Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen des menschlichen Immunsystems (Human Immune System) für präklinische immunonkologische Studien. Mauskrebsmodelle sind in ihrer Vielfalt begrenzt und lassen sich nur unzureichend auf die Klinik übertragen. Diese Technik dient als präklinisches Modell für Immuntherapiestudien, indem die Behandlung menschlicher Tumore in einer Maus mit menschlichem Immunsystem untersucht wird.

Das humanisierte Mausmodell kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte der menschlichen Immunologie zu untersuchen, einschließlich der Reaktionen auf viele Infektionen oder Krebserkrankungen des menschlichen Immunsystems. Es kann eine Herausforderung sein, eine zuverlässige und robuste Quelle für Nabelschnurblut zu beschaffen und die Gesundheit der immungeschwächten Mauskolonie zu erhalten. Expertise in Durchflusszytometrie und immunologischer Analytik ist unerlässlich.

Kristina Larsen, eine Expertin für Forschungsdienstleistungen aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn wird das aus Nabelschnurblut isolierte CD34-positive Zellpellet in 300 Mikrolitern Magnetzellseparatorpuffer pro 10 mal 10 bis zu den achten Zellen resuspendiert. Fügen Sie 100 Mikroliter FCR-blockierendes Reagenz pro einmal 10 zu den achten Zellen hinzu, gefolgt von 100 Mikrolitern CD34-positiven magnetischen Beads pro einer mal 10 zu den achten Zellen und inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 30 Minuten.

Als nächstes fügen Sie den achten Zellen fünf Milliliter Magnetzellenseparatorpuffer pro 10 hinzu und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 360 g bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie den Waschschritt und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern pro 100 Millionen Zellen Magnetzellenseparatorpuffer in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das als unfraktioniert gekennzeichnet ist. Beschriften Sie zwei weitere 15-Milliliter-Röhrchen CD34-negativ und CD34-positiv Legen Sie die drei Röhrchen auf ein Kühlgitter.

Trennen Sie die Zellen mit dem Zwei-Säulen-Positivauswahlprogramm auf einem automatischen Magnetzellenseparator in einer Biosicherheitswerkbank. Als nächstes bereiten Sie zum Expandieren und Einfrieren von CD34-positiven menschlichen Stammzellen Nabelschnurblut oder CB-Medium vor, wie im Manuskript beschrieben, und passieren Sie einen 0,22-Mikrometer-Filter. Resuspendieren Sie die CD34-positiven Zellen bei 100.000 pro Milliliter CB-Medium und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius.

Am dritten Tag wird ein gleiches Volumen CB-Medium ohne Zytokine in den Kolben gegeben. Am fünften Tag ernten Sie die expandierten CD34-positiven Zellen. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf und ab und sammeln Sie sie in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie so viel CB-Medium hinzu, dass der Boden des Kolbens bedeckt ist. Kratzen Sie mit einem Zellschaber den gesamten Boden des Kolbens ab. Sammeln Sie alle Medien in demselben 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie.

Resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter CB-Medium und zentrifugieren Sie sie. Saugen Sie das Medium bis zum Pellet ab und resuspendieren Sie das Pellet in einem Gefriermedium. Als nächstes beginnen Sie mit der CD34-positiven Zellpräparation drei Stunden nach der Bestrahlung des Welpen.

Erwärmen Sie 10 Milliliter CB-Medien in einem 50-Milliliter-Röhrchen. Entnehmen Sie eine Durchstechflasche mit in vitro expandierten und gefrorenen CD34-positiven Zellen für jeweils vier bis sechs Welpen zur Injektion. Tauen Sie bei 50 bis 55 Grad Celsius schnell auf, bis nur noch eine kleine Menge Eis sichtbar ist, und geben Sie die Zellen in das erwärmte CB-Medium.

Verwenden Sie einen Milliliter Medium, um jede Durchstechflasche zu spülen, und drehen Sie die Zellen 12 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 360 g. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab. Resuspendieren Sie das Pellet in zwei Milliliter CB-Medium und zählen Sie die Zellen.

Zentrifugieren Sie erneut die Zellen, saugen Sie das Medium an und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern sterilem PBS pro n plus einem Welpen zur Injektion, was zu 250.000 bis 450.000 CD34-positiven Zellen pro Maus führt. Für die PBMC-Isolierung aus Mäuseblut mischen Sie das Blutheparin, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren, und legen Sie es langsam auf 500 Mikroliter mit einem Dichtegradienten von 1,077 Gramm pro Milliliter, wobei Sie darauf achten müssen, die Grenzfläche nicht zu stören. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1.220 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur ohne Pausen.

Entfernen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette so viele Zellen wie möglich aus dem Buffy-Coat und geben Sie sie in das neue 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 750 Mikrolitern Erntemedium. Bei 360 g 11 Minuten zentrifugieren. Saugen Sie das Medium auf 50 Mikroliter ab und resuspendieren Sie das Pellet in 750 Mikrolitern Erntemedium.

Erfassen Sie die Daten für 100 Mikroliter jeder Probe auf einem Durchflusszytometer. Importieren Sie dann die fcs-Datei in die Fließdatenbearbeitungssoftware, und wenden Sie ein Polygon-Gate auf ein FSC-A- und SSC-A-Diagramm an. Ändern Sie die Achsen in FSC-A statt FSC-H, und schließen Sie die Zellen auf der linearen Diagonalen an, wobei die Dubletten, die aus der Linie herausragen, ausgeschlossen werden.

Wählen Sie diese Zellen aus, und ändern Sie die Achsen in hCD45 im Vergleich zu mCD45. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die hCD45-positive Grundgesamtheit an, und wenden Sie den Namen Mensch an. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die mCD45-positive Grundgesamtheit an, und wenden Sie den Namen Maus an.

Erstellen Sie eine Zählstatistik für menschliche und Mauspopulationen. Wählen Sie als Nächstes die menschliche Grundgesamtheit aus, und ändern Sie die Achsen in CD19 statt CD3. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD19-positiven Zellen an und nennen Sie sie B-Zellen.

Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD3-positive Population an und nennen Sie sie T-Zellen. Wenden Sie dann ein Polygon-Gate auf die doppelt negative Grundgesamtheit an, und nennen Sie sie Nicht-TB. Wählen Sie die T-Zell-Population aus, und ändern Sie die Achsen in CD4 im Vergleich zu CD3.

Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD4-positive Grundgesamtheit an, und nennen Sie es CD4-positiv. Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die CD4-negative Grundgesamtheit an, und nennen Sie es CD8. Wählen Sie die Nicht-TB-Population aus, und ändern Sie die Achsen in CD56 im Vergleich zu Myeloid.

Wenden Sie ein Polygon-Gate auf die gesamte CD56-positive Population an und nennen Sie es NK-Zellen. Wenden Sie dann ein Polygon-Gate auf die CD56-negative und myeloid-positive Population an und nennen Sie es myeloid. Erstellen Sie eine Tabelle für die Prozent- und Anzahlstatistiken aller Populationen, und exportieren Sie sie in eine Tabelle.

Berechnen Sie den prozentualen hCD45-Chimärismus mit der angegebenen Formel. Nachdem Sie Tumorzellen in der Maus gezüchtet und medikamentöse Behandlungen verabreicht haben, ernten Sie das Gewebe. Legen Sie die Maus auf ein Schaumstoff-Sezierbrett mit Stiften, um sie an Ort und Stelle zu halten, und strecken Sie die Arme und Beine in einem Winkel von 45 Grad.

Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Rumpfes, beginnend in der Nähe des Beckens und bis zum Kinn. Ziehen Sie die Haut bis zum Rand und halten Sie sie mit Stecknadeln fest. Extrahieren Sie die Lymphknoten mit einer feinen Pinzette in der Reihenfolge axillar, zervikal, mesenterial, inguinal und hiatal.

Legen Sie die Lymphknoten auf einer Seite des Milchglasträgers in eine Petrischale in acht Milliliter Erntemedium. Halten Sie die Objektträger in einem senkrechten Winkel mit den mattierten Kanten nach innen und drücken Sie vorsichtig auf das Gewebe, bis der Zellinhalt freigesetzt wird. Spülen Sie den Objektträger mehrmals aus, indem Sie sie auseinander und zusammen ziehen, um die maximale Anzahl von Zellen freizusetzen.

Sammeln Sie die Zellen mit einer Fünf-Zoll-Glaspipette und filtern Sie sie durch eine neun Zoll große Pipette mit Wattestopfen in ein beschriftetes konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes ziehen Sie den Tumor aus der offenen Flanke heraus, indem Sie den Tumor mit einer Pinzette festhalten, während Sie mit einer Sezierschere langsam an den Tumorrändern abschneiden. Wiegen Sie den Tumor und entfernen Sie 1/4 des Tumors für die RNA- und immunhistochemische Verarbeitung.

Legen Sie die restlichen 3/4 des Tumors in eine sechs Zentimeter große Schale und zerkleinern Sie sie mit einer Skalpellklinge in einen Millimeter große Stücke. Übertragen Sie die Tumorstücke in ein Dissoziationsröhrchen. Spülen Sie dann die Schale mit unvollständigem TIL-Medium aus und geben Sie es in das Röhrchen.

Fügen Sie Kollagenase-Präparat hinzu und dissoziieren Sie das Gewebe durch mechanische Dissoziation bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde. Die Suspension wird über einen 100-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen geleitet und der Filter mit 10 Millilitern TIL-Komplettmedien gespült. Zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet in gerade so viel Erntemedium mit DNase, dass die Zellsuspension problemlos durch eine P1000-Pipettenspitze geleitet und das Volumen für die nachgeschaltete Analyse aufgezeichnet werden kann.

Im PDX SFB 307P verlangsamte die Kombinationstherapie das Wachstum des Tumors, was durch das Tumorwachstumsvolumen über die Zeit, das Tumorgewicht und die spezifische Wachstumsrate bestimmt wurde. PDX CRC 307M, das in einer anderen Kohorte von Mäusen getestet wurde, war von der gleichen Kombinationsbehandlung bei HIS-BRGS-Mäusen weniger betroffen. Basierend auf dem gesamten humanen hCD45-positiven und humanen T-Zell-hCD3-positiven Chimärismus im Blut vor der Tumorimplantation stiegen beide Parameter im peripheren Immunsystem und in der TIL in Kombination mit behandelten CRC 307P-tragenden Mäusen an, jedoch nicht im SFB-307M-Modell.

Die Untersuchung der humanen T-Zellen ergab mehr aktivierte T-Zellen in den Tumoren des SFB 307P, nicht aber die Lymphe von Kombinations-behandelten Mäusen. Außerdem gab es mehr Effektorgedächtnis-CD8-positive T-Zellen und weniger TIM-3-positive T-Zellen in den kombinationsbehandelten CRC 307P-Tumoren. Im Gegensatz dazu war dieser Unterschied beim Modell CRC 307M nicht zu bemerken.

Weiterhin wurden keine Veränderungen in der Häufigkeit zytotoxischer T-Zell-Populationen bei den mit Kombination behandelten Mäusen beobachtet, obwohl bei unbehandelten Mäusen höhere zytotoxische T-Zellen beobachtet wurden. Die Kombinationstherapie hatte keinen Einfluss auf die Häufigkeit von Tregs in den Lymphorganen des SFB 307P oder in Tumoren, obwohl die Daten des SFB 307M einen Trend zu reduzierten Tregs zeigten. Immunbedingte Veränderungen in Tumorzellen waren mittels Durchflusszytometrie erhöht.

Eine erhöhte Expression der MHC-Klassen I und II wurde auf den CRC 307P-Tumorzellen beobachtet, die aus kombinationsbehandelten HIS-BRGS-Mäusen extrahiert wurden. Im Modell des SFB 307M induzierte die gleiche medikamentöse Behandlung die HLA-Klasse-II-Expression auf den Tumorzellen. In ähnlicher Weise führte die Kombinationstherapie zu einer erhöhten PD-L1-Expression auf den EpCAM-positiven CRC 307P-Tumorzellen.

Abschließend wurden Korrelationen zwischen Immunantworten und Tumorwachstum untersucht. Vermehrte CD4-positive T-Zellen zeigten eine signifikante Korrelation mit geringerem Tumorwachstum, genauer gesagt die HLA-DR-positiv aktivierten T-Zellen in den kombinationsbehandelten HIS-Mäusen. Sterile Technik bei der Isolierung der CD34-positiven Zellen, da die Mäuse extrem immundefizient sind.

Der daraus resultierende Chimärismus ist innerhalb und zwischen Nabelschnurblutspendern variabel, wobei T-Zellen die größte Variation aufweisen. Es können unbegrenzte Kombinationen von Immuntherapien durchgeführt werden, ebenso wie mechanistische und kinetische Studien zur Medikamentendosierung, z. B. die Deletion von CD8-T-Zellen, um ihre Rolle zu bestätigen. Wichtig ist, dass auch drogenbedingte Toxizitäten untersucht werden können.

Es stellte ein relevanteres und zugänglicheres präklinisches Modell zur Verfügung, um humane Immuntherapien für die Translation in die Klinik zu testen. Auf der Grundlage dieser Daten laufen derzeit mehrere klinische Studien.