Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen
3. Februar 2023
Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.
Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Differenzierung von braunen Adipozyten, die wichtige adipogene Transkriptionsfaktoren und reife Adipozytenmarker exprimieren und das thermogene Potenzial und den morphologischen Phänotyp reifer brauner Adipozyten aufweisen. Dabei handelt es sich um ein einfaches und replizierbares zweiphasiges Differenzierungsverfahren, um Zellen mit Eigenschaften reifer brauner Adipozyten aus interscapularem braunem Fettgewebe neugeborener Mäuse zu gewinnen. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Aktivierungsmechanismen des braunen Fettgewebes als Ziel für die Behandlung von Fettleibigkeit.
Es war ein Modell für die Bestimmung der Mechanismen, die an der Pathophysiologie der Lipodystrophie beteiligt sind. Es wird erwartet, dass es eine Herausforderung sein wird, diese Technik zum ersten Mal durchzuführen. Es ist wichtig, ein detailliertes Protokoll zu haben und kritische Punkte hervorzuheben, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen.
Zu Beginn bringen Sie die eingeschläferte Maus in Bauchlage und machen Sie mit einer scharfen Schere einen einen Zentimeter langen Hautschnitt in der Mitte des Rückens des Tieres. Entfernen Sie vorsichtig die Haut, lösen Sie das iBAT mit einer kleinen Schere operativ vom Kadaver. Ernten Sie beide iBAT-Lappen mit einer Kurvenzange, um die Lappen unabhängig voneinander zu entfernen.
Legen Sie die beiden Lappen in ein Kunststoffröhrchen mit 1,5 Millilitern sterilem PBS bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie das iBAT-Gewebe 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer mit kontinuierlichem sanftem Schütteln bei 800 U/min. Unterbrechen Sie mechanisch die Gewebesuspension im Kollagenase-Typ-2-Verdauungspuffer, indem Sie mit einer P1000-Mikropipette und Filterspitzen auf und ab pipettieren.
Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze. Führen Sie das entsegregierte Gewebe durch einzelne 100-Mikrometer-Zellsiebe in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter ACK-Puffer zu den gefilterten Gewebeproben.
Die Röhrchen vier- bis fünfmal umdrehen und vier Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden die Suspensionen mit einer P1000-Mikropipette und filtrierten Spitzen durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen geleitet. Durch Zentrifusion wird das Pellet wie im Textmanuskript beschrieben resuspendiert.
Säen Sie dann jede Probe in sechs Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte aus, indem Sie jeweils einen Milliliter der Suspension in jede Vertiefung geben. Die undifferenzierten Präadipozyten wiesen sehr niedrige oder nicht nachweisbare Spiegel von ppar-gamma, C/ebp-alpha, Perilipin 1 und CD36 auf. Im Gegensatz dazu waren diese Marker am siebten Tag der Differenzierung signifikant höher.
Die Akkumulation mehrerer Lipidtröpfchen in den braunen Präadipozyten stimmte mit den zuvor veröffentlichten Ergebnissen überein. Ein signifikanter Anstieg des mitochondrialen Massenmarkers TOM 20 und des Proteinspiegels des oxidativen Phosphorylierungskomplexes wurde am siebten Tag der Differenzierung beobachtet. UCP1, ein bonafide-Marker dieses Zelltyps, wurde in undifferenzierten Präadipozyten nicht nachgewiesen, während er in reifen braunen Adipozyten am siebten Tag der Differenzierung im Wesentlichen exprimiert wurde.
Die Mitochondrien entwickelten sich von einer länglichen, röhrenförmigen Form am Tag Null zu einer abgerundeten oder bohnenartigen Form am siebten Tag. Die mitochondriale innere Struktur wurde ebenfalls durch Adipogenese verändert, was zu einer höheren Dichte der parallel gepackten Kristalle führte. Wichtig ist, dass die Mitochondrien eng mit den Lipidtröpfchen in den differenzierten braunen Adipozyten verbunden waren, so dass selbst mit hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie kein erkennbarer Abstand zwischen der äußeren Membran der Mitochondrien und den Oberflächen der Lipidtröpfchen nachgewiesen werden konnte.
Die chirurgische Entfernung von interscapulärem Fettgewebe ist von entscheidender Bedeutung. Eine ineffiziente Menge an Gewebe schränkt die Verfügbarkeit von Zellen ein, die differenziert werden sollen. Dieses bildgebende Verfahren hilft bei der Charakterisierung der Morphologie differenzierter brauner Adipozyten in vitro.
Es ist möglich, Assays für die mitochondriale Funktion, die beta-androgene Aktivierung und die autophagische Hemmung durchzuführen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung von Präadipozyten in reife braune Adipozyten unter Verwendung von braunem Interskapularfettgewebe bereit, das von neugeborenen Mäusen gewonnen wurde. Die differenzierten Zellen zeigen charakteristische Lipidansammlungen, exprimieren wichtige adipogene Marker und weisen mitochondriale Anpassungen auf, die auf eine thermogene Funktionalität hinweisen.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Adipozytenbiologie
- Forschung zur Adipositas
- Wärmeproduktionsmechanismen
Hintergrund
- Untersuchung der Rolle des braunen Fettgewebes im Energiestoffwechsel
- Modellierung von Bedingungen im Zusammenhang mit Adipositas und Lipodystrophie
- Bedeutung der Präadipozyten-Differenzierung für die Erforschung der Adipozytenbildung
Verwendete Methoden
- Immunfluoreszenz und Transmissions-Elektronenmikroskopie
- Braunes Interskapularfettgewebe von neugeborenen Mäusen
- Zelldifferenzierungsprotokolle und Assays für mitochondriale Eigenschaften
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Differenzierung von Präadipozyten in reife Adipozyten, gekennzeichnet durch die Ansammlung von Lipidtröpfchen
- Erhöhte Expression adipogener Transkriptionsfaktoren und thermogener Marker am siebten Differenzierungstag
- Charakterisierung der mit der Adipozytenbildung assoziierten Veränderungen der mitochondrialen Morphologie
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht die reproduzierbare Untersuchung der Differenzierung und Funktion von braunen Adipozyten.
- Bedeutung für das Verständnis von Adipositas und potenziellen therapeutischen Ansatzpunkten.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Eine effiziente Differenzierung und Abbildung von braunen Adipozyten aus dem interskapulären Fettgewebe neugeborener Mäuse ermöglicht ein robustes in-vitro-Modell der thermogenen Fettbiologie. Diese Fähigkeit unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien sowie die mechanistische Risikominderung für Portfolios im Bereich Stoffwechselerkrankungen, insbesondere in der Forschung zu Adipositas und Lipodystrophie. Die Reproduzierbarkeit des Protokolls und die Erhaltung wesentlicher Merkmale des braunen Fettgewebes tragen zu einer verlässlichen Vorhersagekraft bei nachgeschalteten funktionellen Assays bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen der braunen Adipozytenaktivierung, die für metabolische Erkrankungen relevante Zielstrukturen darstellen.
- Unterstützt die biologische Entwederisikung, indem die Expression thermogener und adipogener Marker bestätigt wird.
- Erleichtert die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch quantifizierbare mitochondriale und lipidbasierte Phänotypen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein standardisiertes System zur Herstellung reifer brauner Adipozyten für die Wirkstoffscreening.
- Gewährleistet die Reproduzierbarkeit und quantitative Beurteilung von Differenzierungsmarkern und mitochondrialer Funktion.
- Ermöglicht bildbasierte Endpunkte zur Bewertung der Wirkstoffeffekte auf die Adipozytenmorphologie und -funktion.
Translationale und präklinische Forschung
- Stellt eine Übereinstimmung zwischen in-vitro-Phänotypen von Adipozyten und krankheitsrelevanten BAT-Biologie für eine translationale Kontinuität her.
- Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Programmen zur Stoffwechselerkrankung, indem BAT-Aktivierung und -Dysfunktion modelliert werden.
- Erleichtert die Abstimmung von Biomarkern durch Quantifizierung von UCP1 und mitochondrialen Anpassungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in den Übergang von der Entdeckung zur präklinischen Phase, indem es ein validiertes System für Hypothesentests, Screening-Verfahren und mechanistische Untersuchungen der braunen Adipozytenbiologie bereitstellt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich der BAT-Aktivierung und adipogenen Differenzierungswege.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Beurteilung von Substanzen in reifen braunen Adipozyten.
- Analytik: Ermöglicht die Messung der Expression von Transkriptionsfaktoren, der mitochondrialen Masse sowie der Assoziierung von Lipidtröpfchen.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit der in-vivo-Funktion von braunem Fettgewebe und Modellen metabolischer Erkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für laufende Forschungsinitiativen zu Stoffwechsel und Adipositas.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der entdeckungsorientierten Erforschung von BAT und verringert mechanistische Unklarheiten.
- Operationaler Wert: Standardisiert Differenzierungs- und Bildgebungsabläufe, um die Reproduzierbarkeit zwischen Teams sicherzustellen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungen über die Fortführung oder Einstellung von Zielstrukturen bei Stoffwechselerkrankungen, indem robuste funktionelle Assays ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von therapeutischen Programmen im Bereich BAT.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Gewebedissektion, Zellkultur und fortgeschrittenen Bildgebungsverfahren.
- Setzt Zugang zu Infrastruktur für konfokale Immunfluoreszenz- und Transmissions-Elektronenmikroskopie voraus.
- Erfordert die Standardisierung des Protokolls, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsteams sicherzustellen.
- Kann Anpassungen für verschiedene Mausstämme oder Entwicklungsstadien erfordern.
- Die Zellausbeute und Differenzierungseffizienz hängen von einer präzisen Gewebebehandlung und -verarbeitung ab.
![Visualisierung und Quantifizierung von braunem und beigem Fettgewebe in Mäusen mittels [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.161Z&w=384&q=75)
