Name: Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Erfahren Sie Zeitraffer-Mikroskopie mit stadienspezifischer Protein-Depletion zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae. Diese Methode deckt einzigartige Proteinfunktionen während der Chromosomensegregation auf.

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Wir danken dem Light Microscopy Imaging Center der Indiana University. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM105755) unterstützt.

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<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
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<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
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<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
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<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dieses Protokoll kombiniert das NDT80-in-System zur Synchronisierung von Zellen, die Ankertechnik, um Proteine aus dem Zellkern zu entfernen, und die Fluoreszenz-Zeitraffermikroskopie, um knospende Hefezellen während der Meiose abzubilden. Das NDT80-in-System ist eine Methode zur Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, die einen Prophase-I-Arrest und -Release 4,8 verwendet. Obwohl die einzelnen Zellen in der Zeit, die sie in jedem der nachfo...

Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Dynamik der meiotischen Chromosomentrennung in knospender Hefe 1,2. Knospende Hefezellen können durch Aushungern wichtiger Nährstoffe zu Meiose gebracht werden3. Während der Meiose durchlaufen die Zellen eine Chromosomentrennung, gefolgt von zwei Teilungen, um vier meiotische Produkte zu erzeugen, die in Sporen verpackt sind (Abbildung 1). Einzelne Zellen können in jedem Stadium der Meiose visualisiert werden, wodurch räumliche und zeitliche Daten generiert werden, die von der Fixed-Cell-Bildgebung leicht übersehen werden können. Dieses Protokoll zeigt, wie die Kombination der Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie mit zwei zuvor etablierten Methoden, dem induzierbaren NDT80-System (NDT80-in) und der Ankerweg-Technik, verwendet werden kann, um die Funktion bestimmter Proteine in verschiedenen meiotischen Stadien zu untersuchen.
Das NDT80-in-System ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Synchronisation des meiotischen Zellzyklus, das auf der induzierbaren Expression des mittleren Meiose-Transkriptionsfaktors NDT80 4,5 beruht. Die NDT80-Expression ist für den Ausgang der ProphaseI 6,7 erforderlich. Mit dem NDT80-in-System steht NDT80 unter der Kontrolle des GAL1-10-Promotors in Zellen, die den Gal4-Transkriptionsfaktor exprimieren, der mit einem Östrogenrezeptor (Gal4-ER)4,5 fusioniert ist. Da Gal4-ER nur dann in den Zellkern gelangt, wenn es an β-Östradiol gebunden ist, werden NDT80-in-Zellen in Prophase I in Abwesenheit von β-Östradiol blockiert, was die Synchronisation von Zellen in Prophase I ermöglicht (Abbildung 1). β-Östradiol-Addition fördert die Translokation des Gal4-ER-Transkriptionsfaktors in den Zellkern, wo er GAL1-10 bindet, um die Expression von NDT80 zu steuern, was zu einem synchronen Eintritt in die meiotischen Divisionen führt. Obwohl die Zeitraffermikroskopie ohne Synchronisation durchgeführt werden kann, besteht der Vorteil der Synchronisation darin, dass ein Inhibitor oder ein Medikament hinzugefügt werden kann, während sich die Zellen in einem bestimmten Stadium der Meiose befinden.
Die Anker-weg-Technik ist ein induzierbares System, durch das ein Protein aus dem Zellkern unter Zugabe von Rapamycin8 abgereichert werden kann. Diese Technik ist ideal für die Untersuchung von Kernproteinen während der Zellteilung in knospender Hefe, da Hefezellen eine geschlossene Mitose und Meiose durchlaufen, bei der die Kernhülle nicht zusammenbricht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr nützlich für Proteine, die während der gesamten Meiose mehrere Funktionen haben. Anders als bei Deletionen, mutierten Allelen oder meiotischen Null-Allelen beeinträchtigt die Entfernung eines Zielproteins aus dem Zellkern in einem bestimmten Stadium nicht die Aktivität des Zielproteins in früheren Stadien, was eine genauere Interpretation der Ergebnisse ermöglicht. Das Ankerwegsystem nutzt das Pendeln von ribosomalen Untereinheiten zwischen dem Kern und dem Zytoplasma, das bei der ribosomalen Reifungauftritt 8. Um das Zielprotein aus dem Zellkern zu entfernen, wird das Zielprotein mit der FKBP12-Rapamycin-bindenden Domäne (FRB) in einem Stamm markiert, in dem die ribosomale Untereinheit Rpl13A mit FKBP12 markiert ist. Ohne Rapamycin interagieren FRB und FKBP12 nicht, und das FRB-markierte Protein verbleibt im Zellkern. Bei zusätzlicher Gabe von Rapamycin bildet das Rapamycin einen stabilen Komplex mit FKBP12 und FRB, der aufgrund der Wechselwirkung mit Rpl13A aus dem Zellkern geschleudert wird (Abbildung 1). Um den Zelltod durch Rapamycin zusätzlich zu verhindern, beherbergen Zellen die tor1-1-Mutation des TOR1-Gens . Zusätzlich enthalten diese Zellen fpr1Δ , ein Null-Allel des S. cerevisiae FKBP12-Proteins, das verhindert, dass endogenes Fpr1 Rpl13A-FKBP12 für FRB- und Rapamycin-Bindung übertrifft. Die Anker-Hintergrundmutationen, tor1-1 und fpr1Δ, haben keinen Einfluss auf meiotische Timings oder Chromosomentrennung2.
Um die Nützlichkeit dieser Technik zu demonstrieren, wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose abgebaut. Ctf19 ist eine Komponente des Kinetochors, die bei der Mitose entbehrlich ist, aber für die richtige Chromosomentrennung in der Meiose 9,10,11,12,13 erforderlich ist. Bei der Meiose wird das Kinetochor in der Prophase I ausgeschieden, und Ctf19 ist wichtig für die Remontagedes Kinetochors 9,14. Für dieses Protokoll wurden Zellen mit dem NDT80-in-System synchronisiert, und die Ankerweg-Technik wurde verwendet, um das Zielprotein Ctf19 vor und nach der Freisetzung aus der Prophase I und nach der Meiose-I-Chromosomentrennung aus dem Zellkern zu entfernen (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in jedem Stadium der Meiose und Mitose zu erschöpfen.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Östradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>Make 1mM Lagerbestände in 95% EtOH</td></tr><tr><td>0,22 μm Flaschenfilter mit Gewinde</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X</td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td>1:10 verdünnen, um als Lösungsmittel für ConA</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm Deckglas Nr. 1,5</td><td>VWR zu verwenden Nordamerikanische</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm Objektträger</td><td>VWR Nordamerika</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Adenin-Hemisulfatsalz</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>Zur Ergänzung von SC, SCA und 1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Herstellung als 1 mg/ml in 1X PBS</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2 CCD-Kamera</td><td>Photometrische Daten</td><td></td><td>, die in Abschnitt 4.3 verwendet werden</td></tr>: <tr><td>D-Glukose</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr>, <tr><td>Difco, Hefe-Stickstoffbase, ohne Aminosäuren</td>, <td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr>, <tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Millipore, Sigma</td>, <td>D5879</td><td></td></tr>, <tr><td>Eclipse Ti2, invertiertes Objektivmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>, verwendet in Abschnitt 4.4</td></tr>, <tr><td>Fidschi</td>, <td>NIH</td><td></td><td>Download von https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Personal DeltaVision Mikroskop</td><td>Angewandte Präzision</td><td></td><td>verwendet in Abschnitt 4.3</td></tr><tr><td>L-Tryptophan&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>Zur Ergänzung von SC, SCA und 1% Kac</td></tr><tr><td>Modeling Clay</td><td>Crayola</td><td>&nbsp; 2302880000</td><td>Zum Befestigen des Deckglases im Diahalter</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Verwendet in Abschnitt 4.4</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Kamera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>Verwendet in Abschnitt 4.4</td></tr><tr><td>Pipettenspitzenhalter aus Kunststoff</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Schneiden Sie einen 4 Quadrat x 4 Quadrat großen Querschnitt des Rack-Teils dieses Produkts ab.</td></tr><tr><td>Pottassium Acetate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td><td>Stellen Sie 1mg/ml-Bestände in DMSO</td></tr><tr><td>Silikondichtstoff</td><td>Aqueon</td><td>100165001 her,</td><td>auch bekannt als Aquarienkleber.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp; Bildgebungssoftware</td><td>Angewandte Präzision</td><td></td>, <td>die in Abschnitt 4.3</td></tr><tr><td>Synthetisches vollständiges Gemisch (Kaiser) verwendet wird&nbsp;</td><td>Für Medium</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>Typ N Immersionsöl&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

einsatz von zeitraffer-mikroskopie und stadienspezifischer kerndepletion von proteinen zur untersuchung der meiose bei s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Die Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hat das Verständnis von meiotischen Zellzyklusereignissen revolutioniert, indem sie zeitliche und räumliche Daten liefert, die von der Bildgebung fixierter Zellen oft nicht gesehen werden. Knospende Hefe hat sich als wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung der meiotischen Chromosomentrennung erwiesen, da viele meiotische Gene hoch konserviert sind. Die Zeitraffer-Mikroskopie der Meiose in knospender Hefe ermöglicht die Überwachung verschiedener meiotischer Mutanten, um zu zeigen, wie die Mutation meiotische Prozesse stört. Viele Proteine funktionieren jedoch an mehreren Stellen in der Meiose. Die Verwendung von Funktionsverlust- oder meiotischen Nullmutanten kann daher einen frühen Prozess stören, den späteren Prozess blockieren oder stören und es schwierig machen, die Phänotypen zu bestimmen, die mit jeder einzelnen Rolle verbunden sind. Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreibt dieses Protokoll, wie die Proteine in bestimmten Stadien der Meiose bedingt aus dem Zellkern abgereichert werden können, während meiotische Ereignisse mit Zeitraffermikroskopie überwacht werden. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie die Zellen in Prophase I synchronisiert werden, wie die Ankerweg-Technik verwendet wird, um Proteine aus dem Zellkern in bestimmten meiotischen Stadien zu entleeren, und wie Zeitraffer-Bildgebung verwendet wird, um die meiotische Chromosomentrennung zu überwachen. Als Beispiel für die Nützlichkeit der Technik wurde das Kinetochor-Protein Ctf19 zu verschiedenen Zeitpunkten während der Meiose aus dem Zellkern abgereichert, und die Anzahl der Chromatinmassen wurde am Ende der Meiose II analysiert. Insgesamt kann dieses Protokoll angepasst werden, um verschiedene Kernproteine aus dem Zellkern abzubauen und gleichzeitig die meiotischen Teilungen zu überwachen.

Um die Chromatin-Segregation zu überwachen, wurde das Histon-Protein Htb2 mit mCherry markiert. In der Prophase I erscheint das Chromatin als einzelne Htb2-Masse. Nachdem sich die homologen Chromosomen in der ersten meiotischen Teilung getrennt haben, erscheint das Chromatin als zwei unterschiedliche Massen (Abbildung 3A). Nachdem sich die Schwesterchromatiden getrennt haben, erscheint das Chromatin als vier Massen. Wenn einige Chromosomen nicht an Spindel-Mikrotubuli anheften, können nach M...

Die Zeitraffer-Mikroskopie ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Meiose in knospender Hefe. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Zellzyklus-Synchronisation, Zeitraffer-Mikroskopie und bedingte Depletion eines Zielproteins kombiniert, um zu zeigen, wie die Funktion eines bestimmten Proteins während der meiotischen Chromosomentrennung untersucht werden kann.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Durch die Synchronisierung von Zellen in der ersten Phase und die anschließende Erschöpfung des Zielproteins in einem bestimmten Stadium kann diese Methode vorübergehend unterschiedliche Funktionen bestimmter Proteine identifizieren. Der bedingte Abbau von Proteinen in bestimmten Stadien der Myose verhindert die Restwirkungen, die eine traditionelle myotische Mutante in späteren Stadien haben kann. Diese Methode könnte verwendet werden, um knospende Hefemitose und andere Organismen zu untersuchen, die keinen Kernhüllenabbau erfahren.Darüber hinaus kann diese Methode in anderen Organismen verwendet werden, um Zellzyklusereignisse vor dem Zusammenbruch der Kernhülle zu untersuchen. Machen Sie zunächst ein Agar-Pad, mit dem eine Monoschicht von Zellen für die Bildgebung erstellt wird. Schneiden Sie die Kappe und das untere Drittel eines 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens ab und entsorgen Sie es, um einen Zylinder zu erstellen, der als Form für das Agarkissen dient.Stellen Sie den geschnittenen Mikrozentrifugenzylinder auf einen sauberen Glasobjektträger, wobei die Oberseite des Röhrchens auf dem Kopf steht und auf dem Objektträger sitzt. Stellen Sie sechs Milliliter einer 5%igen Agarlösung in einem 50-Milliliter-Becherglas her. Schneiden Sie die Spitze der Pipette ab, um eine größere Öffnung zu erhalten, und pipettieren Sie etwa 500 Mikroliter geschmolzenes Agar in das Mikrozentrifugenröhrchen.Lassen Sie es bei Raumtemperatur stehen, bis der Agar erstarrt. Zur Herstellung von Hefezellen werden 200 Mikroliter der Sporulationskultur bei 800 g zwei Minuten lang in Ein-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen heruntergeschleudert. 180 Mikroliter des Überstands verwerfen.Resuspendieren Sie das Pellet im verbleibenden Überstand, indem Sie das Röhrchen schwenken und schnippen. Sechs Mikroliter der konzentrierten Zellen werden an Ort und Stelle mit ConA auf das Deckglas in der Mitte der Kammer pipettiert. Halten Sie den Zylinder mit dem Agarkissen fest und schieben Sie ihn vorsichtig vom Glasobjektträger.Stellen Sie sicher, dass der Agar unten völlig flach ist, und üben Sie mit der Unterseite der Pipettenspitze einen leichten Druck auf die Mikrozentrifugenform aus, so dass das Agarkissen leicht über den Rand des Röhrchens gedrückt wird. Als nächstes drehen Sie die Form so um, dass das Agarkissen nach unten zur Kammer zeigt. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Agarkissen vorsichtig auf die Zellen zu legen, und die Pipettenspitze, um das Agarpad vorsichtig 10 bis 20 Mal um die Kammer zu schieben, um eine Monoschicht von Zellen auf dem Deckglas zu erzeugen.Bewahren Sie das Agarkissen 12 bis 15 Minuten in der Kammer auf. Als nächstes werden zwei Milliliter Sporenkultur in zwei Mikrozentrifugenröhrchen überführt und zwei Minuten lang bei 15.700 g gedreht. Nachdem Sie den Überstand in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführt haben, drehen Sie ihn erneut unter dem gleichen Zustand und sammeln Sie den Überstand, um die Mikrozentrifugenröhrchen zu reinigen.Geben Sie zwei Milliliter des Überstands tropfenweise in die Kammer mit dem Agarkissen. Sobald die Flüssigkeit die Oberseite der Kammer erreicht hat, wird das Agarkissen höchstwahrscheinlich schwimmen. Entfernen Sie das Agarkissen vorsichtig mit einer Pinzette und entsorgen Sie es.Legen Sie ein 24 x 50 Millimeter großes Deckglas auf die Oberseite der Kammer, um eine Verdunstung während der Bildgebung zu verhindern. Um den Film auf dem Mikroskop einzurichten, stecken Sie das Deckglas in den Diahalter. Kleben Sie die Formmasse an die Seite des Deckglases, um sie sicher im Diahalter zu verstauen.Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware. Verwenden Sie grobe und feine Einstellknöpfe, um die Zellen mit DIC oder Hellfeld zu fokussieren. Klicken Sie im Hauptmenü der Bilderfassungssoftware auf Datei, wählen Sie Erfassen, und es werden vier Fenster angezeigt.Klicken Sie im Fenster Resolve 3D auf das Erlenmeyerkolben-Symbol. Dadurch wird ein Fenster mit dem Titel "Design Run Experiment" geöffnet, das die Steuerelemente zum Einrichten eines Experiments zum Einrichten eines Zeitrafferfilms enthält. Navigieren Sie auf der Registerkarte Entwurf zur Registerkarte Abschnitte.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Z-Schnitt, und stellen Sie den optischen Querschnittsabstand auf einen Mikrometer und die Anzahl der optischen Schnitte auf fünf ein. Klicken Sie anschließend auf der Registerkarte Kanäle auf das Plus-Symbol und wählen Sie den entsprechenden Kanal aus. Wählen Sie dann das Kästchen neben Referenzbild aus und legen Sie die Z-Position im Dropdown-Menü auf die Mitte der Probe fest.Wählen Sie einen Wert für Transmission und Belichtungszeit aus dem Dropdown-Menü aus. Aktivieren Sie auf der Registerkarte Zeitraffer das Kontrollkästchen neben Zeitraffer und geben Sie Werte für Minuten und Stunden ein, um das Zeitintervall der Bildaufnahme anzugeben. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben "Fokus mit ultimativem Fokus beibehalten", um Bühnendrifts während des Films zu vermeiden.Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Punkte" das Kontrollkästchen neben "Punkteliste besuchen". Klicken Sie im Hauptmenü auf Ansicht und wählen Sie Punktliste. Bewegen Sie die Bühne in einen Bereich der Kammer, der eine Monoschicht von Zellen zeigt.Klicken Sie im Fenster Punktliste auf Punkt markieren. Verschieben Sie die Bühne, um 25 bis 30 Punkte ohne Überlappung auszuwählen, um eine Überbelichtung der Zellen zu vermeiden, und bilden Sie jedes Feld während jedes Zeitverlaufs ab. Wählen Sie im Fenster "Punktliste" die Option "Alle kalibrieren", um den endgültigen Fokus für jeden Punkt festzulegen.Speichern Sie die Datei auf der Registerkarte Ausführen am entsprechenden Ziel auf dem Computer. Wählen Sie im Fenster "Test ausführen" die Schaltfläche "Abspielen" aus, um den Film zu starten. Öffnen Sie die Fidschi-Software.Öffnen Sie die Kanäle DIC und mCherry. Um eine einzelne Projektion mit maximaler Intensität des mCherry-Kanals zu erhalten, klicken Sie auf Bild, gefolgt von Stacks und Z-Projekt und wählen Sie Maximale Intensität aus dem Dropdown-Menü. Um die DIC- und mCherry-Kanäle in einem Bild zusammenzuführen, klicken Sie auf Bild, Farbe und wählen Sie Kanäle zusammenführen.Folgen Sie einer einzelnen Zelle durch Meiose. Nach Abschluss der Meiose II notieren Sie die Anzahl der DNA-Massen. In Wildtyp-Zellen mit dem Ankerhintergrund gibt es typischerweise vier DNA-Massen am Ende der Meiose II, die die vier Produkte der Meiose darstellen.In einem kleinen Teil der Zellen sind nach Meiose II nur drei Massen sichtbar.Wenn Ctf19-FRB zum Zeitpunkt der Freisetzung von Prophase I verankert ist, zeigen etwa 47% der Zellen nach Abschluss der Meiose mehr als vier DNA-Massen, was auf einen Defekt in der Befestigung von Kinetochoren und Mikrotubuli hindeutet. Mit der Verankerung von Ctf19-FRB, entweder nach Kinetochore-Assemblierung, aber vor Meiose I oder nach Meiose II, zeigen etwa 16% der Zellen zusätzliche DNA-Massen. Einer der wichtigsten Teile dieses Protokolls besteht darin, den Überstand tropfenweise in Ihre Kammer zu geben, um eine Unterbrechung Ihrer Monoschicht zu vermeiden.Notieren Sie sich außerdem die Zeit, die für die Vorbereitung der Bildgebung erforderlich ist, um sie in Ihrer Analyse zu berücksichtigen. Durch die Veränderung von fluoreszierend gepackten Proteinen kann dieses Verfahren verwendet werden, um die Fragen nach der Dauer des Zellzyklus, der Chromosomentrennung, der Proteinhäufigkeit und der Proteinlokalisation zu beantworten.

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Forschung

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