Name: Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Erfahren Sie eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz bei Saccharomyces cerevisiae. Dieses Protokoll ermöglicht Speziationsstudien und Untersuchungen zum Genfluss in Hefestämmen.

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Diese Arbeit wurde durch ein DBT/Wellcome Trust (India Alliance) Stipendium (IA/S/19/2/504632) an S.S. P.N. ist ein Research Fellow, der durch ein DBT/Wellcome Trust (India Alliance) Stipendium unterstützt wird (IA/S/19/2/504632). A.M. wird vom Council of Scientific and Industrial Research (CSIR) der indischen Regierung als Senior Research Fellow unterstützt (09/087(0873)/2017-EMR-I). Die Autoren danken Paike Jayadeva Bhat für das Gespräch.

ANMERKUNG: Das Protokoll umfasst im Großen und Ganzen die folgenden Schritte: (1) Patchen der Haploiden in den Paarungseffizienzgittern auf einer YPD-Platte, (2) Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl nach 24-stündiger Inkubation und Geben der gemischten Haploiden einige Stunden Zeit zur Paarung (7 h in dieser Studie), (3) Ausplattieren der gemischten Zellen auf YPD zur Isolierung einzelner Kolonien nach 7 h bei 30 °C, und schließlich (4) die Bestimmung der Anzahl der gebildeten Diploiden unter Verwendung der auxotrophen Marker. Diese Schritte werden im Folgenden ausführlich erläutert (siehe auch Abbildung 2).
1. Ausbessern von Haploiden in den Paarungseffizienzgittern
<ol><li>Beleben Sie die Haploiden a und α aus Tiefkühlbeständen, indem Sie sie auf eine YPD-Agarplatte (2 % Agar, 2 % Dextrose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt) streifen, und lassen Sie sie 48 h bei 30 °C wachsen, um isolierte Einzelkolonien zu erhalten.</li>
	<li>Einzelne Kolonien von der YPD-Platte in 5 ml YPD-Medium (2 % Dextrose, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt) beimpfen und bei 30 °C 48 h unter Schütteln mit 250 U/min inkubieren. Nach dieser Inkubationszeit befinden sich die Zellen in der stationären Wachstumsphase.</li>
	<li>Zeichne ein Gitter für die Effizienz der Paarung auf eine frische YPD-Platte. Zeichnen Sie das Raster als 1 cm x 1,5 cm großes Rechteck, das in drei Kästchen unterteilt ist, die jeweils eine Abmessung von 1 cm x 0,5 cm haben, wie in Abbildung 2A dargestellt.</li>
	<li>Patch 5 μL der YPD-Kultur der beiden Paarungstypen auf dem Rechteck ganz links und ganz rechts (Abbildung 2B). Dieses Volumen entspricht etwa 5 x 105 haploiden Zellen, die in jedem Abschnitt angeordnet sind. Die Platten 24 h bei 30 °C inkubieren. HINWEIS: Der Zweck des Rasters besteht darin, die experimentellen Messungen (z. B. die Anzahl der Zellen im Experiment) präzise zu machen. Die Gittergröße ist klein genug, um experimentell handhabbar zu sein, aber groß genug, dass sie leicht manipuliert werden kann (wie das Anheben von Zellen aus einem Gitter) und nicht anfällig für Drift oder Zufallsereignisse ist.</li>
</ol>2. Vermischung von Haploiden und Paarung
ANMERKUNG: Nach 24 Stunden (Abbildung 2C) wird eine gleiche Anzahl von Zellen der beiden haploiden Typen von den beiden Gittern abgekratzt, gemischt und in das mittlere Rechteck gelegt (Abbildung 2D).
<ol><li>Um eine gleiche Anzahl von Zellen zu mischen, entfernen Sie etwa 1/3 des Pflasters, das in die äußeren Schachteln gelegt wurde, mit einem sterilen Zahnstocher und resuspendieren Sie es in 20 μl Wasser in einem sterilen 1,5-ml-Fläschchen für jedes der Haploiden.</li>
	<li>Verdünnen Sie 5 μl dieser Suspension in 2 ml Wasser. Messen Sie den OD dieser verdünnten Suspension mit einem Spektralphotometer bei 600 nm. Mischen Sie eine gleiche Anzahl von Zellen aus den beiden Stämmen, basierend auf dem OD-Wert und der Anzahl der Zellen/ml in 1 OD für diesen bestimmten Stamm. Berechnen Sie das Volumen, das gemischt werden muss, und saugen Sie es aus den verbleibenden 15 μl der einzelnen haploiden Suspension ab. HINWEIS: Die Anzahl der Zellen, die im mittleren Rechteck gepatcht sind, ist so, dass die Zellen eine Monoschicht bilden. Betrachtet man die Hefezelle als Kugel mit einem Radius von 2,58 μm33, so bräuchte ein rechteckiger Kasten von 1 cm x 0,5 cm etwa 1,7 x 106 Zellen, um eine Monoschicht zu bilden. Es sollte darauf geachtet werden, dass es keine physische Berührung zwischen den für die Paarung geflickten Zellen und den beiden haploiden Zellgittern gibt. Da von jedem Typ haploider Zellen gleich viele gemischt werden müssen, werden von jedem Stamm 8,5 x 105 Zellen hinzugefügt. Die Zellzahl wird auf der Grundlage von OD-Messungen berechnet, wobei 1 OD bei 600 nm als ungefähr äquivalent zu 1 x 107 Zellen34 angesehen wird. Wenn beispielsweise der OD600 der haploiden Suspension 0,17 und der der α haploiden 0,11 beträgt, kann die Anzahl der Zellen in 5 μL jeder haploiden Suspension berechnet werden. Um 8,5 x 105 Zellen jedes haploiden Typs zu gewährleisten, werden 1,25 μl der a-haploiden und 1,93 μl der α haploiden Suspensionen gemischt.</li>
	<li>Geben Sie die erforderlichen Mengen beider Haploide in eine frische und sterile 1,5-ml-Durchstechflasche und mischen Sie sie mit einer Pipette gut. Das Endvolumen dieser Suspension liegt in der Regel bei etwa 6–8 μL. Patchen Sie diese Suspension in das mittlere Gitter. Die Platte wird 7 h lang bei 30 °C inkubiert, damit die Haploiden genügend Zeit haben, sich zu paaren (Abbildung 2E).</li>
</ol>3. Plattierung von gemischten Zellen auf YPD-Agar
<ol><li>Nach der Inkubationszeit von 7 h kratzen Sie die Zellen mit einem Zahnstocher oder einer Pipettenspitze vom mittleren Rechteck ab und verdünnen Sie sie mit 2 ml sterilem Wasser. Verteilen Sie dann die Zellsuspension auf YPD-Agar, um einzelne Kolonien zu erhalten. Um den Verdünnungsfaktor zu bestimmen, der für die Gewinnung einzelner Kolonien erforderlich ist, messen Sie den Außendurchmesser des ersten Röhrchens, in das die geschabten Zellen gegeben werden. Für jeden verwendeten Zelltyp/Stamm müssen spezifische Verdünnungsfaktoren bestimmt werden. HINWEIS: Ein OD600 von 0,15 entspricht beispielsweise 3 x 106 Zellen in einer 2-ml-Suspension (unter Berücksichtigung von 1 OD = 1 x 107 Zellen/ml). Um einige hundert Kolonien auf der YPD-Platte zu erhalten, wird die Zellsuspension zweimal im Maßstab 1:20 seriell verdünnt und dann 100 μL der Endverdünnung zum Verteilen verwendet.</li>
	<li>Nach dem Ausplattieren werden die YPD-Platten bei 30 °C für 36–48 h inkubiert, bis einzelne Kolonien vorhanden sind. Stellen Sie sicher, dass aus jedem Paarungsexperiment einige hundert einzelne Völker für das Screening gewonnen werden, um sicherzustellen, dass die statistische Signifikanz in den Daten erkannt werden kann (Abbildung 2F).</li>
</ol>4. Screening auf Diploide mit auxotrophen Markern
<ol><li>Bestimmen Sie, welcher Anteil der erhaltenen Kolonien diploid ist. Um die diploiden Kolonien auf der Platte zu identifizieren, übertragen Sie die einzelnen Kolonien, indem Sie sie einzeln auf eine doppelte Drop-out-Platte (2 % Glukose, 0,66 % Stickstoffbase, 0,05 % doppelte Drop-out-Aminosäuremischung und 2 % Agar) übertragen, der die Aminosäuren fehlen, für die die Stämme auxotroph sind, wie in Abbildung 2G gezeigt. Die Platten bei 30 °C 48 h inkubieren. HINWEIS: Die Kolonien können auch mittels Nachbildung auf die doppelte Ausfallplatte übertragen werden. In dieser Studie wurde Tryptophan und Leucin (trp− leu−) Drop-out-Medium verwendet, um die Paarungseffizienz der SK1AM-Stämme zu quantifizieren, und Tryptophan und Uracil (trp− ura−) Drop-out-Medium wurde für die ScAM-Stämme verwendet. Nur die diploiden Kolonien wachsen auf der doppelten Drop-out-Platte, da sie beide auxotrophen Marker tragen: TRP1- und LEU2-Gene in den SK1AM-Stämmen und TRP1- und URA3-Gene in den ScAM-Stämmen.</li>
	<li>Zusätzlich werden die Kolonien auf einzelnen Drop-out-Medien (trp− oder leu− oder ura−) gestreift oder repliziert, um die Häufigkeit jeder der beiden Arten von Haploiden in der Population zu quantifizieren.</li>
	<li>Berechnen Sie den Steckwirkungsgrad η wie folgt: <img alt="Formel für die haploide Paarungseffizienz, η = Anzahl der haploiden Paarungen/Gesamtzahl der haploide, Gleichung." src="/files/ftp_upload/64596/64596eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">Gl (1) wobei die Anzahl der verpaarten Haploiden einfach doppelt so groß ist wie die Anzahl der Diploiden, die auf der doppelten Ausfallplatte identifiziert wurden (da jedes Diploid aus der Paarung zweier Haploiden resultierte). Die Gesamtzahl der Haploiden entspricht der Summe der Anzahl der gestreiften Haploiden plus der doppelten Anzahl der gestreiften Diploiden. ANMERKUNG: Wenn z. B. nur 60 Kolonien wachsen, nachdem 100 Kolonien auf einem doppelten Drop-out-Medium plattiert wurden, kann die Paarungseffizienz mit 75 % quantifiziert werden (da sich 60 x 2 Haploide paarten, um die 60 Diploiden zu bilden, und 40 Haploide sich nicht paarten).</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte an dieser Arbeit haben. Die Autoren freuen sich, die von SK1 abgeleiteten Stämme für alle gemeinnützigen Zwecke zur Verfügung zu stellen.

Die Quantifizierung der Paarungseffizienz in S. cerevisiae ist essentiell für die Durchführung von Studien zu den Genen, die an Paarungswegen beteiligt sind, oder für die Untersuchung des Einflusses der äußeren Umgebung auf das Paarungsverhalten. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich S. cerevisiae auch zu einem beliebten Modell entwickelt, um Fragen im Zusammenhang mit der Artbildung zu beantworten 14,36,37,38.</s...

Saccharomyces cerevisiae, umgangssprachlich als knospende Hefe bezeichnet, ist ein einzelliger Eukaryot. Es hat zwei Paarungstypen, einen und einen α, und weist sowohl asexuelle als auch sexuelle Fortpflanzungszyklen auf. Die Paarungstypen a und α sind haploide und können sich mitotisch teilen, wenn der andere Paarungstyp in der Umgebung fehlt, der den ungeschlechtlichen Zyklus der Hefe darstellt. Wenn sich die beiden Paarungstypen in unmittelbarer Nähe befinden, hören sie auf, sich mitotisch zu teilen, und verschmelzen zu einer diploiden Zelle. Die diploide Hefe kann sich entweder mitotisch teilen, wenn Nährstoffe vorhanden sind, oder sich unter den Bedingungen des Stickstoffmangels in Gegenwart einer schlechten, nicht fermentierbaren Kohlenstoffquelle, wie z. B. Acetat1, einer Meiose unterziehen. Dies führt zur Bildung von Sporen, die ruhen, bis günstige Wachstumsbedingungen herrschen. Der Lebenszyklus ist abgeschlossen, wenn diese Sporen keimen und die beiden haploiden Typen wieder in den haploiden Pool freigesetzt werden 2,3 (Abbildung 1).

Die Paarung von Hefezellen umfasst mehrere Schritte, wie z.B. die Agglutination, die Bildung eines Paarungsvorsprungs oder "Shmoo", gefolgt von der Zell- und Kernfusion 4,5. Die beiden Paarungstypen a und α erzeugen einen a-Faktor bzw. einen α-Faktor, um die Paarung einzuleiten. Bei diesen Faktoren handelt es sich um Polypeptidpheromone, die an die Rezeptoren (Ste2 und Ste3) binden, die auf der Zelloberfläche des entgegengesetzten Paarungstyps5 vorhanden sind. Die Bindung der Pheromone an die Rezeptoren initiiert den Pheromon-Antwortweg, den Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Signaltransduktionsweg 6,7,8. Dies führt zum Stillstand des Zellzyklus in der G1-Phase, was zu einer metabolisch aktiven stationären Phase9 führt. Die Zellen hören dann auf, sich mitotisch zu teilen, und die für die Paarung notwendigen Proteine werden synthetisiert. Da sich die haploiden Zellen nicht aufeinander zubewegen können, wird ein Paarungsvorsprung oder "Shmoo" auf den Paarungspartner gerichtet. Wenn die Zellen in Kontakt kommen, wird die Zellwand abgebaut und der zytoplasmatische Inhalt verschmilzt, was zur Paarung führt, um eine diploide Zellezu bilden 10,11. Die Paarungseffizienz zwischen Haploiden wurde als Maß für die Artbildung in im Labor entwickelten Stämmen sowie zwischen rezenten Arten verwendet12.

Als einfacher eukaryotischer Organismus ist Hefe das Modell der Wahl für eine Vielzahl von Forschungsfragen im Zusammenhang mit komplexen eukaryotischen Organismen. Eine dieser Fragen ist mit der Artbildung und der Evolution von Fortpflanzungsbarrieren verbunden13,14. Für sich sexuell fortpflanzende Organismen wird eine Art durch das von Ernst Mayr vorgeschlagene biologische Artkonzept (BSC) definiert15. Nach diesem Konzept werden zwei Individuen einer Population als zu zwei verschiedenen Arten gehörend bezeichnet, wenn sie sich nicht kreuzen können und fortpflanzungstechnisch isoliert sind. Der Zusammenbruch des sexuellen Fortpflanzungszyklus (der die Verschmelzung von Gameten zu einer Zygote, die Entwicklung der Zygote zu einer Nachkommenschaft und das Erreichen der Geschlechtsreife bei den Nachkommen umfasst) führt zu reproduktiver Isolation. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ist der Lebenszyklus von S. cerevisiae vergleichbar mit dem sexuellen Fortpflanzungszyklus: a) Die Verschmelzung der beiden Paarungstypen a und α ähnelt der Verschmelzung von Gameten in sich sexuell fortpflanzenden Organismen; b) die Fähigkeit des Diploiden zur mitotischen Teilung ist gleichbedeutend mit der Entwicklung der Zygote zu Nachkommen; und c) die diploide Sporulation ist vergleichbar mit dem Prozess der Gametogenese14.

Eine präzygotische Isolation tritt auf, wenn eine assortative Paarung beobachtet wird. Bei gleicher Chance, sich mit zwei genetisch unterschiedlichen a-Typen zu paaren, paart sich ein α-Typ bevorzugt mit dem einen oder umgekehrt14. Im Falle von Evolutionsexperimenten, in denen Haploide in verschiedenen Umgebungen entwickelt wurden, kann das Vorhandensein einer Prä-Paarungsbarriere durch die Durchführung eines Paarungstests bestimmt werden. Eine Abnahme der Paarungseffizienz im Vergleich zum Vorgänger deutet auf die Evolution einer Barriere vor der Paarung hin. Eine postzygotische Isolierung könnte aufgrund der Unfähigkeit des Diploiden entstehen, eine effektive mitotische Teilung und/oder Sporulation zu durchlaufen, um haploide Sporen zu bilden14. Diese können quantifiziert werden, indem die Wachstumsrate der Diploiden gemessen bzw. die Sporulationseffizienz berechnet wird. Um die Evolution reproduktiver Barrieren zu untersuchen, sind daher robuste Methoden zur Quantifizierung (a) der Paarungseffizienz, (b) des mitotischen Wachstums des Diploiden und (c) der Sporulationseffizienz des Diploiden erforderlich. In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz von Hefestämmen vorgestellt.

In Laborexperimenten kann das Auftreten von Paarungen unter anderem durch die Verwendung von auxotrophen Markern nachgewiesen werden, die den Nährstoffbedarf ergänzen. Wenn die beiden Paarungstypen für zwei verschiedene Aminosäuren auxotroph sind, kann nur die diploide Zelle, die durch die Fusion der beiden Paarungstypen gebildet wird, auf einem Medium wachsen, dem beide Aminosäuren fehlen. Daher sind auxotrophe Marker nützlich, um Paarungen sowohl qualitativ als auch quantitativ nachzuweisen. Ein qualitativer Test reicht aus, um den Paarungstyp eines Stammes nach Meiosezu bestimmen 16. Quantitative Tests sind unerlässlich, wenn man daran interessiert ist, eine Verringerung der Paarung zu identifizieren und gleichzeitig die Gene zu untersuchen, die am Paarungsweg beteiligt sind17,18. Da Hefe zunehmend in Artbildungsstudien verwendet wird, ist außerdem ein bequemer und reproduzierbarer Paarungstest erforderlich, da die Quantifizierung der Paarungseffizienz ein Maß für die präzygotische Barriere ist.

Die Paarungseffizienz zwischen den beiden Hefe-Paarungstypen wurde zuvor mit16,19,20 quantifiziert. Die meisten der bisher verwendeten Methoden sind in ihrem Aufbau ähnlich mit einigen Variationen 16,21,22,23,24,25. Einige von ihnen verwenden Kulturen der frühen logarithmischen Phase, während einige andere Kulturen der mittleren logarithmischen Phase haploider Stämme verwenden. Es gibt Variationen in den Verhältnissen, in denen die beiden Steckarten gemischt werden. Fast alle Protokolle verwenden eine Nitrozellulosemembran. Suspensionen beider Paarungstypen aus zuvor gezüchteten Kulturen werden gemischt und auf eine Nitrozellulosemembran filtriert, die auf einer YPD-Platte platziert ist. In einer der Varianten des Protokolls wird die haploide Suspension direkt auf eine YPD-Platte21 geflickt. In Experimenten, die sich mit den Genen befassen, die an der Pheromonproduktion der beiden Paarungstypen beteiligt sind, werden die Pheromone extern hinzugefügt, während die Suspensionen der beiden Paarungstypen24 gebildet werden.

Nach einer Inkubationszeit von einigen Stunden (typischerweise ca. 5 h) nach dem Mischen der Haploide werden die Zellen von der Membran abgewaschen, verdünnt und auf selektiven Medien plattiert. Bei einer der früheren Methoden, über die 1973 berichtet wurde, wurde die Effizienz der Zygotenbildung oder -paarung berechnet, indem die Anzahl der knospenden, nicht knospenden Zellen und Paarungspaare unter einem Mikroskop mit einem Hämozytometergezählt wurde 26. Die meisten Methoden, über die später berichtet wurde, verwenden jedoch auxotrophe Marker, um Haploide und Diploide zu unterscheiden. Die Paarungseffizienz wird berechnet als Prozentsatz der diploiden Zellen im Verhältnis zur Anzahl der diploiden und haploiden Zellen im Zellpool 16,21,23.

Trotz einer Reihe von Berichten, in denen Hefe als Modellorganismus zur Untersuchung der Artbildung verwendet wird, gibt es in der Literatur bisher kein standardisiertes Protokoll zur Berechnung der Effizienz der Paarung. Zellen in der logarithmischen Phase sind möglicherweise nicht ideal für die Quantifizierung der Paarungseffizienz. Während der Paarung wird der Zellzyklus der beiden Haploiden gestoppt, so dass sich die Zellen während der Paarung nicht teilen9. Da auch bekannt ist, dass der Zellzyklus in Zellen in der stationären Phase27 in ähnlicher Weise angehalten wird, kann die Verwendung solcher Zellen das Protokoll reproduzierbarer machen. Stationäre Phasenzellen können gemischt und zur Paarung auf YPD-Platten (d.h. in einer nährstoffreichen Umgebung) ausgelegt werden. Die herkömmlichen Verfahren erfordern zudem eine Nitrozellulose-Membran und das Abwaschen der Zellen, was den Prozess umständlich und anfällig für Handhabungsfehler macht. Darüber hinaus quantifizieren die bisher verwendeten Protokolle die Paarungseffizienz in Form von einem Haploiden. Bei der Messung der reproduktiven Isolation wird die Paarungseffizienz jedoch für eine bestimmte Kombination von Haploiden und nicht für einen einzelnen Haploiden quantifiziert.

Um diese Probleme anzugehen, stellen wir hier eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in Hefe vor, die hochgradig reproduzierbar und einfach anzuwenden ist. Darüber hinaus können diese Methode und die hier verwendeten Hefestämme auch in Studien eingesetzt werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Evolution von Paarungsbarrieren untersuchen.

In dieser Studie wurden zwei verschiedene Stämme von S. cerevisiae verwendet. Einer der Stämme stammt aus dem SK1-Hintergrund; Dies wurde in unserem Labor modifiziert, indem die auxotrophen Marker in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt wurden. Die resultierenden Genotypen der Haploiden sind in Tabelle 128,29,30 dargestellt. Im SK1-Stamm war das TRP1-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt, und beim α haploiden hatte das LEU2-Gen in der Nähe des MAT-Locus eingefügt. Im ScAM-Stamm wurden die TRP1- und URA3-Gene in die a- bzw. α-Haploiden eingefügt. Der Ort der Insertion befand sich in der ARS-Region des Chromosoms III (Chr III: 197378..197609). Für das hier beschriebene Protokoll würden auxotrophe Marker an einer beliebigen Stelle des Genoms ausreichen. Da sich die auxotrophen Marker jedoch in der Nähe des MAT-Locus befinden, können diese Stämme auch für Studien verwendet werden, die den Einfluss des Genflusses auf die Artbildung untersuchen31,32. Die Marker wurden in der Nähe des MAT-Locus hinzugefügt, um ein erneutes Mischen der Marker aufgrund von Rekombinationen zu verhindern. Daher kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Paarungseffizienz in Studien mit Artbildung zu quantifizieren und auch um die Veränderung der Paarungseffizienz bei der Untersuchung der am Paarungsweg beteiligten Proteine zu identifizieren.

<table><tbody><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Life Science</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Agar Pulver reguläre Qualität für die Bakteriologie</td><td>SRL</td><td>19661 (0140186)</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat, Hi-AR</td><td>HiMedia</td><td>GRM1273</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma Life Science</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glas Petriplatten</td><td>HiMedia</td><td>PW008</td><td>&nbsp; 90 mm x 15 mm Abmessung</td></tr><tr><td>L-Arginin</td><td>Sigma Life Science</td><td>A8094</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparaginsäure</td><td>Sigma Life Science</td><td>A7219</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidinmonochlorid-Monohydrat</td><td>Sigma Life Science</td><td>H5659</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Sigma Life Science</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Aldrich</td><td>62840</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>Sigma Life Science</td><td>M5308</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanin</td><td>Sigma Life Science</td><td>P5482</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosin</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8566</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin</td><td>Sigma Life Science</td><td>V0513</td><td></td></tr><tr><td>Paarung Wirkungsgradgitter</td><td></td><td></td><td>1 cm x 1,5 cm rechteckiges Gitter auf der Petriplatte gezeichnet</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Tarsons</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>HiMedia</td><td>RM001</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Life Science</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt Pulver</td><td>HiMedia</td><td>RM027</td><td></td></tr><tr><td>Hefestickstoffbase ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat</td><td>BD Difco</td><td>233520</td><td></td></tr></tbody></table>

bestimmung der paarungseffizienz von haploiden in saccharomyces cerevisiae

Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae ist ein weit verbreiteter Modellorganismus in Genetik, Evolution und Molekularbiologie. In den letzten Jahren hat es sich auch zu einem beliebten Modellorganismus entwickelt, um Probleme im Zusammenhang mit der Artbildung zu untersuchen. Der Lebenszyklus von Hefepilzen umfasst sowohl ungeschlechtliche als auch sexuelle Fortpflanzungsphasen. Die einfache Durchführung von Evolutionsexperimenten und die kurze Generationszeit des Organismus ermöglichen es, die Evolution von Fortpflanzungsbarrieren zu untersuchen. Der Wirkungsgrad, mit dem sich die beiden Steckarten (a und α) paaren, um das a/α-Diploid zu bilden, wird als Steckwirkungsgrad bezeichnet. Jede Abnahme der Paarungseffizienz zwischen Haploiden deutet auf eine präzygotische Barriere hin. Um das Ausmaß der reproduktiven Isolation zwischen zwei Haploiden zu quantifizieren, ist daher eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz erforderlich. Zu diesem Zweck wird hier ein einfaches und hochgradig reproduzierbares Protokoll vorgestellt. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte, darunter das Patchen der Haploiden auf einer YPD-Platte, das Mischen der Haploiden in gleicher Anzahl, das Verdünnen und Ausplattieren für einzelne Kolonien und schließlich die Berechnung der Effizienz basierend auf der Anzahl der Kolonien auf einer Drop-out-Platte. Auxotrophe Marker werden verwendet, um die Unterscheidung zwischen Haploiden und Diploiden klar zu machen.

Quantifizierung der Steckeffizienz der beiden Steckarten Das hier beschriebene Protokoll wurde verwendet, um die Paarungseffizienz zwischen zwei Hefestämmen zu quantifizieren - zwischen SK1AM a und SK1AM α und zwischen ScAMa und ScAMα (Abbildung 3A). In diesen Experimenten wurde die Paarung zwischen den beiden Haploiden mindestens 12 Mal wiederholt. In jeder Wiederholung des Experiments wurden mindestens ...

In dieser Arbeit wird eine robuste Methode zur Quantifizierung der Paarungseffizienz in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Diese Methode eignet sich besonders für die Quantifizierung präzygotischer Barrieren in Artbildungsstudien.

Bestimmung der Paarungseffizienz von Haploiden in Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae is a widely used model organism in genetics, evolution, and molecular biology. In recent years, it has also become a popular ...

Dieses Protokoll ist eine einfache Methode, um die Effizienz zu quantifizieren, mit der sich verschiedene Hefestämme und Hefearten miteinander paaren. Die vorgeschlagene Methode ist einfach, robust und effizient. Die Methode kann auf jeden Hefestamm ausgeweitet werden.Die in dieser Studie beschriebene Methode kann verwendet werden, um zu verstehen, wie Artbildung in Hefe abläuft. Darüber hinaus können die von uns beschriebenen Stämme besonders nützlich sein, um Experimente mit Genfluss zu entwerfen. Die Stärke der Methode ist, dass sie wirklich einfach ist.Einige geringfügige Anpassungen, wie z. B. die Inkubationszeit, können je nach verwendeter Sorte erforderlich sein. Beginnen Sie mit der Wiederbelebung der Haploiden A und Alpha aus gefrorenen Beständen, indem Sie das Hefeinokulum auf einen Hefeextrakt, Pepton, Dextrose oder eine YPD-Agarplatte streichen. Lassen Sie sie 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius wachsen, um einzelne Völker zu erhalten.Nach der Inkubation einzelne Völker von der YPD-Platte und fünf Milliliter YPD-Medium beimpfen und 48 Stunden bei 30 Grad Celsius mit 250 U/min schütteln. Nach dieser Inkubationszeit befinden sich die Zellen in der stationären Wachstumsphase. Zeichnen Sie auf einer frischen YPD-Platte ein 1 x 1,5 Zentimeter großes Rechteck, das in drei Kästchen mit einer Abmessung von jeweils 1 x 0,5 Zentimeter unterteilt ist.Impfen Sie fünf Mikroliter der YPD-Kultur der beiden Paarungstypen auf das Rechtecke ganz links und ganz rechts. Dieses Volumen entspricht etwa 5 mal 10 bis fünf haploiden Zellen in jedem Abschnitt. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius.Um eine gleiche Anzahl von Hefezellen zu mischen, entfernen Sie etwa 1/3 des Hefewachstums, das sich in den Umverpackungen entwickelt hat, mit einem sterilen Zahnstocher und resuspendieren Sie die entfernten Zellen in 20 Mikrolitern Wasser in einer sterilen 1,5-Milliliter-Durchstechflasche. Befolgen Sie dies für jeden Haploiden. Dann verdünnen Sie fünf Mikroliter dieser Suspension in zwei Millilitern Wasser und messen die optische Dichte mit einem Spektralphotometer bei 600 Nanometern.Basierend auf dem optischen Dichtewert und der Anzahl der Zellen pro Milliliter bei einer optischen Dichte werden die erforderlichen Volumina beider Haploide in ein frisches und steriles 1,5-Milliliter-Fläschchen gegeben. Mit einer Pipette gut mischen. Das Endvolumen dieser Suspension beträgt in der Regel etwa sechs bis acht Mikroliter.Als nächstes impfen Sie diese Suspension im mittleren Gitter. Inkubieren Sie die Platte sieben Stunden lang bei 30 Grad Celsius, damit sich die Haploiden paaren können. Nach siebenstündiger Inkubationszeit kratzen Sie die Zellen mit einem Zahnstocher oder einer Pipettenspitze aus dem mittleren Rechteck ab und verdünnen sie in zwei Millilitern sterilem Wasser.Führen Sie weitere Verdünnungen durch und verteilen Sie dann die Zellsuspension auf YPD-Agar, um einzelne Kolonien zu erhalten. Nach dem Ausplattieren werden die YPD-Platten bei 30 Grad Celsius für 36 bis 48 Stunden inkubiert, um einzelne Kolonien zu entwickeln. Stellen Sie sicher, dass aus jedem Paarungsexperiment einige hundert einzelne Völker für das Screening gewonnen werden, um die statistische Signifikanz der Daten sicherzustellen.Um die diploiden Kolonien auf der Platte zu identifizieren, übertragen Sie die einzelnen Kolonien, indem Sie sie einzeln auf eine doppelte Ausfallplatte streifen, wobei die Aminosäuren fehlen, für die die Stämme auxotroph sind. Inkubieren Sie die Platten bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden und berechnen Sie die Steckeffizienz, nu. Die Robustheit des Protokolls ermöglichte eine einfache Unterscheidung der Paarungseffizienz zwischen den beiden Stämmen SK1AM und ScAM.Während die SK1-Stämme mit einem sehr hohen Wirkungsgrad gepaart wurden, paarten sich die ScAM-Stämme mit einem relativ geringeren Wirkungsgrad. Die Paarungseffizienz der ScAM-Stämme sank signifikant, wenn die Umgebung keine Glukose als primäre Kohlenstoffquelle enthielt, was darauf hindeutet, dass die Paarung ein energetisch teurer Prozess ist und das Wachstum auf alternativen Kohlenstoffquellen die Effizienz der Paarung qualitativ verringert. Wenn man sie für unterschiedliche Zeiträume paaren durfte, wurde in den ersten vier bis fünf Stunden keine Paarung beobachtet.Die ersten Diploiden traten erst nach vier bis fünf Stunden auf, was darauf hindeutet, dass dies die Zeit ist, die benötigt wird, um den Paarungsprozess in der gegebenen Umgebung abzuschließen. Danach stieg die Steckeffizienz rapide an. Nach sieben Stunden wurden die Berechnungen der Paarungseffizienz durch die Tatsache beeinflusst, dass das mitotische Wachstum auf der Platte begann.Stellen Sie sicher, dass die gleiche Anzahl beider Haploide gemischt wird. Abweichungen hiervon würden zu Variationen in unabhängigen Wiederholungen des Protokolls führen. Wie sich der Genfluss auf Anpassung und Artbildung auswirkt, ist eine offene Frage.Da die auxotrophen Marker in unseren Stämmen neben dem MAT-Locus eingefügt werden, hilft dies, diese wichtige Frage zu beantworten.

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