Name: Intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Knochenmetastasierungs-Xenograft-Mausmodells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Erfahren Sie die intrakardiale Injektion von PC3-Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Mausmodells für Knochenmetastasen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen und therapeutischer Strategien.

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Diese Arbeit wird durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 und 2020YFE0201600), der National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408), der Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047) und des Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation unterstützt.

Sechs bis acht Wochen alte männliche athymische BALB/c-Mäuse (n = 10) wurden in individuell belüfteten Mäusekäfigen (5 Mäuse/Käfig) in einem spezifisch-pathogenfreien (SPF) Tierraum unter den Bedingungen eines 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu SPF-Futter und sterilem Wasser untergebracht. Die Mäuse wurden vor den Experimenten eine Woche lang adaptiv gefüttert. Alle Tierversuche wurden vom Tierschutzausschuss der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigt.
1. Zellvorbereitung
<ol><li>Waschen Sie am Tag der Injektion von Prostatakrebszellen 80%-90% konfluente mit Luciferase markierte PC-3-Zellen (PC-3-Luciferase), die in einer 10-cm-Zellkulturschale mit vorkaltem, sterilem PBS (pH 7,4) kultiviert wurden, zweimal. Trypsinisieren Sie 3 Minuten lang mit 1,5 ml 0,25%igem Trypsin und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen, nachdem Sie das Trypsin mit 6 ml F-12-Medium mit 10 % Serum abgeschreckt haben. HINWEIS: Die PC-3-Luciferase-Zelllinie wird von der PC-3-Zelllinie abgeleitet, nachdem sie mit dem pLV-Luciferase-Vektor15 transfiziert wurde.</li>
	<li>Verwenden Sie einen automatischen Zellzähler und berechnen Sie die Zellkonzentration, indem Sie 20 μl der Zellsuspension auf die Zellzählplatte übertragen (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 x g bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu verwerfen, und resuspendieren Sie das Zellpellet in F-12-Medium (siehe Materialtabelle) auf eine endgültige Zelldichte von 1 x 107 Zellen/ml.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion immer auf Eis auf.</li>
	<li>Bringen Sie die Zellen in den Operationssaal und beenden Sie die Zellinjektion innerhalb von 2 Stunden. HINWEIS: Bereiten Sie zusätzliche Zellsuspensionen vor (in der Regel das doppelte Volumen nach Bedarf), um eine genaue Injektionsdosis zu gewährleisten (z. B. um die Toträume in den Spritzen zu vermeiden).</li>
</ol>2. Operation zur intrakardialen Injektion der menschlichen Prostatakrebszellen
HINWEIS: Das chirurgische Gerät, das für die intrakardiale Injektion verwendet wird, ist eine 1-ml-Spritze (Abbildung 1). Unterstützen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs bis zur Genesung von der Narkose.
<ol><li>Bewahren Sie die Maus im Tierzimmer mit Lichtschutzfaktor auf. Führen Sie alle Verfahren mit sterilisierten Geräten in einem aseptischen Schrank durch.</li>
	<li>Anästhesieren Sie die Maus mit 2 % Isofluran mit 98 % Sauerstoff bei einer Sauerstoffflussrate von 2 l/min. Anmerkungen: Schmieren Sie eine kleine Menge Augensalbe auf die Augen der Maus, um Trockenheit während der Narkose zu vermeiden. Führen Sie die gesamte Operation in einem gut belüfteten Bereich durch. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief betäubt ist, indem Sie die Zehen der Maus vor der Zellinjektion kneifen. Wenn die Reaktionen (z. B. ein Ruck oder ein Zucken) bestehen bleiben, warten Sie weitere Zeit, bis die Anästhesie wirkt.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in eine Supon-Position und immobilisieren Sie beide oberen Gliedmaßen, die senkrecht von der Mittellinie weggestreckt sind (Abbildung 2A).</li>
	<li>Immobilisieren Sie die Maus vom Bauch abwärts mit chirurgischem Klebeband. Vermeiden Sie es, stark zu drücken und die inneren Organe zu verschieben (Abbildung 2B). HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der topographischen Anatomie (d. h. die Befestigung mit Klebeband) ist unerlässlich, da die intrakardiale Injektion blind ist (d. h. die genaue Injektionsstelle am Herzen ist für das bloße Auge unsichtbar).</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut des Brustkorbs mit einem Tupfer aus 70%igem Ethanol.</li>
	<li>Identifizieren Sie den Xipoidfortsatz der Maus in der Vertiefung am untersten Ende des mittleren Brustbeins, indem Sie die Mitte der vorderen Brustwand abtasten. Identifizieren Sie die Halskerbe der Maus in der zentralen Vertiefung am oberen Rand des Manubriums, indem Sie von der Mitte der vorderen Brustwand nach oben tasten.</li>
	<li>Beschriften Sie den untersten Punkt des Processus xiphoideus und die Kerbe jugularis mit einem Markierungsstift (Abbildung 2A). Machen Sie eine dritte Markierung in der Mitte dieser beiden Orientierungspunkte und leicht nach rechts (links vom Tier) direkt über dem Herzen im dritten Zwischenrippenraum. HINWEIS: Die Injektionsstelle befindet sich 1-2 mm links von der Mittellinie und der Injektionspunkt befindet sich zwischen der dritten und vierten Rippe der Maus (Abbildung 2A).</li>
	<li>Geben Sie 200 μl der Zellsuspension in eine 1-ml-Spritze. Anmerkungen: Halten Sie eine Luftblase in der Spritze, wie in Abbildung 2C gezeigt, um sicherzustellen, dass das Blut pulsiert. Die Zellsuspension muss vor dem Laden gründlich gemischt werden.</li>
	<li>Führen Sie eine 26-G-Nadel vertikal durch die Injektionsstelle ein (Abbildung 2D).</li>
	<li>Halten Sie die Hand, die die Spritze hält, stabil auf dem Tisch oder verwenden Sie die andere Hand, um sie stabil zu halten. Achten Sie darauf, dass die Längsachse der Spritze senkrecht zur Injektionsstelle steht, und führen Sie die Spritze etwa 2 mm subkutan ein.</li>
	<li>Ein hellrotes Blutpulsieren ist in der Nadelnabe und/oder Zellsuspension sichtbar, wenn die Nadelspitze korrekt in die linke Herzkammer eingeführt wird. Wenn die Blutpulsation unsichtbar ist, befindet sich die Nadelspitze nicht im Herzen. Ziehen Sie die Nadel zurück und setzen Sie sie wieder ein (falls die Blutgerinnung in der Nadel die Blutpulsation stoppt). Stechen Sie die Nadel erneut ein.</li>
	<li>Injizieren Sie die Zellen. Injizieren Sie die Zellsuspension (100 μl) sehr langsam über 40-60 s und halten Sie die Hand, die die Spritze hält, die ganze Zeit stabil. Anmerkungen: Behalten Sie die Zellsuspension in der Spritze genau im Auge und injizieren Sie die Luftblase in der Spritze nicht in das Herz.</li>
	<li>Üben Sie mit einem trockenen Wattestäbchen 15 Sekunden lang Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Hämostase zu gewährleisten, wenn die Nadel zurückgezogen wird.</li>
	<li>Bringen Sie die Maus in den sauberen Käfig zurück und überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat.</li>
	<li>Stellen Sie sich die Maus innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion mit einem In-vivo-Biolumineszenzsystem vor, um sicherzustellen, dass die Krebszellen in den systemischen Kreislauf gelangt sind. HINWEIS: Korrekt injizierte Krebszellen gelangen über die linke Herzkammer in den arteriellen Kreislauf, was durch die im ganzen Körper sichtbare Biolumineszenz-Signalübertragung sichtbar ist (siehe Abbildung 3A).</li>
	<li>Führen Sie eine In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung durch.<ol><li>Schalten Sie das Gerät und den Computer ein. Öffnen Sie die Software, wenn die Betriebsanzeige am Gerät und am Computer heller wird, und öffnen Sie dann das Fenster Bildaufnahme .</li>
		<li>Identifizieren Sie das mit dem Computer verbundene In-vivo-Bildgebungssystem im Gerätebereich. Legen Sie die Maus, die abgebildet werden soll, in Rückenlage in die Bildkammer. Schließen Sie dann die Tür der Bildkammer.</li>
		<li>Legen Sie die Parameter im Bereich "Einstellung" im Fenster "Bildaufnahme" fest.<ol><li>Stellen Sie die Parameter mit Objektiv > Zoom > 1x, Objektiv > Fokus > 108 und Objektiv > Blende > F 2,8 ein, um die Bilder klar zu machen.</li>
			<li>Stellen Sie den Aufnahmekanal unter Filter&Licht ein: Filter&Light > Filter > Lumineszenz, Filter&Light > Light > OFF, und Filter&Light > Lichtintensität > Mitte.</li>
			<li>Stellen Sie die Art des aufzunehmenden Bildes ein: Belichtungs- > Typ > Einzelbild, Belichtungs- > Belichtungszeit > 500 ms, Belichtungs- > HDR-Modus > Low-Gain-Modus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um das Bild zu erfassen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Visualisieren Sie das metastasierende Krebswachstum mit In-vivo-Biolumineszenz . HINWEIS: Injizieren Sie zu jedem Zeitpunkt der Visualisierung intraperitoneal 200 μl des Luciferin-Substrats in eine 20 g schwere Maus (150 mg/kg) und warten Sie 15 Minuten vor der Anästhesie (2 % Isofluran gemischt mit 98 % Sauerstoff in einer Induktionskammer). Platzieren Sie die Maus auf der Plattform des Biolumineszenz-Bildgebungssystems. Halten Sie die Anästhesie durch eine Nasenmaske mit 2% Isofluran aufrecht.</li>
</ol>3. Pathologische Untersuchung
<ol><li>Vier Wochen nach der Zellinjektion wird die Maus durch CO2 - Inhalation und anschließende Zervixluxation geopfert.</li>
	<li>Bewegen Sie die Maus in Rückenlage. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen vertikalen Schnitt (ca. 6 cm) vom Bauch bis zum Brustkorb, um alle Organe im Bauch und Thorax freizulegen und grob auf krebsartige Läsionen und/oder pathologische Veränderungen zu untersuchen. HINWEIS: Bei einer Studie zur intrakardialen Injektion von Krebszellen deuten Krebsläsionen im Mediastinum neben dem Herzen auf falsch injizierte Krebszellen hin (Zellen, die nicht in die linke Herzkammer injiziert werden). Daher werden diese Mäuse nicht in die endgültige Datenerhebung einbezogen.</li>
	<li>Entfernen Sie die metastasierenden Tumore mit einer Schere. Messen Sie die langen Durchmesser (a) und kurzen Durchmesser (b) des Tumors mit Messschiebern, um das Tumorvolumen (V) nach der Formel V = 1/2 × a × b2 zu berechnen, und wiegen Sie den Tumor mit einer elektronischen Waage.</li>
	<li>Fixieren Sie das Tumorgewebe in 10%iger Formalinlösung und betten Sie es anschließend in Paraffin ein. Alternativ können die Tumore auch in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.</li>
	<li>Schneiden Sie die Knochen (Hintergliedmaßen, Wirbel und/oder Rippen) mit metastasierten Läsionen heraus. Fixieren Sie die Probe jeder Maus in einem 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 10%iger Formalinlösung für 24 Stunden nach Entfernung der Haut und der Muskeln, gefolgt von einer 14-tägigen Entkalkung in 10%iger EDTA-Lösung mit häufigem Pufferwechsel (alle 3 Tage).</li>
	<li>Die Probe wird in Paraffin eingebettet und die Proben für die histologische Routineuntersuchunggeschnitten 16.</li>
</ol>

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</ol>

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung von Knochenmetastasen ist ein ideales Mausmodell, um die Funktionen und Mechanismen der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs zu erforschen und die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten. Studien haben gezeigt, dass Knochenschäden am wahrscheinlichsten in der proximalen Tibia und dem distalen Femurauftreten 17, was auf ihre hohe Vaskularisierung und Stoffwechselaktivität zurückzuführen sein kann.
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Prostatakrebs ist in 112 Ländern die häufigste Krebserkrankung bei Männern und steht in Ländern mit höherem Index der menschlichen Entwicklungan zweiter Stelle bei der Sterblichkeit 1,2. Die meisten Todesfälle bei Prostatakrebspatienten werden durch Metastasen verursacht, und etwa 65%-75% der Fälle entwickeln Knochenmetastasen 3,4. Daher sind Prävention und Behandlung von Knochenmetastasen bei Prostatakrebs dringend erforderlich, um das klinische Ergebnis von Prostatakrebspatienten zu verbessern. Das Tiermodell der Knochenmetastasierung ist ein unverzichtbares Werkzeug, um den mehrstufigen Prozess und die molekularen Mechanismen zu erforschen, die in jedem Stadium der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs beteiligt sind, um so therapeutische Ziele zu identifizieren und neue Therapeutika zu entwickeln5.
Zu den gebräuchlichsten Methoden zur Erzeugung von experimentellen Tiermodellen für Prostatakrebs-Knochenmetastasen gehören die orthotope, intradiaphysische (z. B. intratibiale) und intrakardiale Injektion von Prostatakrebszellen. Das Knochenmetastasenmodell mit orthotoper Injektion wird durch direkte Injektion von Prostatakrebszellen in die Prostata einer Maus erzeugt 6,7. Dieses experimentelle Tiermodell hat sehr ähnliche klinische Merkmale wie die Knochenmetastasierung von Prostatakrebs. Die Metastasierung findet jedoch hauptsächlich im axillären Lymphknoten und in der Lunge statt im Knochen statt 8,9. Das intratibiale Injektionsmodell für Prostatakrebs injiziert Prostatakrebszellen direkt in die Tibia mit einer hohen Tumorbildungsrate im Knochen (Tibia)10,11; Die Knochenrinde und die Knochenmarkhöhle können jedoch leicht beschädigt werden. Darüber hinaus kann die tibiale Injektionsmethode den pathologischen Prozess der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs, bei dem die Krebszellen den Knochen durch den Kreislauf besiedeln, nicht stimulieren. Um die Durchblutung, die vaskuläre Paravasation und die Fernmetastasierung bei einer höheren Knochenmetastasierungsrate von Krebszellen zu untersuchen, wurde eine intrakardiale Injektionstechnik entwickelt, bei der Prostatakrebszellen direkt in die linke Herzkammer der Maus injiziert werden 8,12,13. Das macht es zu einem wertvollen Tiermodell für die Knochenmetastasenforschung8. Die intrakardiale Injektionsmethode weist eine Knochenmetastasierungsrate von etwa 75 % auf9,14 auf, was viel höher ist als die orthotope Injektionsmethode. Daher ist die intrakardiale Injektion eine ideale Methode, um ein Tiermodell mit Prostatakrebs-Knochenmetastasen zu erzeugen.
Ziel dieser Arbeit ist es, den Prozess der Etablierung eines Mausmodells für Prostatakrebs-Knochenmetastasen zu beschreiben, das es den Lesern ermöglicht, die Modelletablierung zu visualisieren. Die vorliegende Arbeit liefert detaillierte Prozesse, Vorsichtsmaßnahmen und anschauliche Bilder zur Erzeugung eines Knochenmetastasen-Xenotransplantatmodells durch intrakardiale Injektion von humanen Prostatakrebszellen in athymischen Mäusen. Diese Methode bietet ein effektives Werkzeug, um die molekularen Mechanismen und die therapeutischen Effekte von Prostatakrebs-Knochenmetastasen in vivo weiter zu erforschen.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritzen und Nadeln</td><td>Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd</td><td>20200411</td><td>Die Zellen wurden in die Ventrikel von Mäusen injiziert</td></tr><tr><td>Anästhesiemaschine</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>Ausrüstung zur Anästhesie von Mäusen</td></tr><tr><td>Automatischer Zellzähler</td><td>Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>&nbsp; Zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>BALB/c athyme Mäuse</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd.</td><td>Männliche</td><td>6-8 Wochen alte, männliche Mäuse</td></tr><tr><td>Biolumineszenz-Bildgebungssystem</td><td>Shanghai Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>Zur Verfolgung des Tumorwachstums und der Lungenmetastasen, wenn die injizierten Zellen mit Luziferase markiert werden</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 mL, 50 mL)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>&nbsp; 430790, Corning EDTA-Lösung</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd</td><td>G1105</td><td>&nbsp; Zur Entkalkung von Knochen tissure</td></tr><tr><td>F-12 Medium</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>21700075, GIBCO</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Formalin Lösung</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL539A</td><td>Zur Fixierung der Probe jeder Maus</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>Für die Anästhesie&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo Fisher</td><td>Plasmid-Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>PC-3-Zelllinie Zellbank</td><td>der Chinesischen Akademie der Wissenschaften</td><td>TCHu 158</td><td>Prostatakrebs-Zelllinie</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>Waschen Sie die menschlichen Osteosarkomzellen</td></tr><tr><td>Trypsin (0,25%)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co. , Ltd</td><td>25200056, Gibco</td><td>Zur Ablösung der Zellen</td></tr><tr><td>Vektor (pLV-Luciferase)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>Plasmid für die Transfektion</td></tr><tr><td>Röntgenbildgebungssystem</td><td>Brook (Beijing) Technology Co., Ltd</td><td>FX PRO</td><td>Zur Gewinnung von Röntgenbildern zur Erkennung von Tumorwachstum</td></tr><tr><td>&mu; CT80</td><td>Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd</td><td>Scanco Medical AG, Schweiz</td><td>Zum Nachweis von Knochenzerstörung. Das Mikro-CT ist ausgestattet mit 3DCalc, Konusrekonstruktion,&nbsp; und &mu; CT Ray V3.4A Software zur Visualisierung von Modellen.</td></tr></tbody></table>

intrakardiale injektion menschlicher prostatakrebszellen zur erzeugung eines knochenmetastasierungs-xenograft-mausmodells

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

Als häufigste bösartige Erkrankung bei Männern steht Prostatakrebs (PC) an zweiter Stelle bei der Mortalität, was vor allem auf eine Knochenmetastasierungsrate von 65 % bis 75 % zurückzuführen ist. Daher ist es wichtig, den Prozess und die damit verbundenen Mechanismen der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs zu verstehen, um neue Therapeutika zu entwickeln. Hierfür ist ein Tiermodell der Knochenmetastasierung ein wesentliches Werkzeug. Hier berichten wir über detaillierte Verfahren zur Erzeugung eines Knochenmetastasen-Mausmodells durch intrakardiale Injektion von Prostatakrebszellen. Ein Biolumineszenz-Bildgebungssystem kann feststellen, ob Prostatakrebszellen genau in das Herz injiziert wurden, und die Metastasierung von Krebszellen überwachen, da es große Vorteile bei der Überwachung der Entwicklung metastasierender Läsionen hat. Dieses Modell bildet die natürliche Entwicklung von disseminierten Krebszellen zu Mikrometastasen im Knochen nach und imitiert den pathologischen Prozess der Knochenmetastasierung von Prostatakrebs. Es bietet ein effektives Werkzeug für die weitere Erforschung der molekularen Mechanismen und der therapeutischen Wirkungen dieser Krankheit.

Die Biolumineszenz-Bildgebung bietet enorme Vorteile bei der Überwachung der Entwicklung metastasierender Läsionen für ein intrakardiales Injektionsmodell. Kurz nach der Injektion der Krebszellen (innerhalb von 24 h) wurde die Biolumineszenz-Bildgebung verwendet, um den Eintritt der Krebszellen in den allgemeinen Blutkreislauf sichtbar zu machen (Abbildung 3A). Offensichtliche Biolumineszenz-Signale im ganzen Körper sind zu sehen, wenn die Krebszellen richtig in den arteriellen Kreislauf inj...

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die intrakardiale Injektion von humanen Prostatakrebszellen vor, um ein Mausmodell mit Knochenmetastasenläsionen zu erzeugen.

Intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Knochenmetastasierungs-Xenograft-Mausmodells

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

Diese Methode kann dazu beitragen, ein ideales Modell zu erstellen, das den natürlichen Verlauf der Knochenmetastasierung von Prostatakrebszellen in vivo genau nachahmt. Diese Technik hat den Vorteil, dass eine Knochenmetastasierung stattfindet und der natürliche Knochenmetastasenprozess von Prostatakrebszellen in vivo dargestellt wird. Diese Technik dient der Erforschung der molekularen Mechanismen und der Untersuchung von in vivo therapeutischen Effekten bei Prostatakrebs-Knochenmetastasen.Nehmen Sie am Tag der Injektion 80 bis 90 % konfluente Luciferase-markierte PC3-Zellen, die in einer 10-Zentimeter-Zellkulturschale kultiviert wurden, und bereiten Sie die Zellen für die Injektion vor, indem Sie sie zweimal mit kaltem, sterilem PBS waschen. Trypsinisieren Sie die gewaschenen Zellen drei Minuten lang mit 1,5 Millilitern 0,25%Trypsin, danach löschen Sie das Trypsin durch Zugabe von sechs Millilitern F12-Medium mit 10%igem Serum und sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 20 Mikroliter der gesammelten Zellsuspension in eine Zellzählplatte und berechnen Sie die Zellkonzentration mit einem automatischen Zellzähler.Anschließend werden die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 800 G zentrifugiert.Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Zellpellet in F12-Medium, um die gewünschte endgültige Zelldichte zu erreichen. Tragen Sie nun die Zellen in den Operationssaal und führen Sie die Zellinjektion innerhalb von zwei Stunden durch. Bewahren Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis auf.Um mit der Operation zu beginnen, legen Sie die betäubte Maus in Rückenlage und immobilisieren Sie beide oberen Gliedmaßen, indem Sie sie senkrecht von der Mittellinie weg strecken. Immobilisieren Sie die Maus mit chirurgischem Klebeband vom Bauch abwärts, ohne stark zu drücken und die inneren Organe zu verschieben. Desinfizieren Sie die Haut des Brustkorbs mit einem 70%igen Ethanoltupfer.Als nächstes tasten Sie die Mitte der vorderen Brustwand ab, um den Xipoidfortsatz der Maus in der Vertiefung am untersten Ende des mittleren Brustbeins zu lokalisieren. Markieren Sie den unterlegensten Punkt des Xipoid-Prozesses. Lokalisieren Sie dann durch Abtasten von der Mitte der vorderen Brustwand aus die Halskerbe der Maus in der zentralen Vertiefung am oberen Rand des Manubriums und markieren Sie den untersten Punkt der Halskerbe.Suchen und markieren Sie nun den Mittelpunkt zwischen den beiden vorherigen Markierungen, leicht nach rechts und knapp über dem Herzen im dritten Zwischenrippenraum. Dies ist der Einspritzpunkt. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich, bevor Sie 200 Mikroliter der Suspension in eine Ein-Milliliter-Spritze füllen, die mit einer 26-Gauge-Nadel montiert ist.Lassen Sie etwas Luft in der Spritze zwischen dem Kolben und der Suspension, damit während der Injektion pulsierendes Blut eindringen kann. Um die Injektion durchzuführen, führen Sie die Nadel vertikal durch die Injektionsstelle. Wenn die Nadelspitze korrekt in die linke Herzkammer eingeführt wird, ist hellrotes, pulsierendes Blut in der Nadelnabe sichtbar.Wiederholen Sie die Injektion, wenn die Blutpulsation nicht sichtbar ist oder das Blut gerinnt. Sobald die Nadel richtig eingeführt ist, injizieren Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension sehr langsam über 40 bis 60 Sekunden mit einer stabilen Hand. Ziehen Sie nach Abschluss der Injektion die Nadel zurück, während Sie mit einem trockenen Wattestäbchen 15 Sekunden lang Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um die Hämostase zu gewährleisten.Bringen Sie die Maus in den sauberen Käfig zurück und überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat. Die Biolumineszenz-Bildgebung, die 24 Stunden nach der Injektion von Luciferase-markierten PC3-Zellen in die Maus durchgeführt wurde, zeigte Signale aus dem gesamten Körper des Tieres, die auf das Vorhandensein von Krebszellen im systemischen Kreislauf hindeuten. Metastasierte Läsionen traten zwei Wochen nach der Injektion in den Hinterbeinen der Maus auf.Die metastasierten Läsionen wurden im Laufe der Zeit größer und traten an anderen Stellen auf. Die durch Prostatakrebszellen induzierten metastasierenden Läsionen in den Knochen wurden außerdem mittels Röntgenaufnahmen nachgewiesen, die eine Knochenzerstörung in der proximalen Tibia des Tieres zeigten. Dies wurde auch durch Mikro-CT-Scans bestätigt.Die metastasierten Läsionen wurden in paraffinhaltigem Gewebe durch Hämatin- und Eosinfärbung bestätigt. Eine genaue Injektionsstelle ist sehr wichtig, um die Erfolgsquote dieses Modells zu gewährleisten. Dies kann durch Übung erreicht werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Tiermodelle werden häufig genutzt, um Krebs Metastasen in Knochen zu untersuchen. In diesem Protokoll werden wir zwei gängige Methoden der Tumorinokulation für Knochenmetastasen Studien beschreiben und beschreiben Sie kurz einige Analysen genutzt werden, um zu überwachen und zu quantifizieren diese Modelle.

Models von Knochenmetastasen

Das Video demonstriert die orthotope Inokulationstechnik für Brustkrebs in einem Mausmodell. Diese Technik führt zu einer hohen Tumorgeneserate mit geringerer Variabilität in Tumorgröße und -form im Vergleich zur subkutanen oder nicht-chirurgischen Injektion.

Orthotope Injektion: Implantation gewebespezifischer Krebszellen in eine erwachsene Maus

In diesem Video demonstrieren wir das Verfahren zur intraprostatischen Injektion von Prostatakrebszellen in ein Mausmodell. Orthotope Mausmodelle können verwendet werden, um die Entstehung der Krankheit und das Ansprechen auf Behandlungstherapien in einer nicht-invasiven und klinisch relevanten Umgebung zu untersuchen.

Intraprostatische Injektion von Krebszellen: Eine Technik zur Verabreichung von Krebszellen zur Etablierung eines orthotopen Prostatakrebs-Mausmodells

Dieses Modell der orthotopen menschlichen Prostatakrebs ermöglicht die Quantifizierung der Tumorgröße, zirkulierenden Tumorzellen und die Bildung von Metastasen in unterschiedlichen Lungen. Wie Zellen müssen das primäre Organ zu entkommen, in die Blutbahn, und implantieren in einem sekundären Standort dieses Modell effektiv rekapituliert das Szenario in den Menschen.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Die etablierte Technik, um primäre invasive orthotopen Blasenkrebs Xenografts impfen erfordert Laparotomie und Mobilisierung der Blase. Dieses Verfahren verursacht eine signifikante Morbidität auf Mäuse, ist technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig. Wir haben deshalb eine hohe Präzision, die perkutane Ansatz verwendet Ultraschallkontrolle.

Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, die zur Erzeugung von von Prostatakrebspatienten abgeleiteten Xenotransplantaten (PDXs) aus zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) verwendet wird. Die Generierung von PDX-Modellen aus CTCs bietet ein alternatives experimentelles Modell zur Untersuchung von Prostatakrebs; Der am häufigsten diagnostizierte Tumor und eine häufige Todesursache durch Krebs bei Männern.

Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Prostatakrebs ist die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache in den Vereinigten Staaten. Ein orthotopes Krebsmodell bietet einen nützlichen Ansatz, um die Biologie des Prostatakarzinoms zu verstehen und die Wirksamkeit von Therapieschemata zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Schritte, die zur Etablierung eines orthotopen Prostatakrebs-Mausmodells erforderlich sind.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

Das Ziel dieses Protokolls ist die Intra-Prostata Injektion von Prostata-Krebszellen, mit anschließenden Kastration zu demonstrieren. Orthotopen präklinische Modellen von Androgen-abhängigen und Kastration-resistenten Prostatakrebs sind entscheidend für die Krankheit im Zusammenhang mit einer klinisch relevanten Tumor Mikroumgebung und einem immunkompetenten Wirt zu studieren.

Eine Fluoreszenz und Biolumineszenz orthotopen Phänomen Mausmodell der Androgen-abhängige und Kastration-resistenten Prostatakrebs

Metastasierung des Zentralnervensystems PDX-Modelle repräsentieren die phänotypischen und molekularen Merkmale der humanen Metastasierung und sind damit hervorragende Modelle für präklinische Studien. Hier wird beschrieben, wie PDX-Modelle erstellt werden und welche Inokulationswege am besten für präklinische Studien verwendet werden.

Die Etablierung und Nutzung von patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen der Metastasierung des Zentralnervensystems

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Intratibia-Osteosarkom-Zellinjektion zur Generierung von Mausmodellen mit orthotopen Osteosarkom- und Lungenmetastasenläsionen.

Intratibiale Osteosarkom-Zellinjektion zur Erzeugung orthotoper Osteosarkom- und Lungenmetastasen-Mausmodelle

Erfahren Sie die intrakardiale Injektion von PC3-Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Mausmodells für Knochenmetastasen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Mechanismen und therapeutischer Strategien.

Intrakardiale Injektion menschlicher Prostatakrebszellen zur Erzeugung eines Knochenmetastasierungs-Xenograft-Mausmodells

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