Subzelluläre Fraktionierung zur Isolierung synaptischer Komponenten aus dem murinen Gehirn

Synapsen sind die grundlegenden Recheneinheiten des Gehirns. Die vorgestellte Methode ist ein einfaches und wertvolles Werkzeug, um die Synapsen und ihre molekularen Prozesse zu untersuchen und auch zu verstehen, wie sie bei verschiedenen Hirnerkrankungen verändert werden können. Diese Technik beinhaltet eine Fraktionierung von Synaptosomenstrukturen, die aus dem Gehirn isoliert wurden.

Dies ermöglicht es dem Forscher, Effekte zu erfassen, die an der Synapse unterteilt sein können. Die Verteilungsniveaus und die Aktivität bestimmter Proteine können auch mit subsynaptischer Auflösung analysiert werden. Dieses Verfahren dauert etwa 11 Stunden, bis ein einzelner Forscher abgeschlossen ist, wenn alles reibungslos verläuft.

Eine Person, die diese Technik noch nie durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten mit der Länge dieses Verfahrens haben, da es für jemanden, der mit den Schritten nicht vertraut ist, natürlich etwas länger dauern wird. Aufgrund der Länge dieses experimentellen Tages empfehlen wir dringend, die Dissektionen mit einem Partner durchzuführen, der Ihnen helfen kann, eine schnelle Gewebeentnahme zu ermöglichen, um sicherzustellen, dass keine Proben länger als nötig auf Eis gelegt werden. Wir empfehlen auch, Puffer und Tischmaterialien am Tag vor der Durchführung dieses Experiments vorzubereiten, damit bei Bedarf alles leicht erreichbar ist.

Dies gilt insbesondere für die Sammelrohre. Bis zum Ende dieses Verfahrens werden mehrere Aliquots von insgesamt 11 subzellulären Fraktionen gesammelt. Wenn Sie diese Röhrchen im Voraus deutlich beschriften, wird dies Ihren Tag viel einfacher machen.

Um zu beginnen, führen Sie eine feine Schere unter die Haut bei der Enthauptung in eine perikraniale Tiefe ein und machen Sie einen mittleren sagittalen Schnitt bis zur intranasalen Naht, um die Kopfhaut vom Schädel zurückzuziehen. Arbeiten Sie vom Hinterhauptsbereich zu jedem temporalen Aspekt, trimmen Sie die Faszie und den Muskel, um die äußere Oberfläche des Schädels jenseits jedes äußeren akustischen Meatus freizulegen. Sichern Sie die Kopfhaut und den rostralen Aspekt des Schädels mit der nicht dominanten Hand und führen Sie mit der anderen Hand eine feine Schere zwei Millimeter in die kaudale Seite des Foramen magnum ein, wo das Rückenmark sichtbar austritt.

Machen Sie einen Mittellinienschnitt, bis die Schere die innere Oberfläche des intraparietalen Knochens erreicht. Ändern Sie den Winkel der Schere so, dass die Klingen parallel zur dorsalen Oberfläche des Schädels verlaufen. Fahren Sie den midsagittalen Schnitt rostral durch die Parietal- und Stirnknochen fort, wobei Sie die sagittalen und interfrontalen Nähte als Leitfaden verwenden und den Schnitt knapp hinter der Internasalnaht beenden.

Als nächstes machen Sie einen drei Millimeter senkrechten Schnitt zum Nasenbein, rostral zur Internasalnaht, indem Sie die Schere senkrecht zum Schädel platzieren, wobei jede Klinge an einer nasalen Prämaxillarnaht positioniert ist und eine gleichmäßig geschnitten wird. Während Sie den rostralen Aspekt sichern, verwenden Sie eine Seite einer texturierten Pinzette, um den Schädel vorsichtig vom Gehirn nach oben zu heben und ihn dann seitlich und ventral anzuheben. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf entlang der Mittellinie, dann für die andere Hemisphäre, bis die gesamte Gehirnoberfläche freigelegt ist.

Mit einer gebogenen Pinzette oder einem feinen Spatel heben Sie die rostrale Seite des Gehirns sanft an. Schneiden Sie die Seh- und Hirnnerven ab, um die Entfernung aus dem Schädel abzuschließen. Homogenisieren Sie das Gehirn mit einem Glas-Downs-Homogenisator, der in 12 Aufwärtsdurchgängen bei 500 U/min auf einem Eisbad platziert wird.

Bei jedem Abwärtsschlag kurz pausieren, um eine gründliche Homogenisierung des Gewebes zu gewährleisten. Übertragen Sie das gesamte Gehirnhomogenat in ein 14-Milliliter-Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden und drehen Sie es bei 800 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um den Überstand namens S1 zu erhalten.S1 in ein neues Zentrifugenröhrchen überführen, das Pellet entsorgen. Nehmen Sie zwei Fünf-Mikroliter-Aliquots von S1 für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 100-Mikroliter-Aliquots von S1 für den Western Blot.

Drehen Sie S1 bei 9.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um den synaptischen somalen Überstand oder S2 und das rohe Synaptosomenpellet oder P2 zu erhalten. Nehmen Sie zwei 10 Mikroliter Aliquots S2 für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 500 Mikroliter Aliquots S2 für den Western Blot. Verwerfen Sie den Überstand, nachdem Sie die Aliquots erhalten haben. Nach dem Zentrifugieren bei 9.000 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius erhalten Sie den Überstand S2' und das gewaschene Synaptosom, P2'Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie P2' in drei Milliliter Puffer A.Vermeiden Sie es, den dunkelroten Teil am Boden des Pellets, der hauptsächlich Mitochondrien enthält, zu resuspendieren.

Nehmen Sie zwei 20-Mikroliter-Aliquots von P2' für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 100-Mikroliter-Aliquots von P2' für den Western Blot. Für die hypotonische Lyse des gewaschenen Synaptosoms fügen Sie neun Volumen des gekühlten Puffers B hinzu, um P2' zu resuspendieren und das Synaptosom in einem Glasdaunenhomogenisator zu homogenisieren. Die Proben werden in 50 Milliliter verschlossene konische Zentrifugenröhrchen überführt und 15 Minuten lang auf einem Rohrrevolver in einem vier Grad Celsius kalten Raum gedreht.

Zentrifugieren Sie das lysierte P2' bei 25.000 G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, um den Lyseüberstand oder LS1 und das Lysepellet mit synaptosomalen Membranen oder LP1 zu erhalten. Nehmen Sie zwei 50 Mikroliter Aliquots LS1 für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 400 Mikroliter Aliquots LS1 für den Western Blot. LS1 wird zur Ultrazentrifugation in ein verschlossenes Zentrifugenröhrchen überführt.

Zentrifuge LS1 in einem Ultrazentrifugenrotor mit festem Winkel bei 100.000 G für 60 Minuten bei vier Grad Celsius, um synaptischen Zytosolüberstand (LS2) und synaptische Vesikelpellets oder LP2 zu erhalten. Suspendieren Sie LP2 in 500 Mikrolitern Puffer A und verwenden Sie eine 23-Gauge-Nadel und eine Ein-Milliliter-Spritze Sheer LP two mit sanfter Verreibung. Nehmen Sie zwei 10 Mikroliter Aliquots LP2 für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 250 Mikroliter Aliquots LP2 für den Western Blot.

Bringen Sie etwa 30 Milliliter LS2 in Zentrifugalfiltereinheiten mit einem 10 militon Cutoff und konzentrieren Sie den LS2 auf etwa 0,5 Milliliter durch Schleudern bei 5.000 G für bis zu einer Stunde bei vier Grad Celsius. Nehmen Sie zwei 10 Mikroliter Aliquots konzentriertes LS2 für den bicinchoninischen Assay und zwei 250 Mikroliter Aliquots konzentriertes LS2 für den Western Blot. Resuspendieren Sie LP1 in einem Milliliter Puffer B, und nehmen Sie zwei 10 Mikroliter Aliquots LP1 für den Bicinchoninsäure-Assay und zwei 50-Mikroliter-Aliquots LP1 für den Western Blot.

Stellen Sie das verbleibende LP1 auf ein Endvolumen von 7,5 Milliliter und eine endgültige Saccharosekonzentration von 1,1 Molar mit Puffer B und Puffer C ein.Dann werden 7,5 Milliliter des resuspendierten LP1 in ein 14-Milliliter-Ultrazentrifugenröhrchen überführt. Überlagern Sie den LP1 vorsichtig mit 3,75 Milliliter Puffer D und markieren Sie die Oberseite der Lösung mit einem Stift. Dann mit etwa 1,25 Milliliter Puffer A überlagern und ebenfalls die Oberseite der Lösung mit einem Stift markieren.

Balancieren Sie die Röhrchen für die Ultrazentrifugation nach Gewicht, nicht nach Volumen, mit der tropfenweisen Zugabe von Puffer A auf 10 Milligramm aus. Zentrifugieren Sie bei 48.000 G für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimer Ultrazentrifugenrotor und nehmen Sie Bilder der intakten Gradienten auf, um die Unterscheidbarkeit jeder Saccharosegrenzfläche und den Erfolg der Fraktionierung zu dokumentieren. Entfernen Sie vorsichtig die oberflächliche Schicht von 320 Millimolar Saccharose und gewinnen Sie die Myelinfraktion an der 320 Millimolar, 855 Millimolar Saccharose Grenzfläche in einem 800 Mikroliter großen Volumen zurück.

Pipettieren Sie kreisförmig von der Rohrwand, um sicherzustellen, dass die gesamte Fraktion gesammelt wird. Anschließend wird die SPM-Fraktion an der 855 Millimolar, 1,1 Millimolar Saccharose-Grenzfläche in einem 1000 Mikroliter Volumen zurückgewonnen. Die restliche Saccharose vorsichtig absaugen und das mitochondriale Pellet durch Resuspendieren in 200 Mikrolitern Puffer B zurückgewinnen.Die SPM-Fraktion wird mit zwei Volumen Puffer B verdünnt und dann in einem Rotor mit festem Winkel in einem 3,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zentrifugiert.

Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das SPM-Pellet in Puffer A für ein Endvolumen von 250 Mikrolitern. Nehmen Sie zwei, fünf Mikroliter Aliquots SPM für den Bicinchoninsäure-Assay und teilen Sie das verbleibende SPM für den Western Blot in zwei Hälften. Elektronenmikroskopische Bilder von Synaptosom sind in dieser Abbildung dargestellt.

Ein Synaptosom, das synaptische Vesikel sowohl prä- als auch postsynaptische Komponenten und synaptische Vesikel in einem Mitochondrium enthält, sind hier gezeigt. Die Immunoblot-Analyse subzellulärer Fraktionen wurde durchgeführt, um Marker der Fraktionsreinheit zu bewerten. Im Vergleich zum ursprünglichen Ganzhirnhomogenat ergab die Analyse die Anreicherung von n-Cadherin in der synaptischen Plasmamembranfraktion, Alpha-Synuclein im synaptischen Zytosol, Synaptophysin in der synaptischen Vesikelfraktion und Myelin-Basisprotein in der Myelinfraktion.

Sobald die Fraktionsreinheit festgestellt wurde, kann das quantitative Immunoblotting verwendet werden, um die Lokalisierung von Proteinen von Interesse zu bestimmen oder Unterschiede in der Proteinverteilung zwischen Genotypen oder Behandlungen abzufragen. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, achten Sie darauf, waschmittelfreie Glaswaren zu verwenden, damit intaktes Synaptosom gesammelt werden kann. Seien Sie auch vorsichtig bei der Vorbereitung von Saccharosegradienten, um sicherzustellen, dass Sie klare Schnittstellen erhalten.

Auf diese Weise können Sie die synaptische Plasmamembranfraktion erfolgreich isolieren. Verschiedene Struktur- und Funktionsanalysen können durchgeführt werden, um die Qualität synaptischer Fraktionen wie Elektronenmikroskopie, Immunoblotting, Proteomik und andere molekulare Methoden zu unterstützen. Neurotransmitterfreisetzung oder enzymatische Assays können ebenfalls durchgeführt werden, um die metabolische Lebensfähigkeit des Synaptosoms zu unterstützen.

Die Isolierung von Synaptosomenstrukturen war eine paradigmenwechselnde Technik zur Analyse der Funktion und Zusammensetzung von Synapsen. Wie wir eine frühe synaptische Dysfunktion bei der Neurodegeneration sehen, wird uns die sorgfältige Dissektion molekularer Veränderungen auf Synapsenebene helfen, die molekularen Mechanismen dieser Störungen zu erforschen.