Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in Saccharomyces cerevisiae

Dieses Protokoll ist eine einfache Methode, um die Effizienz zu quantifizieren, mit der sich verschiedene Hefestämme und Hefearten miteinander paaren. Die vorgeschlagene Methode ist einfach, robust und effizient. Die Methode kann auf jeden Hefestamm ausgeweitet werden.

Die in dieser Studie beschriebene Methode kann verwendet werden, um zu verstehen, wie Artbildung in Hefe abläuft. Darüber hinaus können die von uns beschriebenen Stämme besonders nützlich sein, um Experimente mit Genfluss zu entwerfen. Die Stärke der Methode ist, dass sie wirklich einfach ist.

Einige geringfügige Anpassungen, wie z. B. die Inkubationszeit, können je nach verwendeter Sorte erforderlich sein. Beginnen Sie mit der Wiederbelebung der Haploiden A und Alpha aus gefrorenen Beständen, indem Sie das Hefeinokulum auf einen Hefeextrakt, Pepton, Dextrose oder eine YPD-Agarplatte streichen. Lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius wachsen, um einzelne Völker zu erhalten.

Nach der Inkubation einzelne Völker von der YPD-Platte und fünf Milliliter YPD-Medium beimpfen und 48 Stunden bei 30 Grad Celsius mit 250 U/min schütteln. Nach dieser Inkubationszeit befinden sich die Zellen in der stationären Wachstumsphase. Zeichnen Sie auf einer frischen YPD-Platte ein 1 x 1,5 Zentimeter großes Rechteck, das in drei Kästchen mit einer Abmessung von jeweils 1 x 0,5 Zentimeter unterteilt ist.

Impfen Sie fünf Mikroliter der YPD-Kultur der beiden Paarungstypen auf das Rechtecke ganz links und ganz rechts. Dieses Volumen entspricht etwa 5 mal 10 bis fünf haploiden Zellen in jedem Abschnitt. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.

Um eine gleiche Anzahl von Hefezellen zu mischen, entfernen Sie etwa 1/3 des Hefewachstums, das sich in den Umverpackungen entwickelt hat, mit einem sterilen Zahnstocher und resuspendieren Sie die entfernten Zellen in 20 Mikrolitern Wasser in einer sterilen 1,5-Milliliter-Durchstechflasche. Befolgen Sie dies für jeden Haploiden. Dann verdünnen Sie fünf Mikroliter dieser Suspension in zwei Millilitern Wasser und messen die optische Dichte mit einem Spektralphotometer bei 600 Nanometern.

Basierend auf dem optischen Dichtewert und der Anzahl der Zellen pro Milliliter bei einer optischen Dichte werden die erforderlichen Volumina beider Haploide in ein frisches und steriles 1,5-Milliliter-Fläschchen gegeben. Mit einer Pipette gut mischen. Das Endvolumen dieser Suspension beträgt in der Regel etwa sechs bis acht Mikroliter.

Als nächstes impfen Sie diese Suspension im mittleren Gitter. Inkubieren Sie die Platte sieben Stunden lang bei 30 Grad Celsius, damit sich die Haploiden paaren können. Nach siebenstündiger Inkubationszeit kratzen Sie die Zellen mit einem Zahnstocher oder einer Pipettenspitze aus dem mittleren Rechteck ab und verdünnen sie in zwei Millilitern sterilem Wasser.

Führen Sie weitere Verdünnungen durch und verteilen Sie dann die Zellsuspension auf YPD-Agar, um einzelne Kolonien zu erhalten. Nach dem Ausplattieren werden die YPD-Platten bei 30 Grad Celsius für 36 bis 48 Stunden inkubiert, um einzelne Kolonien zu entwickeln. Stellen Sie sicher, dass aus jedem Paarungsexperiment einige hundert einzelne Völker für das Screening gewonnen werden, um die statistische Signifikanz der Daten sicherzustellen.

Um die diploiden Kolonien auf der Platte zu identifizieren, übertragen Sie die einzelnen Kolonien, indem Sie sie einzeln auf eine doppelte Ausfallplatte streifen, wobei die Aminosäuren fehlen, für die die Stämme auxotroph sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden und berechnen Sie die Steckeffizienz, nu. Die Robustheit des Protokolls ermöglichte eine einfache Unterscheidung der Paarungseffizienz zwischen den beiden Stämmen SK1AM und ScAM.

Während die SK1-Stämme mit einem sehr hohen Wirkungsgrad gepaart wurden, paarten sich die ScAM-Stämme mit einem relativ geringeren Wirkungsgrad. Die Paarungseffizienz der ScAM-Stämme sank signifikant, wenn die Umgebung keine Glukose als primäre Kohlenstoffquelle enthielt, was darauf hindeutet, dass die Paarung ein energetisch teurer Prozess ist und das Wachstum auf alternativen Kohlenstoffquellen die Effizienz der Paarung qualitativ verringert. Wenn man sie für unterschiedliche Zeiträume paaren durfte, wurde in den ersten vier bis fünf Stunden keine Paarung beobachtet.

Die ersten Diploiden traten erst nach vier bis fünf Stunden auf, was darauf hindeutet, dass dies die Zeit ist, die benötigt wird, um den Paarungsprozess in der gegebenen Umgebung abzuschließen. Danach stieg die Steckeffizienz rapide an. Nach sieben Stunden wurden die Berechnungen der Paarungseffizienz durch die Tatsache beeinflusst, dass das mitotische Wachstum auf der Platte begann.

Stellen Sie sicher, dass die gleiche Anzahl beider Haploide gemischt wird. Abweichungen hiervon würden zu Variationen in unabhängigen Wiederholungen des Protokolls führen. Wie sich der Genfluss auf Anpassung und Artbildung auswirkt, ist eine offene Frage.

Da die auxotrophen Marker in unseren Stämmen neben dem MAT-Locus eingefügt werden, hilft dies, diese wichtige Frage zu beantworten.