Name: Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Lernen Sie die Differenzierung von braunen Adipozyten aus interscapulärem Fettgewebe neugeborener Mäuse. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Studien zur Adipogenese und Thermogenese für die Adipositas-Forschung.

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Die Finanzierung erfolgte durch FONDECYT (1181214 und 1221146) und Anillos (ACT210039) für VC- und Doktorandenstipendien ANID 21171743 für AMF und ANID 21150665 für FS. Wir danken Alejandro Munizaga für die Hilfe bei der Bearbeitung der Proben und die technische Beratung für die Transmissionselektronenmikroskopie. Die Illustrationen wurden mit BioRender erstellt.

Die Tierverfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung an der Pontificia Universidad Católica de Chile genehmigt. Für diese Studie wurden P0,5 neugeborene Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet, die aus einem gemischten Hintergrund von C57BL/6J- und 129J-Stämmen stammten.
1. Entnahme von Gewebe
<ol><li>Reinigen und desinfizieren Sie die Werkbank mit einer 70%igen Ethanollösung und verwenden Sie steriles chirurgisches Material.</li>
	<li>Einschläferung von P0,5-Neugeborenen durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere nach institutionell anerkanntem Protokoll.</li>
	<li>Platzieren Sie die Maus in Bauchlage (mit dem Gesicht nach unten) und machen Sie mit einer scharfen Schere einen 1 cm langen Schnitt in die Haut in der Mitte des Rückens des Tieres. Entfernen Sie vorsichtig die Haut. HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, denn wenn die Haut nicht gut entfernt wird, kann dies die iBAT zerreißen und beschädigen und die optimale Vorbereitung des SVF verhindern.</li>
	<li>Lösen Sie die iBAT mit einer kleinen Schere chirurgisch von der Karkasse. HINWEIS: Die iBAT wird als zwei Fettläppchen visualisiert, die unabhängig voneinander entfernt werden können.</li>
	<li>Entnehmen Sie beide iBAT-Lappen, indem Sie die Lappen mit einer Zange mit gebogener Spitze unabhängig voneinander entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die beiden Lappen in ein Kunststoffröhrchen mit 1,5 mL sterilem PBS bei Raumtemperatur. Bewahren Sie das Gewebe in den einzelnen Röhrchen auf, bis die Gewebeentnahme für alle benötigten Welpen abgeschlossen ist.</li>
</ol>2. Verdauung des Gewebes
<ol><li>Aliquot 300 μl Kollagenase Typ II Verdauungspuffer (0,2 % Typ II Kollagenase im Puffer [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM Glukose, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5 % BSA und 1 % Penicillin/Streptomycin, bei pH 7,4]) (Tabelle 1) in 1,5 ml Röhrchen. HINWEIS: Bereiten Sie ausreichend Röhrchen für die Anzahl der einzelnen Gewebe vor, die entnommen werden sollen. In der vorliegenden Studie wurden sieben Schläuche verwendet, was einem Wurf von sieben Welpen entspricht.</li>
	<li>Stellen Sie sich auf die Bank und legen Sie die iBAT-Lappen in einen Kollagenase-Typ-II-Verdauungspuffer, um die extrazelluläre Matrix abzubauen.</li>
	<li>Inkubieren Sie das iBAT-Gewebe 45 Minuten lang bei 37 °C und schütteln Sie es kontinuierlich sanft bei 800 U/min (Abbildung 1).</li>
</ol>3. Gewebe-Verarbeitung
HINWEIS: Führen Sie nach dem Aufschluss alle folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube der Klasse II durch.
<ol><li>Bereiten Sie zwei Sätze 1,5-ml-Kunststoffröhrchen für jede einzelne Probe vor und beschriften Sie sie.</li>
	<li>Unterbrechen Sie mechanisch die Gewebesuspension im Kollagenase-Typ-II-Verdauungspuffer, indem Sie mit einer P1.000-Mikropipette und filtrierten Spitzen auf und ab pipettieren. Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe mit der Spitze mechanisch disaggregiert wird und pipettieren Sie auf und ab, bis die makroskopische Homogenisierung abgeschlossen ist.</li>
	<li>Das disaggregierte Gewebe wird durch einzelne 100-μm-Zellsiebe (siehe Materialtabelle) in neue 1,5-ml-Röhrchen geleitet.</li>
	<li>Geben Sie 500 μl ACK-Puffer (siehe Materialtabelle) zu den gefilterten Gewebeproben, drehen Sie die Röhrchen 4-5 Mal um und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang bei Raumtemperatur. HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Inkubationszeit, da dies die interessierenden Zellen beschädigen kann.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, Antimykotikum, pH 7,2) (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie die Suspensionen mit einer P1.000-Mikropipette und filtrierten Spitzen durch ein 40-μm-Zellsieb in neue 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die Proben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. HINWEIS: Das Pellet entspricht dem Präadipozyten-haltigen SVF.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und resuspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren in 1 ml Kulturmedium.</li>
	<li>Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen für jede Probe vor, indem Sie 5 ml Kulturmedium hinzufügen.</li>
	<li>Geben Sie jedes resuspendierte Pellet in das entsprechende 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Nährmedium. Drehen Sie das Röhrchen 4-5 Mal um, um den Zellinhalt zu mischen.</li>
	<li>Säen Sie jede Probe in sechs Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte aus, indem Sie 1 ml der Suspension in jede Vertiefung geben (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Kultur der stromalen vaskulären Fraktion (SVF)
<ol><li>Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreicht haben. HINWEIS: Während dieser Zeit werden nicht-plastische adhärente Zellen entfernt, was zu einer Primärkultur führt, die mit einem Präadipozyten-haltigen SVF angereichert ist.</li>
	<li>Wenn die Zellen zu 100 % konfluent sind, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit 800 μl sterilem PBS.</li>
	<li>Geben Sie 150 μl 0,25 % Trypsin-EDTA (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und stellen Sie die Kulturplatte für 3 Minuten in den Inkubator, um die Zellen abzulösen. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen mit einem Phasenkontrastlichtmikroskop abgetrennt sind.</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 850 μl Kulturmedium in jede Vertiefung geben.</li>
	<li>Entnehmen Sie die Zellen aus den sechs Vertiefungen, die in Schritt 3.12 ausgesät wurden, und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 12 ml, indem Sie 6 mL Nährmedium hinzufügen. Drehen Sie das Rohr 4-5 Mal um, um den Inhalt zu mischen.</li>
	<li>1 ml der Probe in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte aussäen. Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, bis die Zellen die Konfluenz erreichen.</li>
	<li>Wenn die Zellen zu 100 % konfluent sind, lösen Sie sie mit 150 μl 0,25 % Trypsin-EDTA unter den gleichen Inkubationsbedingungen wie in Schritt 4.3 ab und säen Sie sie entsprechend der für das Experiment erforderlichen Oberfläche der Vertiefung aus.</li>
	<li>Führen Sie eine hochauflösende Bildgebung durch, nachdem Sie die Zellen gemäß Schritt 8 fixiert haben. HINWEIS: Für weitere Experimente wird eine Dichte von 35.000 Zellen/cm² empfohlen (Protein- und Gesamt-RNA-Extraktion, 330.000 Zellen [eine Vertiefung einer 6-Well-Platte]; Immunfluoreszenz [IF], 10.500 Zellen [eine Vertiefung einer 96-Well-Platte]).</li>
</ol>5. Adipogene Differenzierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Zellen mit Induktionsmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, Antimykotikum, pH 7,2, ergänzt mit 500 nM Dexamethason, 125 nM Indomethacin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX], 5 μM Rosiglitazon, 1 nM T3 und 20 nM Insulin) (Tabelle 1) für 72 h (Tag 0 bis Tag 2) (Abbildung 2). HINWEIS: Der Nährboden muss alle zwei Tage gewechselt werden. Der erste Mediumwechsel muss also am Tag 2 nach der ersten Induktion erfolgen.</li>
	<li>Wechseln Sie an Tag 3 zu einem Erhaltungsmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, pH 7,2, ergänzt mit 5 μM Rosiglitazon, 1 nM T3 und 20 nM Insulin) (Tabelle 1) und halten Sie dieses Erhaltungsmedium bis zum Tag 7 aufrecht (Abbildung 2). HINWEIS: Das Wartungsmedium muss an Tag 5 und Tag 7 gewechselt werden. Kleine Lipidtröpfchen können ab dem 3. Tag der Differenzierung durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht werden. Große Lipidtröpfchen sind am 7. Tag der Differenzierung sichtbar. Differenzierungsverfahren, die länger als 7 Tage dauern, führen zu Zellverlust durch Ablösung, wahrscheinlich aufgrund des hohen Auftriebs der lipidbeladenen Zellen.</li>
</ol>6. Herstellung des zellulären Homogenats
<ol><li>Entfernen Sie das Kulturmedium an Tag 0 und Tag 7 der Differenzierung und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit sterilem PBS.</li>
	<li>Geben Sie nach der letzten Reinigung 1,3 ml steriles PBS in jede Vertiefung. HINWEIS: Halten Sie die Zellen bis zur Reinigung der letzten Platte im Eis.</li>
	<li>Ernten Sie die Zellen mechanisch aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte (~330.000 Zellen) mit einem Zellschaber und geben Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.800 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das PBS mit einer Mikropipette und halten Sie die Röhrchen auf Eis.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das zelluläre Pellet in RIPA-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. HINWEIS: Um das zelluläre Pellet zu lysatieren, sind 70-80 μl ausreichend.</li>
	<li>Die Proben werden bei 21.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand zu einem 1,5-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet. HINWEIS: Der Überstand stellt das zelluläre Homogenat dar.</li>
	<li>Bestimmung der Proteinkonzentration des zellulären Homogenats unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) für den kolorimetrischen Nachweis und die Quantifizierung des Gesamtproteins18,19.</li>
</ol>7. Westliche Blotting
<ol><li>Bereiten Sie 30 μg des zellulären Homogenats (aus Schritt 6.8) vor und fügen Sie den im Handel erhältlichen SDS-PAGE-Probenladepuffer hinzu (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>In Polyacrylamid-Gelelektrophorese-SDS20 (PAGE-SDS) entsprechend dem Molekulargewicht jedes Proteins auflösen. HINWEIS: Verwenden Sie 10 % PAGE-SDS für PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 und UCP1, 12 % PAGE-SDS für OXPHOS und 15 % PAGE-SDS für TOM20 (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Übertragen Sie die Proteine für 2 h bei 350 mA auf die PVDF-Membran (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Der Eisbehälter muss nach 1 h gewechselt werden. Halten Sie die Kammer während des gesamten Vorgangs auf Eis.</li>
	<li>Blockieren Sie die Membranen mit 5 % BSA oder fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) 0,1 % Tween 20 (TBS-T) für 2 h gemäß den Empfehlungen aus den Datenblättern der Antikörper.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit den Primärantikörpern (die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt) über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Alle in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden in Blockierungslösung auf 1:1.000 verdünnt.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit 0,1 % TBS-T und inkubieren Sie sie mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit 0,1%. TBS-T. Führen Sie eine letzte Wäsche mit 1x TBS durch und lagern Sie die Membranen bis zur Visualisierung in 1x TBS. Eine Lagerung von maximal 1 h wird empfohlen.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Membranen durch Chemilumineszenz20 oder eine andere bevorzugte Methode.</li>
</ol>8. Hochauflösende Bildgebung
<ol><li>Führen Sie den Immunfluoreszenz-Assay mit den folgenden Schritten durch.<ol><li>Die Primärkulturen von braunen Präadipozyten von P0,5-neugeborenen Mäusen (nach Schritt 4.8) in 96-Well-Platten mit optischem Boden aussäen und differenzieren (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Fixieren Sie die Zellen am Tag 0 und 7 der Differenzierung mit 4% PFA für 20 min und waschen Sie sie 3 Mal mit sterilem PBS.</li>
		<li>Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 für 15 min und blockieren Sie sie mit 3 % Fischgelatine (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>3-mal mit sterilem PBS waschen und mit PLIN1-Antikörper (1:400, siehe Materialtabelle) in 1 % BSA/PBS über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.</li>
		<li>3-maliges Waschen mit sterilem PBS und Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern bei 1:1.000 (1 % BSA/PBS) (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Die Zellkerne mit 1 μg/mL Hoechst 33342 und die Lipidtröpfchen mit 1 μg/mL BODIPY für 30 min bei Raumtemperatur einfärben. HINWEIS: Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zellbildgebungssystem aufgenommen (siehe Materialtabelle). Insgesamt wurden 9 bzw. 16 Fotos pro Vertiefung mit zwei bis drei Kanälen mit einer 20-fachen Vergrößerung aufgenommen.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Transmissionselektronenmikroskopie mit den folgenden Schritten durch.<ol><li>Züchten und differenzieren Sie die braunen Präadipozyten in 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschalen.</li>
		<li>Am Tag 0 und Tag 7 der Differenzierung das Medium entfernen und die Zellen 1 h lang mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,0 fixieren (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer für 10 min und behandeln Sie sie 15 min lang mit 1% wässrigem Osmiumtetroxid (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit bi-destilliertem Wasser für 5 min und behandeln Sie sie 15 min lang mit 1% wässrigem Uranylacetat (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Zellen mit einem Ethanolgradienten von 30%, 50%, 70%, 95% und 100% für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Betten Sie die Zellen 30 min lang in 1:1 Epon/Ethanol und anschließend 1 h in Epon ein (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Der Einschluss der Zellen erfolgt direkt in der Schale, indem frisches Epon hinzugefügt wird, um die gesamte Zellkultur-Monoschicht zu bedecken. Lassen Sie das Epon im Backofen bei 60 °C 24 h polymerisieren.</li>
		<li>Tauchen Sie die Zellkulturschale 2 Minuten lang in flüssigen Stickstoff und brechen Sie sie dann mit einer Zange, um den Kunststoffeinschluss zu lösen.</li>
		<li>Kleben Sie die Einschlusssegmente mit Zellen auf einen Harzblock, um feine Schnitte (80 nm) parallel zur Oberfläche in einem Ultramikrotom zu erhalten (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Färben Sie die Schnitte 4 min lang mit 1% wässrigem Uranylacetat und 5 min mit Bleicitrat ein, so Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualisieren Sie die Gitter in einem Elektronenmikroskop (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Zennaro, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hibernoma+development+in+transgenic+mice+identifies+brown+adipose+tissue+as+a+novel+target+of+aldosterone+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hibernoma development in transgenic mice identifies brown adipose tissue as a novel target of aldosterone action.</a> The Journal of Clinical Investigation. 101 (6), 1254-1260 (1998).</li>
<li>Klaus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+novel+brown+adipocyte+cell+line+HIB+1B.+Adrenergic+pathways+involved+in+regulation+of+uncoupling+protein+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of the novel brown adipocyte cell line HIB 1B. Adrenergic pathways involved in regulation of uncoupling protein gene expression.</a> Journal of Cell Science. 107 (1), 313-319 (1994).</li>
<li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das vorliegende Protokoll ist ein einfaches und replizierbares zweiphasiges Differenzierungsverfahren (Abbildung 2) zur Erzeugung von Zellen mit den molekularen und morphologischen Eigenschaften reifer brauner Adipozyten. Die chirurgische Entnahme des iBAT ist der erste kritische Schritt, da das Einreißen des Gewebes die Lebensfähigkeit des Ausgangsmaterials stark einschränkt. Die Gewebeaufbereitung ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da eine homogene Zellsuspension, die frei von Abl...

Weißes und braunes Fettgewebe unterscheiden sich in ihrer anatomischen Lage, ihrem zellulären Ursprung, ihrer Funktion, ihrer Morphologie und ihrer Gesamtmasse. Weißes Fettgewebe (WAT) ist das wichtigste physiologische Energiereservoir des Körpers und speichert große Mengen an Triacylglycerin (TAG) in hochspezialisierten Zellen, die ein einzelnes riesiges Lipidtröpfchen haben, das den größten Teil ihres Zellvolumens einnimmt1. Bei der TAG-Lipolyse werden freie Fettsäuren freigesetzt, die in den systemischen Kreislauf gelangen, um den Energiebedarf während des Fastens oder anderer Zustände negativer Energiebilanz zu decken. Darüber hinaus sezerniert das WAT Protein- und Lipidprodukte, die als Adipokine bzw. Lipokine bezeichnet werden und metabolische, immunologische und reproduktive regulatorische Funktionen haben, wodurch das WAT zum größten endokrinen Gewebe im Körper wird2.
Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein viel kleineres Organ, dessen physiologische Hauptfunktion die nicht zitternde Thermogenese ist, um eine Unterkühlung zu verhindern. Bei Mäusen und neugeborenen Menschen ist BAT ein gut definiertes Organ, das sich im Zwischenschulterraum befindet. Erwachsenen Menschen fehlt die interscapuläre BAT (iBAT); Nichtsdestotrotz entwickeln sie Cluster von braunen Adipozyten-ähnlichen Zellen, die in Depots integriert sind, die sonst hauptsächlich WAT umfassen. Diese "Brown-in-White"-Adipozyten (Brite) haben morphologische und molekulare Merkmale mit den klassischen iBAT-Adipozyten gemeinsam, haben jedoch einen anderen zellulären Ursprung 3,4.
Im Gegensatz zu weißen Adipozyten haben braune Adipozyten mehrere kleine Lipidtröpfchen und reichlich Mitochondrien5. Das Entkopplungsprotein 1 (UCP1, auch bekannt als Thermogenin) wird ausschließlich von braunen und britischen Adipozyten exprimiert und vermittelt die Protonenleckage in der inneren Mitochondrienmembran (IMM), wodurch der Elektronentransport von der ATP-Synthese entkoppelt und Wärme erzeugt wird. Die nicht zitternde Thermogenese in BAT wird durch Noradrenalin (NE) aktiviert, das als Reaktion auf die Kältestimulation aus den sympathischen Enden in der BAT freigesetzt wird6. NE bindet an beta-Adrenozeptoren (meist Beta 3) auf der Oberfläche brauner Adipozyten und löst eine intrazelluläre cAMP-vermittelte Signalkaskade aus. Dies führt zur TAG-Lipolyse, der Beta-Oxidation mitochondrialer Fettsäuren, und zur Wärmeerzeugung bei UCP1-Aktivierung3. Die enge funktionelle Beziehung zwischen Lipidtröpfchen und Mitochondrien in braunen Adipozyten weist strukturelle Parallelen auf, wie z. B. die Wechselwirkung zwischen diesen Organellen in Bereichen, die groß sind und einen sehr engen physischen Kontakt haben 7,8.
iBAT hat reichlich Blutgefäße und sympathische Endungen9. Diese Strukturen bilden zusammen mit den Präadipozyten, Immunzellen, Fibroblasten und extrazellulären Matrixmolekülen die fette stromale vaskuläre Fraktion (SVF)10. Es wurde berichtet, dass viele Protokolle reife Adipozyten aus den Präadipozyten 11,12,13,14,15 erzeugen (Ergänzende Tabelle 1); Dennoch weisen sie extreme Unterschiede in der Gewebeverarbeitung und der Zusammensetzung der Differenzierungskulturmedien auf. Das hierin beschriebene Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Differenzierung von braunen Adipozyten, die (1) die wichtigsten adipogenen Transkriptionsfaktoren Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma (PPARγ) und CCAAT/Enhancer-bindendes Protein alpha (C/EBPα) exprimieren, (2) die reifen Adipozytenmarker perilipin1 (PLIN1) und Cluster-Determinante 36 (CD36) exprimieren, (3) reichlich Lipidtröpfchen akkumulieren, (4) eine hohe mitochondriale Masse und eine hohe Häufigkeit von OXPHOS-Komplexen aufweisen, (5) haben ein thermogenes Potenzial, das durch hohe UCP1-Spiegel bestimmt wird, und (6) weisen mitochondriale morphologische Veränderungen auf, die mit dem Phänotyp reifer brauner Adipozyten verbunden sind. Diese Methodik wird verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der generalisierten Lipodystrophie zugrunde liegen 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x Tris/Glycin-Puffer</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>35 mm TC-behandelte Easy-Grip Style Zellkulturschale</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte&nbsp;</td><td>SPL Life Science&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>96 Well optisches Schwarz mit Deckel steril</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>AccuRuler RGB Plus vorgefärbte Proteinleiter&nbsp;</td><td>Maöstrogen</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing-Puffer&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotikum</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper&nbsp; &nbsp;</td><td>Zellsignalisierung</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Blocker in Blotting-Qualität&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alpha; Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>208291</tr><tr><td>CD36 Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro; m, Nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m, Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, Pulver</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>Merck&nbsp;</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Kaltwasserfischhaut</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd 25% wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteasehemmer Cocktail 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Invitrogen</td><td>H1398</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membran&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I7378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Lane Marker zur Reduzierung des Probenpuffers&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ wassersteril&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofil Gesamt OXPHOS Nagetier WB Antikörper Cocktail Abcam</td><td>&nbsp;</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>1064041000</tr><tr><td>OmniPur&nbsp; 10x PBS Flüssigkonzentrat</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Osmiumtetroxid&nbsp;</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin 1 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR & gamma; (81B8)</td><td>Antikörper-Zell-Signalisierung</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Puffer-Lyse&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazon</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcacpdylat-Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS-10X)</td><td>Zellsignalisierung</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Molekularbiologisches</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5152</td><td></td></tr><tr><td>UCP1 Antikörper</td><td>Zell-Signalisierung</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uranylacetat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sonne &nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Westar Supernova&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

differenzierung und bildgebung von braunen adipozyten aus der stromalen vaskulären fraktion des interscapularen fettgewebes von neugeborenen mäusen

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Braunes Fettgewebe (BVT) kommt nur bei Säugetieren vor und hat eine thermogene Funktion. Braune Adipozyten zeichnen sich durch ein multilokuläres Zytoplasma mit mehreren Lipidtröpfchen, einen zentralen Kern, einen hohen mitochondrialen Gehalt und die Expression des Entkopplungsproteins 1 (UCP1) aus. Die BVT wurde als potenzielles therapeutisches Ziel für Adipositas und die damit verbundenen Stoffwechselstörungen vorgeschlagen, da sie in der Lage ist, Stoffwechselenergie in Wärme abzuleiten. Um die Funktion und Regulation der BAT zu untersuchen, ist die Kultivierung der braunen Adipozyten unerlässlich. Das vorliegende Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von braunen Adipozyten aus neugeborenen Mäusen. Darüber hinaus werden Verfahren zur Bildgebung differenzierter Adipozyten sowohl mit konfokaler Immunfluoreszenz als auch mit Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt. In den braunen Adipozyten, die mit den hierin beschriebenen Techniken differenziert wurden, bleiben die wichtigsten definierenden Merkmale der klassischen BVT erhalten, einschließlich hoher UCP1-Spiegel, erhöhter mitochondrialer Masse und sehr engem physikalischem Kontakt zwischen den Lipidtröpfchen und Mitochondrien, was diese Methode zu einem wertvollen Werkzeug für BVT-Studien macht.

Die Adipogenese wird durch ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren reguliert, die sowohl für die Expression von Schlüsselproteinen verantwortlich sind, die die Bildung und Funktion von braunen Adipozyten induzieren22, einschließlich klassischer adipogener Regulatoren wie PPARγ und C/EBPα 23,24,25, sowie Marker reifer Adipozyten 26,27. Durch das Te...

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Differenzierung von braunen Adipozyten, die wichtige adipogene Transkriptionsfaktoren und reife Adipozytenmarker exprimieren und das thermogene Potenzial und den morphologischen Phänotyp reifer brauner Adipozyten aufweisen. Dabei handelt es sich um ein einfaches und replizierbares zweiphasiges Differenzierungsverfahren, um Zellen mit Eigenschaften reifer brauner Adipozyten aus interscapularem braunem Fettgewebe neugeborener Mäuse zu gewinnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Aktivierungsmechanismen des braunen Fettgewebes als Ziel für die Behandlung von Fettleibigkeit.Es war ein Modell für die Bestimmung der Mechanismen, die an der Pathophysiologie der Lipodystrophie beteiligt sind. Es wird erwartet, dass es eine Herausforderung sein wird, diese Technik zum ersten Mal durchzuführen. Es ist wichtig, ein detailliertes Protokoll zu haben und kritische Punkte hervorzuheben, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.Zu Beginn bringen Sie die eingeschläferte Maus in Bauchlage und machen Sie mit einer scharfen Schere einen einen Zentimeter langen Hautschnitt in der Mitte des Rückens des Tieres. Entfernen Sie vorsichtig die Haut, lösen Sie das iBAT mit einer kleinen Schere operativ vom Kadaver. Ernten Sie beide iBAT-Lappen mit einer Kurvenzange, um die Lappen unabhängig voneinander zu entfernen.Legen Sie die beiden Lappen in ein Kunststoffröhrchen mit 1,5 Millilitern sterilem PBS bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie das iBAT-Gewebe 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer mit kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 800 U/min. Unterbrechen Sie mechanisch die Gewebesuspension im Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer, indem Sie mit einer P1000-Mikropipette und Filterspitzen auf und ab pipettieren.Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. Führen Sie das entsegregierte Gewebe durch einzelne 100-Mikrometer-Zellsiebe in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter ACK-Puffer zu den gefilterten Gewebeproben.Die Röhrchen vier- bis fünfmal umdrehen und vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden die Suspensionen mit einer P1000-Mikropipette und filtrierten Spitzen durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen geleitet. Durch Zentrifusion wird das Pellet wie im Textmanuskript beschrieben resuspendiert.Säen Sie dann jede Probe in sechs Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte aus, indem Sie jeweils einen Milliliter der Suspension in jede Vertiefung geben. Die undifferenzierten Präadipozyten wiesen sehr niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel von ppar-gamma, C/ebp-alpha, Perilipin 1 und CD36 auf. Im Gegensatz dazu waren diese Marker am siebten Tag der Differenzierung signifikant höher.Die Akkumulation mehrerer Lipidtröpfchen in den braunen Präadipozyten stimmte mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen überein. Ein signifikanter Anstieg des mitochondrialen Massenmarkers TOM 20 und des Proteinspiegels des oxidativen Phosphorylierungskomplexes wurde am siebten Tag der Differenzierung beobachtet. UCP1, ein bonafide-Marker dieses Zelltyps, wurde in undifferenzierten Präadipozyten nicht nachgewiesen, während er in reifen braunen Adipozyten am siebten Tag der Differenzierung im Wesentlichen exprimiert wurde.Die Mitochondrien entwickelten sich von einer länglichen, röhrenförmigen Form am Tag Null zu einer abgerundeten oder bohnenartigen Form am siebten Tag. Die mitochondriale innere Struktur wurde ebenfalls durch Adipogenese verändert, was zu einer höheren Dichte der parallel gepackten Kristalle führte. Wichtig ist, dass die Mitochondrien eng mit den Lipidtröpfchen in den differenzierten braunen Adipozyten verbunden waren, so dass selbst mit hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie kein erkennbarer Abstand zwischen der äußeren Membran der Mitochondrien und den Oberflächen der Lipidtröpfchen nachgewiesen werden konnte.Die chirurgische Entfernung von interscapulärem Fettgewebe ist von entscheidender Bedeutung. Eine ineffiziente Menge an Gewebe schränkt die Verfügbarkeit von Zellen ein, die differenziert werden sollen. Dieses bildgebende Verfahren hilft bei der Charakterisierung der Morphologie differenzierter brauner Adipozyten in vitro.Es ist möglich, Assays für die mitochondriale Funktion, die beta-androgene Aktivierung und die autophagische Hemmung durchzuführen.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur funktionellen Bildgebung von Maus braunen Fettgewebe (BAT) beschrieben, bei dem kalte-stimulierte Aufnahme von 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT nichtinvasiv beurteilt mit einer standardisierten micro-PET/CT Protokoll ist. Diese Methode ist robust und sensibel auf Unterschiede in der BAT-Aktivitäten in Maus-Modellen erkennen.

Funktionelle Bildgebung Brown Fat in Mäusen mit FDG micro-PET/CT

Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

In diesem Videobericht zeigen wir die Anwendung von Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) für interscapulares braunes Fettgewebe bei Mäusen unter aktivierten und depressiven Bedingungen.

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG), Positronenemissionstomographie / Computertomographie (PET-CT) und Fett-Wasser getrennt, Magnetresonanztomographie (MRI), die jeweils folgende 2 h Einwirkung thermo (24 ° C gescannt ) und kalten Bedingungen (17 ° C), um braune Fettgewebe (BAT) bei erwachsenen menschlichen Patienten abzubilden.

Menschen braunes Fettgewebe Depots automatisch durch Positronenemissionstomographie / Computertomographie Segmentierte und Registrierte Magnetic Resonance Images

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur gleichzeitigen Isolierung von primären braunen und weißen Präadipozyten von neugeborenen Mäusen. Isolierte Zellen können in Kultur gezüchtet und dazu gebracht werden, sich in voll ausgereifte weiße und braune Adipozyten zu differenzieren. Die Methode ermöglicht die genetische, molekulare und funktionelle Charakterisierung primärer Fettzellen in Kultur.

Isolierung und Differenzierung primärer weißer und brauner Präadipozyten von neugeborenen Mäusen

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Funktionelle Bildgebung und Quantifizierung von thermogenen Fettdepots in Mäusen mit einem mikro-PET/MR-bildgebenden Ansatz.

Visualisierung und Quantifizierung von braunem und beigem Fettgewebe in Mäusen mittels [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Messung der Aktivität von braunem Fettgewebe nach einer Mahlzeit bei Menschen und Versuchstieren vor.

Infrarot-Thermografie zur Detektion von Veränderungen der Aktivität des braunen Fettgewebes

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Hier bieten wir ein praktisches Verfahren zur Präparierung und Durchführung histologischer und Genexpressionsanalysen von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe.

Dissektion, histologische Verarbeitung und Genexpressionsanalyse von murinem supraklavikulärem braunem Fettgewebe

Lernen Sie die Differenzierung von braunen Adipozyten aus interscapulärem Fettgewebe neugeborener Mäuse. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare Studien zur Adipogenese und Thermogenese für die Adipositas-Forschung.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen (Video) | JoVE Journal

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

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