mikroliter. Bereiten Sie außerdem leere Vertiefungen mit MTT-Lösung ohne Zellen vor. Inkubieren Sie die Platte drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, bis eine Farbänderung der Lösung in den Vertiefungen beobachtet wird.

Wenn eine Veränderung beobachtet wird, geben Sie 100 Mikroliter Stop-Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig, ohne Blasen zu erzeugen. Lesen Sie die Absorption der Platte in einem Parameter-ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern und einer Hintergrundwellenlänge von 630 bis 690 Nanometern ab. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen, berechnen Sie das spezifische Signal für jede Vertiefung.

Berechnen Sie dann den Durchschnittswert der leeren Vertiefungen und subtrahieren Sie diesen Wert von jeder Vertiefung. Berechnen Sie den Durchschnitt der spezifischen Signale in den Kontrollvertiefungen, die Zellen enthalten, die nicht mit dem Studienmedikament behandelt wurden. Berechnen Sie schließlich die Lebensfähigkeit der Zellen in jeder Vertiefung im Verhältnis zu den Vertiefungen mit unbehandelten Zellen.

Die Bildung von Sphäroiden aus einer primären Kolonkarzinom-Zellkultur im Zeitverlauf anhand der Anzahl der anfänglich ausgesäten Zellen wird hier gezeigt. Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Anzahl der erzeugten Sphäroide von der Anzahl der Zellen abhängt, die ursprünglich in jeder Vertiefung ausgesät wurden. Hier sind Sphäroide aus den primären Darmkrebszellen nach 10 Tagen in Kultur mit einer anfänglichen Zellaussaat von 2.000 pro Well dargestellt.

Bei längerer Kultivierung der Darmkrebs-Sphäroide begannen sie sich aneinander zu binden und bildeten Cluster von Sphäroiden und traubenartigen Strukturen, die eine homogene Kultur verhinderten und somit die Verwendung der Sphäroide in den MTT-Assays verhinderten. Die Wirkungen von Palbociclib, Sunitinib und ihrer Kombination auf Sphäroide aus Primärtumorzellen, einschließlich Dickdarm- und Brustkrebs, werden hier gezeigt. Ein MTT-Assay wurde an Sphäroiden durchgeführt, die aus Dickdarm- und Brustkrebszellen gewonnen wurden.

Die MTT-Signale wurden auf Werte von DMSO-behandelten Zellen normalisiert. Die Werte stellen die Mittelwerte von vier bis acht Replikaten dar. Die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf das Zellwachstum wurden auch am Tag Null und nach dreitägiger Behandlung der aus Darmkrebs- und Brustkrebszellen stammenden Sphäroide mikroskopisch bewertet.

Die Auswirkungen von Trastuzumab plus Vinorelbin und 5 Fluorouracil plus Cisplatin auf Sphäroide, die im Laufe der Zeit von Brustkrebs stammen, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Veränderung des Durchmessers der Sphäroide relativ zum Tag Null durch die Dauer der Behandlung ist hier dargestellt. Jede Behandlungsgruppe umfasste vier bis sechs Vertiefungen mit einem Sphäroid in jeder Vertiefung.

Die durchschnittliche Veränderung wird hier dargestellt. Sphäroide sind wichtige Werkzeuge für viele Studien, die über das Ansprechen auf die Krebsbehandlung hinausgehen. Diese Studien befassen sich zum Beispiel mit der Verabreichung von Medikamenten und sogar mit grundlegenden biologischen Fragen wie Zell-Zell-Interaktionen.

Es ist wichtig, einen Sphäroidegenerierungsprozess mit einer Einzelzellsuspension zu starten. Es ist auch wichtig, extrem niedrige Befestigungsplatten mit einem Medium zu verwenden, das eine Grundmembranmetrik von 5 % enthält.