Bewertung der Wirksamkeit organischer Peroxysäuren zur Elimination von Milchbiofilmen unter Verwendung eines Ansatzes, der statische und dynamische Methoden kombiniert

Biofilmbildende Mikroorganismen sind ein großes Problem in der Lebensmittelindustrie, einschließlich der Milchindustrie. Aufgrund ihrer negativen Auswirkungen auf die Qualität der Produkte ist es wichtig, Strategien zur Biofilmkontrolle zu entwickeln. Dieser Ansatz kombiniert eine statische Hochdurchsatz-Screening-Methode und eine dynamische Methode, die In-situ-Bedingungen nachahmt.

Diese beiden Methoden ergänzen sich, um die Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Biofilme zu untersuchen. Mit diesem Ansatz können neue biologische oder chemische Formulierungen zur Bekämpfung von Biofilmen im Lebensmittel-, Medizin- oder Umweltbereich getestet werden. Beginnen Sie mit dem Wirbeln der Bakterienkulturröhrchen von Pseudomonas azotoformans.

100 Mikroliter der Bakterienkultur werden aseptisch in 10 Milliliter sterile tryptische Sojabrühe oder TSB-Medium überführt, um die Endkonzentration von etwa zwei mal 10 bis zur siebten KBE pro Milliliter zu erreichen. Wirbeln Sie das Kulturröhrchen. Anschließend werden mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter der verdünnten Bakterienkultur in dreifacher Ausfertigung in die Biofilm-Mikrotiterplattenvertiefungen überführt.

Laden Sie 150 Mikroliter TSB-Medium in drei neue Vertiefungen als Kontrolle. Anschließend wird die Biofilm-Mikrotiterplatte 24 Stunden lang bei 30 Grad Celsius ohne Rühren inkubiert. Reinigen und trocknen Sie die Teile des Bioreaktors an der Luft, bevor Sie die flache Klinge in den Ein-Liter-Glasbecher legen, der mit einem Magnetstab am Halter befestigt ist.

Halten Sie den Aufbau aufrecht mit der Kunststoffstange, die an der Innenseite des Bioreaktordeckels angebracht ist. Verwenden Sie den Schraubendreher, um die Edelstahlcoupons oder -folien auf ihre Polypropylenstangen zu legen. Stecken Sie Coupons oder Schieber in die Löcher im Deckel, ohne die Ausrichtungsstifte in die Kerben zu stecken, damit während der Sterilisation Dampf entweichen kann.

Decken Sie alle Entlüftungsöffnungen des Bioreaktors mit Aluminiumfolie ab und wickeln Sie den Rest der Ausrüstung ein, nämlich den Schlauch der Größe 18 und den Schlauch der Größe 16, die Glasströmungsbremse, die Behälterdeckel, die Schraubendreher, die Pinzette und die 0,2-Mikrometer-Filter mit Aluminiumfolie. Autoklavieren Sie den Bioreaktor, der in einem Trockenzyklus bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten eingerichtet wurde. Um den ersten Schritt der Biofilmbildung im Bioreaktor im Batch-Modus durchzuführen, verbinden Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank ein Ende des Schlauchs der Größe 18 mit dem Auslaufauslauf des Bioreaktors und halten Sie das andere Ende in Aluminiumfolie eingewickelt.

Nehmen Sie einen Gutschein- oder Objektträgerhalter vom Deckel des Bioreaktors und legen Sie ihn in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie dann mit einer serologischen 50-Milliliter-Pipette den Bioreaktorbecher mit 340 Millilitern 300 Milligramm pro Milliliter TSB-Medium durch das vom Stab besetzte Loch. Um das Nährmedium im Bioreaktor zu beimpfen, geben Sie einen Milliliter 10 bis acht KBE pro Milliliter Pseudomonas azotoformans Bakterienlösung mit einer Fünf-Milliliter-Pipette durch die Öffnung und setzen Sie den Stab wieder in seine ursprüngliche Position ein.

Positionieren Sie die Stangen bereits in den Deckellöchern, damit die Stifte in die jeweiligen Kerben passen. Platzieren Sie dann einen 0,2 Mikrometer großen bakteriellen Luftspülfilter am Ende des Röhrchens mit dem kleinsten Durchmesser auf dem Deckel des Bioreaktors. Der andere Schlauch mit gleichem Durchmesser bleibt mit einem Metall-Schraubverschluss oder einem fest schließenden Silikonstopfen dauerhaft verschlossen.

Stellen Sie den Bioreaktor für 24 Stunden über die auf 30 Grad Celsius eingestellte Heizplatte und rühren Sie bei 130 U/min. Führen Sie nach 24 Stunden den zweiten Schritt der Biofilmbildung im Bioreaktor im kontinuierlichen Durchflussmodus durch. Stellen Sie einen Ballon mit 18 Litern sterilem destilliertem Wasser in die Biosicherheitswerkstatt.

Fügen Sie dann zwei Liter 1000 Milligramm pro Liter TSB-Nährmedium hinzu, um eine Endkonzentration von 100 Milligramm pro Liter zu erhalten. Decken Sie den Behälter mit seiner sterilen Kappe ab, an die zwei Röhrchen angeschlossen sind. Der erste ist ein Silikonschlauch, der an der Schnittstelle der Kappe befestigt ist, um das Medium zu pumpen.

Der zweite, der Schlauch der Größe 16, ist mit dem externen Anschluss verbunden, so dass die Flüssigkeit in Richtung Bioreaktor fließen kann. Nachdem Sie den Schlauch der Größe 16 an das Ende der Glasströmungsbremse angeschlossen haben, führen Sie diesen am anderen Ende in das größte Rohr auf dem Deckel des Bioreaktors ein und installieren Sie dann den Schlauch der Größe 16 in der Schlauchpumpe. Verwenden Sie einen weiteren 20-Liter-Ballon, um das Abwasser aus dem Bioreaktor aufzufangen.

Befestigen Sie das Ende des Röhrchens, das mit dem Auslauf des Bioreaktors verbunden ist, an der Kappe des Abfallbehälters. Führen Sie einen 0,2-Mikrometer-Filter in das Röhrchen ein, das sich auf dem Deckel dieses Behälters befindet. Wenn Sie fertig sind, starten Sie die Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 11,3 Millilitern pro Minute und lassen Sie das System 24 Stunden lang laufen.

Schalten Sie nach 24 Stunden die Peristaltikpumpe aus und hören Sie auf, den Bioreaktor zu rühren und zu erhitzen. Um den bakteriellen Biofilm wiederherzustellen, spülen Sie die Coupons oder Objektträger in 40 Milliliter PBS aus, um planktonische Bakterien zu eliminieren. Geben Sie sie dann in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 40 Millilitern PBS frei.

Nach 30 Sekunden Vortexing beschallen Sie die Röhren 30 Sekunden lang bei 40 Kilohertz. Wiederholen Sie dies dreimal. Wenn Sie fertig sind, sammeln Sie die 40 Milliliter Biofilmsuspension in einem sterilen konischen 50-Milliliter-Röhrchen und spülen Sie die Coupons oder Objektträger mit zwei sterilen PBS-Lösungen ab.

Gewinnen Sie diese Spülflüssigkeit zurück und fügen Sie sie der bereits gesammelten Biofilmsuspension hinzu. Nehmen Sie die Mikrotiterplatte ab 30 Grad Celsius heraus. Geben Sie 200 Mikroliter PBS in drei Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte.

Um die Biofilme zu waschen und planktonische Bakterien zu eliminieren, übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikroplatte mit den auf den Stiften gebildeten Biofilmen für 10 Sekunden auf die 96-Well-Mikroplatte, die das PBS enthält. Bereiten Sie die Desinfektionsmittel in den erforderlichen Konzentrationen vor und geben Sie 200 Mikroliter jeder Desinfektionsmittelkonzentration in dreifacher Ausfertigung in die Vertiefungen einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikrotiterplatte auf die 96-Well-Mikrotiterplatte, die die Desinfektionsmittel enthält, und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für die gewünschte Einwirkzeit.

Als nächstes geben Sie 200 Mikroliter Dey-Engley-Neutralisierungsbrühe in die Vertiefungen einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte. Übertragen Sie den Deckel der Biofilm-Mikrotiterplatte auf die 96-Well-Mikrotiterplatte, die die neutralisierende Brühe enthält. Versiegeln Sie die Mikrotiterplatte mit Parafilm und legen Sie sie für 30 Minuten bei 40 Kilohertz in das Badbeschallungsgerät.

Nach 30 Minuten werden von der ersten Säule der beschallten Platte 100 Mikroliter abgelöste Biofilme in die erste Reihe einer neuen 96-Well-Mikrotiterplatte übertragen. Geben Sie dann 180 Mikroliter steriles PBS bis auf die erste Reihe in eine 96-Well-Platte. Als nächstes werden 20 Mikroliter der Biofilmlösung aus der ersten Reihe in die Vertiefungen in der zweiten Reihe mit 180 Mikrolitern PBS überführt, um die Verdünnung von 10 bis minus eins zu erreichen.

Übertragen Sie dann 20 Mikroliter aus der zweiten Reihe in die Vertiefungen in der nächsten Reihe, um die Verdünnung von 10 auf minus zwei zu erreichen. Wiederholen Sie dies, um eine Verdünnung zwischen 10 bis minus fünf und 10 bis minus sieben zu erhalten. Impfen Sie 100 Mikroliter der gewünschten Verdünnung auf TSA und inkubieren Sie die Platten gemäß den Wachstumsparametern des Bakteriums.

Bilden Sie die Pseudomonas azotoformans PFLA 1-Biofilme auf den Coupons im Bioreaktor, entfernen Sie den Stab, der die Coupons hält, und spülen Sie den Stab in einem konischen Röhrchen mit 30 Millilitern PBS aus, um Planktonzellen zu entfernen. Lassen Sie jeden Coupon mit einem Schraubendreher in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen fallen. Fügen Sie dann vier Milliliter der entsprechenden organischen Peroxysäurelösung oder PBS für die Kontrolle hinzu.

Nach fünf Minuten Inkubation 36 Milliliter Dey-Engley-Neutralisierungsbrühe hinzufügen. Nachdem Sie das konische Rohr 30 Sekunden lang gewirbelt haben, beschallen Sie sie 30 Sekunden lang mit 40 Kilohertz. Wiederholen Sie den Vorgang dreimal, um die Biofilmsuspension zu erhalten.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit den anderen Stäbchen, bereiten Sie serielle Wahnvorstellungen der Biofilmsuspension vor und plattieren Sie die Suspension wie zuvor beschrieben auf TSA-Medium. Die SCM-Analyse zeigte das Vorhandensein des Biofilms von Pseudomonas azotoformans PFL1A auf den Biofilm-Mikroplattenstiften. Der PFL1A-Biofilm von Pseudomonas azotoformans, der auf einem Objektträger aus Edelstahl unter Verwendung eines Bioreaktors gebildet wurde, erschien sehr dicht und zeigte die morphologischen Eigenschaften eines ausgereiften dreidimensionalen Biofilms.

Die Ergebnisse der Bakterienzählungen der Biofilme, die von diesem Isolat im dynamischen System entwickelt wurden, zeigten signifikante Zelldichten, die 8,74 log KBE pro Quadratzentimeter in TSB-Kulturmedium und 7,86 log KBE pro Quadratzentimeter in steriler Magermilch entsprachen. Die mit dem B.vesicularis-Isolat erzielten Ergebnisse zeigten, dass die Erhöhung der Nährstoffkonzentration von 100 auf 900 Milligramm pro Liter zu einer Erhöhung der Keimzahl der Biofilme von 6,11 auf 8,71 log KBE-Zentimeter im Quadrat führte. Außerdem wurde ein signifikantes Biofilmwachstum beobachtet, wenn die Flussrate auf 6,0 Milliliter pro Minute reduziert wurde, was darauf hindeutet, dass bestimmte Faktoren die Biofilmbildung im Bioreaktor beeinflussen könnten.

Keiner der Biofilme enthielt nachweisbare lebensfähige Zellen bei einer Kontaktzeit von fünf Minuten in 500 ppm mit organischen Peroxysäuren und 100.000 ppm mit Wasserstoffperoxidkonzentrationen von Desinfektionsmitteln, die üblicherweise in Milchpflanzen angewendet werden. Das SCM zeigte die dreidimensionale Struktur von unbehandelten minimalen Biofilm-Eradikationskonzentrationen oder MBEC-Biofilmen, während die behandelten MBEC-Biofilme ihre dreidimensionale Konformation verloren. Es ist wichtig, während der Durchführung dieses Protokolls unter dem sterilen Zustand zu bleiben.

Außerdem muss der Benutzer bedenken, dass das generierte Ergebnis mit einem eindeutigen Isolat und Desinfektionsmittel verknüpft ist. Die Kombination von Desinfektionsmitteln mit mechanischen Vibrations-, Ultraschall- oder enzymatischen Behandlungen könnte evaluiert werden, um die Wirksamkeit der Biofilmentfernung zu verbessern. Dieser Ansatz, bei dem statische und dynamische Methoden zur Bildung von Biofilmen verwendet werden, ebnete den Forschern den Weg, neue Anti-Biofilm-Formulierungen zu untersuchen, um Biofilme in verschiedenen Sektoren besser zu kontrollieren.