Name: Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Lernen Sie die Herstellung von 3D-Tumorsphäroiden aus primären Krebszellen zur Bewertung der Medikamentenempfindlichkeit. Diese Methode unterstützt personalisierte Krebstherapien und Resistenzforschung.

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Die Entnahme von menschlichen Tumorproben, die für die Primärtumorzellkulturen verwendet wurden, wurde gemäß den vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen im Rabin Medical Center mit schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten durchgeführt. Zu den Patienten, die für die Teilnahme an der Studie in Frage kamen, gehörten männliche und weibliche erwachsene und pädiatrische Krebspatienten mit nicht metastasiertem Brust-, Dickdarm-, Leber-, Lungen-, neuroendokrinen, Eierstock- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs, pädiatrischem Krebs oder metastasierendem Krebs. Das einzige Ausschlusskriterium war die mangelnde Fähigkeit zur Erteilung einer Einwilligung nach Aufklärung.
1. Erzeugung und Sammlung von Sphäroiden
HINWEIS: Die Isolierung von Primärtumorzellen kann wie von Kodak et al.8 beschrieben durchgeführt werden. Wichtig ist, dass Primärtumorzellen, die zur Erzeugung der Sphäroide verwendet werden, direkt aus Patientenproben gewonnen werden können, die durch Biopsie, Resektion usw. gewonnen wurden, oder indirekt unter Verwendung von Tumorproben aus patienteneigenen Xenotransplantatmodellen (PDX), wie von Moskovits et al.9 beschrieben.
<ol><li>Bereiten Sie eine Einzelzellsuspension von adhärenten Primärtumorzellkulturen mit 75%-100% Konfluenz vor, indem Sie einen kleinen Kolben (T25) mit einer einzellig adhärenten primären Zellkultur nehmen, das Zellkulturmedium entfernen, mit PBS waschen und dann 1 ml 1x Accutase (eine Zellablösungslösung) (siehe Materialtabelle) für 3 min bei 37 °C hinzufügen.</li>
	<li>Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung durch Zugabe von 5 ml Zellkulturmedium (RPMI-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10 % FBS, 1:100 Penicillin-Streptomycin, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin; siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Aspirieren Sie die Zellen mit einer serologischen 10-ml-Pipette und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie das Zellkulturmedium, geben Sie 5 ml frisches Zellkulturmedium auf das Zellpellet und mischen Sie es vorsichtig.</li>
	<li>Zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer10. Nehmen Sie dazu ein Aliquot von 50 μl der Zellsuspension und mischen Sie es mit 50 μl Trypanblau. Zählen Sie die lebenden Zellen (die Zellen, die für die blaue Farbe negativ sind) und berechnen Sie die Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Suspension.</li>
	<li>Bereiten Sie ein "3D-Nährmedium" vor (ein Zellkulturmedium, das mit 5% Basalmembranmatrix ergänzt wird; siehe Materialtabelle). HINWEIS: Das "3D-Nährmedium" ist bei Raumtemperatur flüssigkeitsähnlich. Bei 37 °C wird die Konsistenz gelartiger (so dass die Zellen zusammenbleiben), obwohl es immer noch pipettiert werden kann (da es nur 5% Basalmembranmatrix enthält).</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für den Assay benötigt werden, und das erforderliche Gesamtvolumen. Jede Vertiefung muss 2.000-8.000 Zellen in 200 μl Medium enthalten.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Zellsuspension mit der gewünschten Anzahl von Zellen (z. B. 4.000 Zellen) in 200 μl des "3D-Nährmediums" vor und mischen Sie sie vorsichtig mit der Pipette, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.</li>
	<li>Übertragen Sie die Suspension in ein Pipettierreservoir. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz (siehe Materialtabelle). Mischen Sie die Suspension vor jeder Sammlung der Zellen gut.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Clusterbildung der Zellen zu erzwingen und dadurch die Zellaggregation zu verbessern, und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.</li>
	<li>Aktualisieren Sie alle 2-3 Tage das "3D-Nährmedium". Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min bei Raumtemperatur, entfernen und entsorgen Sie vorsichtig 50% des Mediums (100 μl) und fügen Sie 100 μl frisches "3D-Nährmedium" hinzu, um die vorhandene Lösung zu ersetzen. Wiederholen Sie Schritt 1.11 und legen Sie die Platte wieder in den befeuchteten Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C und 5 % CO2. HINWEIS: Die Entfernung des Mediums muss durchgeführt werden, wenn die Platte in einem Winkel von 45° gehalten wird, und das Medium darf nur aus dem oberen Teil gesammelt werden, um ein Ansammeln der Zellen zu vermeiden. Ein Vakuum-Saugsystem sollte nicht verwendet werden. Das frische Medium muss langsam und vorsichtig zugegeben werden, um die Sphäroide, die sich bereits gebildet haben, nicht zu stören.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Zellen alle 1-2 Tage unter einem Mikroskop, um die Sphäroidbildung zu überwachen. Messen Sie den Durchmesser der gebildeten Sphäroide mit dem Werkzeug "Skalieren" in der Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle). ANMERKUNG: Die mikroskopische Untersuchung sollte zunächst unregelmäßige runde bis ovale Körper aufdecken, die im Laufe der Zeit eine Sphäroidform annehmen11,12.<ol><li>Wenn der Sphäroiddurchmesser 100-200 μm erreicht, führen Sie die Experimente zur Wirksamkeit des Arzneimittels durch. HINWEIS: Die Experimente zur Wirksamkeit des Arzneimittels werden durchgeführt, wenn die Sphäroide diesen Durchmesser erreichen, da sich zu diesem Zeitpunkt die Mehrheit der Zellen vermehrt, was für die Bewertung des Ansprechens auf die Behandlung förderlich ist. Sphäroide mit größerem Durchmesser enthalten einen nekrotischen Kern und eine ruhende Schicht11,12, was zu einem geringeren Anteil proliferierender Zellen führt, die auf die Behandlung ansprechen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwenden Sie für die Sphäroidsammlung eine 1.000-μl-Pipette, um die Sphäroide aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen. HINWEIS: Sphäroide sind von Natur aus zerbrechlich und erfordern eine schonende Handhabung. Wenn Sie das Medium mit den Sphäroiden in das konische Röhrchen übertragen, halten Sie das Röhrchen in einem Winkel von 45° und pipettieren Sie langsam an der Wand des Röhrchens. Sphäroide sind für das Auge sichtbar.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie 0,5 ml des Zellkulturmediums hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, aber vorsichtig. Vermeiden Sie es, Blasen zu machen.</li>
	<li>Führen Sie die Sphäroidzählung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Verwenden Sie eine 96-Well-Platte und zeichnen Sie ein Pluszeichen auf die Unterseite eines Wells, um das Well in Quadranten zu unterteilen (um die Zählung zu verfolgen).</li>
		<li>Geben Sie 50 μl der Suspension in die Vertiefung und zählen Sie die Sphäroide manuell unter dem Mikroskop (mit einer 10-fachen Objektivlinse).</li>
		<li>Zählen Sie die Sphäroide in jedem Quadranten, achten Sie darauf, nicht doppelt zu zählen, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide im Bohrloch. HINWEIS: Um die Genauigkeit der Zählung zu gewährleisten, zählen Sie mindestens 50 Sphäroide in einer Vertiefung. Wenn weniger als 50 Sphäroide vorhanden sind, mischen Sie die Suspension vorsichtig, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten, und zählen Sie erneut, indem Sie ein größeres Volumen der Suspension verwenden, das in eine neue Vertiefung gegeben wird. Wenn sich weniger als 50 Sphäroide in einer Vertiefung befinden, können die Sphäroide alternativ in einem Volumen von <0,5 ml zentrifugiert und schonend resuspendiert werden. Wenn mehr als 100 Sphäroide vorhanden sind, fügen Sie der Sphäroidsuspension Zellkulturmedium hinzu, mischen Sie vorsichtig und zählen Sie nach.</li>
		<li>Berechnen Sie die Sphäroidkonzentration (Sphäroidzahl/Zählvolumen [μl]) und dann die Gesamtzahl der Sphäroide in der Suspension (Sphäroidkonzentration × Gesamtvolumen).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Arzneimittelwirksamkeitstest (MTT-Assay)
ANMERKUNG: Einzelheiten finden Sie in van Meerloo et al.13. Außerdem muss für den MTT-Assay nur das Zellkulturmedium und nicht das "3D-Nährmedium" verwendet werden (die Zugabe der Basalmembranmatrix ist nicht erforderlich und könnte möglicherweise den MTT-Assay stören).
<ol><li>In einem neuen Röhrchen wird eine Sphäroidsuspension in einer Konzentration von 200 Sphäroiden pro 200 μl Zellkulturmedium hergestellt (RPMI-1640-Nährmedium, ergänzt mit 10% FBS, 1:100 Penicillin-Streptomycin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% L-Glutamin).<ol><li>Bereiten Sie für jede medikamentöse Behandlung einen Vorrat an Sphäroiden in einem 15-ml-Röhrchen vor. Berechnen Sie die Menge, die für jedes Medikament benötigt wird, anhand der Anzahl der Vertiefungen, die für Wiederholungen benötigt werden: (5-8) × 200 μl. Geben Sie das Medikament bis zur erforderlichen Endkonzentration in das Röhrchen. HINWEIS: Bitte beachten Sie den Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse bezüglich der für die vorliegende Studie verwendeten Medikamente und deren Dosierung. Auch die kommerziellen Details der Medikamente sind in der Materialtabelle aufgeführt.</li>
	</ol></li>
	<li>200 μl der Sphäroidsuspension werden in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz gegeben und die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 -Gehalt inkubiert. Verwenden Sie nicht die äußeren Reihen und Spalten der 96-Well-Platte für den Assay, da diese Wells durch eine erhöhte Verdunstung gekennzeichnet sind, was zu einer erhöhten Variabilität zwischen den Wiederholungsexperimenten führen könnte. Fügen Sie stattdessen PBS zu diesen Vertiefungen hinzu. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Kultur der Sphäroide homogen ist, bevor die Kultur in die 96-Well-Platte aliquotiert wird. Außerdem muss eine Kontrollbedingung (d.h. unbehandelte Sphäroide) in jedes Experiment einbezogen werden.</li>
	<li>Nachdem die Sphäroide 24-72 h lang mit dem Studienmedikament inkubiert wurden, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig 170 μl des Zellkulturmediums, wobei 30 μl (einschließlich der Sphäroide) am Boden der Vertiefung verbleiben. HINWEIS: Die Entfernung der 170 μl Zellkulturmedium muss sorgfältig erfolgen, um die Sphäroide nicht zu entfernen. Halten Sie die Platte in einem Winkel von 45° und legen Sie eine Hand (mit einem dunklen Handschuh als Kontrast) unter die Vertiefungen, so dass die Sphäroide sichtbar sind (weiße Punkte).</li>
	<li>Bereiten Sie die MTT-Lösung vor (0,714 mg/ml in phenolfreiem RPMI, siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie 70 μl MTT-Lösung in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 100 μl pro Vertiefung (die endgültige MTT-Konzentration in der Vertiefung beträgt 0,05 mg pro 100 μl). Bereiten Sie außerdem "Blank" -Vertiefungen mit MTT-Lösung ohne Zellen vor. HINWEIS: MTT ist lichtempfindlich. Daher muss das Licht in der Haube ausgeschaltet und die Röhre mit der MTT-Lösung mit Aluminiumfolie abgedeckt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 für 3-4 Stunden, bis eine Farbänderung der Lösung in den Vertiefungen beobachtet wird (violette Farbe steht für lebende Zellen).</li>
	<li>Wenn eine Veränderung beobachtet wird, geben Sie 100 μl Stopplösung (0,1 N HCl in Isopropanol) in jede Vertiefung und mischen Sie den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig, ohne Blasen zu bilden.</li>
	<li>Lesen Sie die Absorption der Platte in einem Fluorometer-ELISA-Lesegerät (siehe Materialtabelle) bei einer Wellenlänge von 570 nm und einer Hintergrundwellenlänge von 630-690 nM ab. HINWEIS: Wenn das verfügbare Fluorometer-ELISA-Lesegerät die 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz nicht lesen kann, übertragen Sie den Inhalt jeder Vertiefung auf eine entsprechende 96-Well-Platte mit flachem Boden.</li>
	<li>Berechnen Sie die Lebensfähigkeit der Zelle, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.<ol><li>Berechnen Sie für jede Vertiefung das "spezifische Signal" ("spezifisches Signal" = das Signal bei 570 nm - das Signal bei 630-690 nm). Berechnen Sie dann den Durchschnittswert der "leeren" Bohrlöcher und subtrahieren Sie diesen Wert von jedem Bohrloch.</li>
		<li>Berechnen Sie den Durchschnitt der "spezifischen Signale" in den Kontrollvertiefungen, die Zellen enthalten, die nicht mit dem Studienmedikament ("AV-SS-unt") behandelt wurden.</li>
		<li>Berechnen Sie die Lebensfähigkeit (Prozentsatz) der Zellen in jeder Vertiefung im Verhältnis zu den Vertiefungen mit unbehandelten Zellen. HINWEIS: Viabilität = (spezifisches Signal in jedem Well/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. Überwachung und Analyse der morphologischen Veränderungen der Sphäroide
HINWEIS: Wie beim MTT-Assay sollte bei dieser Bewertung nur das Zellkulturmedium und nicht das "3D-Kulturmedium" verwendet werden (das Hinzufügen der Basalmembranmatrix ist nicht erforderlich und könnte die Analyse möglicherweise beeinträchtigen).
<ol><li>Nach dem Zählen der Sphäroide wird die Suspension in Zellkulturmedium (RPMI-1640-Kulturmedium, ergänzt mit 10% FBS, 1:100 Penicillin-Streptomycin, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren und 1% L-Glutamin) auf etwa 1-2 Sphäroide pro 20 μl verdünnt.</li>
	<li>Geben Sie 80 μl Zellkulturmedium in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und geben Sie dann 20 μl der Sphäroidsuspension in die Vertiefungen. HINWEIS: Die Vertiefungen enthalten daher 1-2 Sphäroide in einem Volumen von 100 μl.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Vertiefungen sorgfältig unter dem Mikroskop und markieren Sie die Vertiefungen, die ein Sphäroid enthalten, da sie für diese Analyse verwendet werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Studienmedikament in einer Konzentration vor, die doppelt so hoch ist wie die interessierende Konzentration. Geben Sie 100 μl der Wirkstofflösung in die entsprechenden Vertiefungen (die Gesamtkonzentration in der Vertiefung beträgt dann 1x).</li>
	<li>Nehmen Sie an Tag 0 (vor der Zugabe des Studienmedikaments) ein Bild von jeder Vertiefung auf und verwenden Sie das Werkzeug "Skalierung" in der Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle), um die Durchmesser der Sphäroide zu bestimmen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 und untersuchen Sie die Morphologie und messen Sie den Durchmesser der Sphäroide (mit dem Werkzeug "Waage") täglich für 3-7 Tage, je nachdem, wann die Arzneimittelwirkung beobachtet wird (z. B. Zellverbreitung, invasive Schoten, Strukturzerstörung usw.).</li>
	<li>Zeichnen Sie am Ende des Experiments die Änderungen der Sphäroiddurchmesser (relativ zu Tag 0) im Laufe der Zeit auf. HINWEIS: Änderung (Prozentsatz) = (Sphäroiddurchmesser an einem bestimmten Tag/Durchmesser dieses Sphäroids an Tag 0) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
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<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von 3D-Primärzellkulturen (Sphäroiden), die aus menschlichen Tumorproben gewonnen werden. Diese Sphäroide können für verschiedene Analysen verwendet werden, einschließlich der Bewertung potenzieller Wirkstoffkandidaten und Wirkstoffkombinationen, der Identifizierung potenzieller Biomarker oder therapeutischer Ziele und der Untersuchung der Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz. Das Protokoll verwendet entweder Primärtumorzellen, die direkt...

In-vitro- und In-vivo-Studien stellen komplementäre Ansätze für die Entwicklung von Krebstherapien dar. In-vitro-Modelle ermöglichen die Kontrolle der meisten experimentellen Variablen und erleichtern quantitative Analysen. Sie dienen oft als kostengünstige Screening-Plattformen und können auch für mechanistische Studien verwendet werden1. Ihre biologische Relevanz ist jedoch von Natur aus begrenzt, da solche Modelle die Mikroumgebung des Tumors nur teilweise widerspiegeln1. Im Gegensatz dazu erfassen In-vivo-Modelle, wie z. B. patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die Komplexität der Tumormikroumgebung und eignen sich besser für translationale Studien und die Individualisierung der Behandlung von Patienten (d. h. die Untersuchung des Ansprechens auf Medikamente in einem Modell, das von einem einzelnen Patienten abgeleitet wurde)1. In-vivo-Modelle sind jedoch nicht förderlich für Hochdurchsatz-Ansätze für das Wirkstoff-Screening, da die experimentellen Parameter nicht so streng kontrolliert werden können wie In-vitro-Modelle und weil ihre Entwicklung zeitaufwändig, arbeitsintensiv und kostspielig ist 1,2.
In-vitro-Modelle sind seit über 100 Jahren verfügbar, und Zelllinien sind seit über 70 Jahren verfügbar3. In den letzten Jahrzehnten hat die Komplexität der verfügbaren In-vitro-Modelle solider Tumoren jedoch dramatisch zugenommen. Diese Komplexität reicht von 2-dimensionalen (2D) Kulturmodellen (Monolayer-Strukturen), bei denen es sich entweder um etablierte Tumorzelllinien oder um primäre Zelllinien handelt, bis hin zu neueren Ansätzen mit 3-dimensionalen (3D) Modellen1. Innerhalb der 2D-Modelle besteht eine wesentliche Unterscheidung zwischen der etablierten und der primären Zelllinie4. Etablierte Zelllinien werden immortalisiert; Daher kann dieselbe Zelllinie über viele Jahre hinweg global verwendet werden, was aus historischer Sicht die Zusammenarbeit, die Anhäufung von Daten und die Entwicklung vieler Behandlungsstrategien erleichtert. Genetische Aberrationen in diesen Zelllinien häufen sich jedoch mit jeder Passage an und beeinträchtigen so ihre biologische Relevanz. Darüber hinaus spiegelt die begrenzte Anzahl verfügbarer Zelllinien nicht die Heterogenität der Tumoren bei Patientenwider 4,5. Primäre Krebszelllinien werden direkt aus resezierten Tumorproben gewonnen, die durch Biopsien, Pleuraergüsse oder Resektionen gewonnen wurden. Daher sind primäre Krebszelllinien biologisch relevanter, da sie Elemente der Tumormikroumgebung und Tumoreigenschaften bewahren, wie z. B. interzelluläres Verhalten (z. B. Cross-Talk zwischen gesunden und krebsartigen Zellen) und die stammähnlichen Phänotypen von Krebszellen. Die Replikationskapazität der primären Zelllinien ist jedoch begrenzt, was zu einer engen Kulturzeit führt und die Anzahl der Tumorzellen begrenzt, die für Analysen verwendet werden können 4,5.
Modelle, die 3D-Kulturen verwenden, sind biologisch relevanter als 2D-Kulturmodelle, da die In-vivo-Bedingungen beibehalten werden. So bewahren 3D-Kulturmodelle die natürliche Zellform und das Zellwachstum und replizieren Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion. Zu den am häufigsten verwendeten 3D-Modellen in der Krebsforschung gehören mehrzellige Sphäroide, gerüstbasierte Strukturen und matrixeingebettete Kulturen 4,6,7.
Das vorliegende Protokoll generiert 3D-Tumorkulturmodelle (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und bewertet deren Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse stammen von Brust- und Darmkrebs; Dieses Protokoll ist jedoch auf andere solide Tumorarten (z. B. Cholangiokarzinom, Magen-, Lungen- und Bauchspeicheldrüsenkrebs) anwendbar und auch kostengünstig, da es in seiner Gesamtheit in einem typischen Krebsforschungs-/Zellbiologielabor durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Die mit diesem Ansatz erzeugten multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.
Dieses Protokoll gliedert sich in drei Abschnitte: (1) die Erzeugung, Sammlung und Zählung der Sphäroide in Vorbereitung auf ihre Verwendung als Modell für die Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln; (2) MTT-Assay zur Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit auf die Sphäroide; und (3) die mikroskopische Bewertung morphologischer Veränderungen nach der Behandlung der Sphäroide mit Medikamenten als weiterer Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracil</td><td>TEVA Israel</td><td>Los 16c22NA</td><td>Fluorouracil, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Zelldissoziation</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>TEVA Israel</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&nbsp;</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02</td><td>Basalmembranmatrix, Typ 3</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometer&nbsp; ELISA-Reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>für Stopplösung</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td><td>&nbsp; Version 1.52a</td><td>Open-Source-Software ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>für Stopplösung</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>1843977</td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)*ohne Calcium- und</td></tr><tr><td>Magnesium-Penicillin&ndash; Streptomycin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Phenolfrei RPMI 1640</td><td>Biologische Industrie, Israel</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Pipping-Reservoir</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Nährmedium</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Trypanblau 0,5% Lösung</td><td>Biologische Industrie, Israel</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte mit extrem niedrigem Anbau</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Bauchnabel</td></tr></tbody></table>

etablierung von 3-dimensionalen sphäroiden aus patienteneigenen tumorproben und bewertung ihrer empfindlichkeit gegenüber medikamenten

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Trotz bemerkenswerter Fortschritte im Verständnis der Tumorbiologie scheitert die überwiegende Mehrheit der onkologischen Arzneimittelkandidaten, die in klinische Studien eintreten, oft aufgrund mangelnder klinischer Wirksamkeit. Diese hohe Ausfallrate verdeutlicht die Unfähigkeit der aktuellen präklinischen Modelle, die klinische Wirksamkeit vorherzusagen, hauptsächlich aufgrund ihrer Unzulänglichkeit bei der Reflexion der Tumorheterogenität und der Tumormikroumgebung. Diese Einschränkungen können mit 3-dimensionalen (3D) Kulturmodellen (Sphäroiden) behoben werden, die aus menschlichen Tumorproben von einzelnen Patienten erstellt wurden. Diese 3D-Kulturen repräsentieren die reale Biologie besser als etablierte Zelllinien, die keine Tumorheterogenität widerspiegeln. Darüber hinaus sind 3D-Kulturen besser als 2-dimensionale (2D) Kulturmodelle (Monolayer-Strukturen), da sie Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion nachbilden und die natürliche Zellform und das Wachstum erhalten. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode zur Herstellung von Primärkulturen von Krebszellen von einzelnen Patienten entwickelt, die 3D sind und in mehrzelligen Sphäroiden wachsen. Die Zellen können direkt aus Patiententumoren oder von Patienten stammenden Xenotransplantaten gewonnen werden. Die Methode ist bei soliden Tumoren (z. B. Dickdarm, Brust und Lunge) weit verbreitet und auch kostengünstig, da sie in ihrer Gesamtheit in einem typischen Labor für Krebsforschung/Zellbiologie durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Hier wird ein Protokoll zur Generierung von 3D-Tumorkulturmodellen (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und zur Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen vorgestellt: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Diese multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.

In diesem Protokoll werden Verfahren zur Erzeugung einer homogenen Kultur von Sphäroiden aus Primärtumorzellen, zur quantitativen Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln auf die Sphäroidkultur (MTT-Assay) und zur Bestimmung der Wirkung von Studienmedikamenten auf die Sphäroidmorphologie vorgestellt. Es werden Daten aus den repräsentativen Experimenten mit Sphäroiden vorgestellt, die aus Dickdarm- und Brustkrebszellkulturen generiert wurden. Ähnliche Experimente wurden mit anderen Tumorarten durchgeführt, darunter Cho...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Unser Protokoll ist bedeutsam, weil es eine Generation von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen beschreibt, und dieses Modell repräsentiert die reale Tumorbiologie besser als Zelllinien. Dieser Ansatz ist auf eine Vielzahl von soliden Tumoren anwendbar. Es ist auch kostengünstig, da es von Anfang bis Ende in einem typischen zellbiologischen Labor durchgeführt werden kann.Die mit diesem Ansatz erstellten 3D-Tumormodelle unterstützen die Erforschung der Sensitivität und Resistenz von Tumoren gegenüber Krebstherapien oder einer Kombination von Therapien. Dieser Ansatz generiert 3D-Modelle aus primären Krebszellen. Daher könnte es identifizieren, welche Therapie für einen bestimmten Patienten wahrscheinlich wirksam ist, und so dazu beitragen, seine Behandlung zu personalisieren.Das Verfahren wird von Ella Itzhaki, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst einen kleinen T25-Kolben mit einer einzelligen adhärenten primären Zellkultur und entfernen Sie das Zellkulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie einen Milliliter 1x Accutase für drei Minuten bei 37 Grad Celsius hinzu, um eine Einzelzellsuspension von adhärenten Primärtumorzellkulturen von 75 bis 100% Konfluenz herzustellen.Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung durch Zugabe von fünf Millilitern Zellkulturmedium. Aspirieren Sie die Zellen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie das Zellkulturmedium, geben Sie acht Milliliter frisches Zellkulturmedium auf das Zellpellet und mischen Sie es dann vorsichtig. Um die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen, nehmen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern der Zellsuspension und mischen Sie es mit 50 Mikrolitern Trypanblau. Zählen Sie dann die lebenden Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Suspension.Als nächstes bereiten Sie das 3D-Nährmedium vor. Nachdem Sie die Anzahl der für den Assay benötigten Zellen und das erforderliche Gesamtvolumen berechnet haben, bereiten Sie die Zellsuspension mit der gewünschten Anzahl von Zellen in 200 Mikrolitern des 3D-Kulturmediums vor. Vorsichtig mit der Pipette mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.Übertragen Sie die Suspension in ein Pipettierreservoir und geben Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und einer Mehrkanalpipette. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Clusterbildung der Zellen zu erzwingen und dadurch die Zellaggregation zu verbessern, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach erneutem Zentrifugieren mit 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur 50 % des Mediums vorsichtig entfernen und verwerfen und 100 Mikroliter frisches 3D-Nährmedium hinzufügen, um die vorhandene Lösung zu ersetzen.Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Platte wieder in den mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Untersuchen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage unter dem Mikroskop, um die Sphäroidbildung zu überwachen. Messen Sie den Durchmesser der gebildeten Sphäroide mit dem Skalenwerkzeug in der Bildgebungssoftware.Und sobald der Sphäroiddurchmesser 100 bis 200 Mikrometer erreicht, führen Sie die Experimente zur Wirksamkeit des Arzneimittels durch. Verwenden Sie für die Sphäroidsammlung eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Sphäroide aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.Fügen Sie 0,5 Milliliter des Zellkulturmediums hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, aber vorsichtig. Um eine Sphäroidzählung durchzuführen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und zeichnen Sie ein Pluszeichen auf die Unterseite eines Wells, um das Well-Loch in Quadranten zu unterteilen. Geben Sie 50 Mikroliter der Suspension in die Vertiefung.Und mit einer 10-fachen Objektivlinse können Sie die Sphäroide manuell unter dem Mikroskop zählen. Zählen Sie die Sphäroide in jedem Quadranten und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide im Bohrloch. Berechnen Sie dann die Sphäroidkonzentration, indem Sie die Sphäroidzahl durch Zählen des Volumens verdoppeln, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide in der Suspension.In einem neuen Röhrchen wird eine Sphäroidsuspension in einer Konzentration von 200 Sphäroiden pro 200 Mikroliter Zellkulturmedium hergestellt. Bereiten Sie für jede medikamentöse Behandlung den Vorrat an Sphäroiden in einem anderen Röhrchen vor. Berechnen Sie die Gesamtmenge, die für jedes Medikament benötigt wird, anhand der Anzahl der Vertiefungen, die für Wiederholungen benötigt werden, und geben Sie das Medikament bis zur erforderlichen Endkonzentration in das Röhrchen.Übertragen Sie 200 Mikroliter der Sphäroidsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nachdem Sie die Sphäroide 24 bis 72 Stunden lang mit dem Studienmedikament inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig 170 Mikroliter des Zellkulturmediums, wobei 30 Mikroliter am Boden der Vertiefung verbleiben. Bereiten Sie die MTT-Lösung vor und geben Sie 70 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Vertiefung.Die endgültige MTT-Konzentration im Bohrloch beträgt 0,05 Milligramm pro 100 Mikroliter. Bereiten Sie außerdem leere Vertiefungen mit MTT-Lösung ohne Zellen vor. Inkubieren Sie die Platte drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, bis eine Farbänderung der Lösung in den Vertiefungen beobachtet wird.Wenn eine Veränderung beobachtet wird, geben Sie 100 Mikroliter Stop-Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig, ohne Blasen zu erzeugen. Lesen Sie die Absorption der Platte in einem Parameter-ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern und einer Hintergrundwellenlänge von 630 bis 690 Nanometern ab. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen, berechnen Sie das spezifische Signal für jede Vertiefung.Berechnen Sie dann den Durchschnittswert der leeren Vertiefungen und subtrahieren Sie diesen Wert von jeder Vertiefung. Berechnen Sie den Durchschnitt der spezifischen Signale in den Kontrollvertiefungen, die Zellen enthalten, die nicht mit dem Studienmedikament behandelt wurden. Berechnen Sie schließlich die Lebensfähigkeit der Zellen in jeder Vertiefung im Verhältnis zu den Vertiefungen mit unbehandelten Zellen.Die Bildung von Sphäroiden aus einer primären Kolonkarzinom-Zellkultur im Zeitverlauf anhand der Anzahl der anfänglich ausgesäten Zellen wird hier gezeigt. Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Anzahl der erzeugten Sphäroide von der Anzahl der Zellen abhängt, die ursprünglich in jeder Vertiefung ausgesät wurden. Hier sind Sphäroide aus den primären Darmkrebszellen nach 10 Tagen in Kultur mit einer anfänglichen Zellaussaat von 2.000 pro Well dargestellt.Bei längerer Kultivierung der Darmkrebs-Sphäroide begannen sie sich aneinander zu binden und bildeten Cluster von Sphäroiden und traubenartigen Strukturen, die eine homogene Kultur verhinderten und somit die Verwendung der Sphäroide in den MTT-Assays verhinderten. Die Wirkungen von Palbociclib, Sunitinib und ihrer Kombination auf Sphäroide aus Primärtumorzellen, einschließlich Dickdarm- und Brustkrebs, werden hier gezeigt. Ein MTT-Assay wurde an Sphäroiden durchgeführt, die aus Dickdarm- und Brustkrebszellen gewonnen wurden.Die MTT-Signale wurden auf Werte von DMSO-behandelten Zellen normalisiert. Die Werte stellen die Mittelwerte von vier bis acht Replikaten dar. Die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf das Zellwachstum wurden auch am Tag Null und nach dreitägiger Behandlung der aus Darmkrebs- und Brustkrebszellen stammenden Sphäroide mikroskopisch bewertet.Die Auswirkungen von Trastuzumab plus Vinorelbin und 5 Fluorouracil plus Cisplatin auf Sphäroide, die im Laufe der Zeit von Brustkrebs stammen, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Veränderung des Durchmessers der Sphäroide relativ zum Tag Null durch die Dauer der Behandlung ist hier dargestellt. Jede Behandlungsgruppe umfasste vier bis sechs Vertiefungen mit einem Sphäroid in jeder Vertiefung.Die durchschnittliche Veränderung wird hier dargestellt. Sphäroide sind wichtige Werkzeuge für viele Studien, die über das Ansprechen auf die Krebsbehandlung hinausgehen. Diese Studien befassen sich zum Beispiel mit der Verabreichung von Medikamenten und sogar mit grundlegenden biologischen Fragen wie Zell-Zell-Interaktionen.Es ist wichtig, einen Sphäroidegenerierungsprozess mit einer Einzelzellsuspension zu starten. Es ist auch wichtig, extrem niedrige Befestigungsplatten mit einem Medium zu verwenden, das eine Grundmembranmetrik von 5 % enthält.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

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Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

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Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

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Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten (Video) | JoVE Journal

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

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