Name: Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Erfahren Sie eine standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis. Dieses Protokoll minimiert menschliche Einflüsse und verbessert die Reproduzierbarkeit in der Immunforschung.

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Der Autor dankt den Tierhaltungseinheiten der Universität Lund, Camilla Björklöv und Agnieszka Czopek, für ihre Unterstützung und Richard Williams, Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, UK, für konstruktive Kritik und linguistische Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts.

Alle Tierverfahren wurden nach den Praktiken des schwedischen Tierversuchsamtes durchgeführt und von der Tierethikkommission, Lund-Malmö, Schweden genehmigt (Genehmigungsnummer: M126-16).
HINWEIS: Ein schematischer Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 beschrieben.
1. Materialaufbereitung
HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien aseptisch in einer sterilen Haube vor, aliquot und lagern Sie sie bei der angegebenen Temperatur. Die Reagenzien können bis zu 2 Jahre gelagert werden, ohne ihre Wirkung zu verlieren.
<ol><li>Bereiten Sie CFA mit 20 mg/ml Mycobacterium tuberculosis wie unten beschrieben vor.<ol><li>100 mg gefriergetrocknete M. tuberculosis H37RA (siehe Materialtabelle) und fünf 3,2 mm Stahlperlen in ein 7-ml-Röhrchen geben (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Röhrchen in einem Homogenisator (siehe Materialtabelle) 60 s bei höchster Drehzahleinstellung (5.000 U/min).</li>
		<li>5 mL unvollständiges Freund-Adjuvans (IFA) in die Tube geben und erneut 60 s bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Die Aufschlämmung der homogenisierten M. tuberculosis in IFA (jetzt CFA) in ein frisches Röhrchen mit einer Pipette geben, die Perlen zurücklassen und bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie dem gefriergetrockneten Pulver des MOG35-55-Peptids Reinstwasser hinzu (siehe Materialtabelle), um eine endgültige Peptidkonzentration von 10 mg / ml zu erhalten. Sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 60 μL Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern. HINWEIS: Das für dieses Experiment verwendete MOG35-55-Peptid ist von ImmunoGrade-Reinheit (~ 70%), ist TFA-gespalten, löst sich leicht in Wasser auf und enthält ein C-terminales Amid (-NH2), um die In-vivo-Stabilität zu erhöhen14. Peptidaliquots wurden nie mehr als zweimal aufgetaut und wieder eingefroren und wurden bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml Keuchhustentoxinpuffer vor: Lösen Sie 2,9 g NaCl in 80 ml 1x Ca 2+/Mg 2+ freies PBS und fügen Sie 100 μL 10% Triton X-100 hinzu. Stellen Sie das Volumen mit PBS auf 100 ml ein und sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,2-μm-Filter leiten. 10 ml Aliquots vorbereiten und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.</li>
</ol>2. Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen
<ol><li>Berechnen Sie die Menge an Emulsion, die für die Immunisierung benötigt wird. In diesem Standardprotokoll erhält jede Maus 50 μg MOG35-55 Peptid und 300 μg M. tuberculosis dispergiert in Freunds Adjuvans (CFA). Die Menge jedes Reagenzes (MOG35-55-Peptid , PBS, CFA und IFA), die für die Herstellung der Emulsionen benötigt wird, kann mit Hilfe der Zusatzdatei 1 berechnet werden. Weitere 20% aller Reagenzien, um den geringen Emulsionsverlust auszugleichen, werden in die Berechnung einbezogen. HINWEIS: Das in dieser Studie verwendete handelsübliche Emulsionskit (siehe Materialtabelle) besteht aus einem Schlauch, einem Schraubverschluss und einem Kolben in einem sterilisierten Beutel. Jedes Röhrchen des Emulsions-Kits fasst maximal 9,6 ml, wodurch 8 x 1 ml Spritzen hergestellt werden können, die für die Immunisierung von 40 Mäusen ausreichen (oder 80 Mäuse bei Verwendung von 100 μL Emulsion pro Tier).</li>
	<li>Legen Sie das verschraubte Röhrchen (aus dem handelsüblichen Emulsionskit) und die Reagenzien auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie die Emulsionskomponenten in der folgenden Reihenfolge in den in Schritt 2.1 berechneten Volumina hinzu: PBS, dann das Peptid, dann M. tuberculosis in CFA und schließlich IFA.</li>
	<li>Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen kräftig für 5-10 s von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.</li>
	<li>Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 s ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für 3 min auf Eis. Wiederholen Sie die Ausführung noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 1 Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen, führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht. Entfernen Sie den Schnappverschluss an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie ihn drehen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kolben aus einer Injektionsspritze (1 ml; siehe Materialtabelle). Fügen Sie der Injektionsspritze eine Nadel (vorzugsweise 25-27 G) hinzu.</li>
	<li>Befestigen Sie das hintere Ende der Injektionsspritze am speziellen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.</li>
	<li>Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-ml-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat.</li>
	<li>Trennen Sie die Injektionsspritze vom Röhrchen und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in die Spritze gelangt. Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt. HINWEIS: An dieser Stelle kann ein Teil der Emulsion zur Qualitätskontrolle verwendet werden (siehe Schritt 3).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.11 für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion. HINWEIS: Um die Verschwendung teurer CFA / Antigen-Emulsionen zu minimieren, sollten 1-ml-Spritzen verwendet werden. Andere Spritzen, die in den speziellen Verschluss am Boden des Röhrchens passen, können verwendet werden; Möglicherweise muss jedoch ein größeres Emulsionsvolumen hergestellt werden. Die Peptidemulsion CFA/MOG35-55 kann bis zu 15 Wochen bei 4 °C gelagert werden, ohne ihre EAE-induzierende Kapazität zu verlieren.</li>
</ol>3. Qualitätskontrolle der Emulsion
<ol><li>Falltest: Geben Sie einen kleinen Tropfen der Emulsion in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen, das mit 20 mL kaltem Wasser gefüllt ist. Schließen Sie die Tube und schütteln Sie sie einige Sekunden lang von Hand. Das Auftreten winziger Tröpfchen bestätigt die Bildung einer Wasser-in-Öl-Emulsion.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Emulsion mittels Phasenkontrastmikroskopie.<ol><li>Um die Größe der Wasser-in-Öl-Partikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen (2-3 μL) der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckstreifen aus und drücken Sie dann in kreisenden Bewegungen fest, um die Emulsion abzuflachen.</li>
		<li>Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop (siehe Materialtabelle) mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion. Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige graue/weiße Partikel sichtbar sind (Abbildung 2A).</li>
	</ol></li>
	<li>Analysieren Sie die Partikelgröße der Emulsion mit Laserbeugung. HINWEIS: Die Laserbeugung misst Partikelgrößenverteilungen mit einem Laserstrahl. Dies ist der ultimative Qualitätskontrolltest für Emulsionen. Ein repräsentatives Ergebnis der Partikelgrößenverteilungen nach der hier beschriebenen Methode ist in Abbildung 2B dargestellt (für eine detaillierte Beschreibung siehe Topping et al.6). Dennoch reichen Falltest und mikroskopische Untersuchung aus, um zu validieren, ob eine zufriedenstellende Emulsion gebildet wurde.<ol><li>Stellen Sie die Brechungsindizes für rote und blaue Laser für das Dispergiermittel (siehe Materialtabelle) auf 1,456 und für die Probe auf 1,33 auf dem Partikelgrößenanalysator ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Absorption des Brechungsindex auf 0,02 ein.</li>
		<li>Geben Sie einen Tropfen aus der Spritze mit der Peptidemulsion in die Dispersionseinheit mit leichtem Mineralöl. Starten Sie die Datenerfassung sofort nach der Dispergierung der Emulsion. HINWEIS: Für die Abschätzung der Partikelgrößenverteilung wurde ein Allzweckmodell angewendet und sphärische Partikel wurden angenommen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. EAE-Induktion mit der MOG 35-55-Peptidemulsion in C57BL6/J-Mäusen
HINWEIS: In allen Experimenten wurden fünf 8-12 Wochen alte weibliche C57BL6 / J-Mäuse verwendet.
<ol><li>Vor der Immunisierung betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% verdampftem Isofluran und bestätigen Sie mit einer festen Zehenklemme.</li>
	<li>Injizieren Sie jede Maus subkutan mit 1-ml-Spritzen in zwei verschiedene Stellen, auf der rechten und linken Seite der Hinterflanke, mit 200 μL Emulsion, die 50 μg MOG35-55-Peptid in einem Verhältnis von 1: 1 (v / v) von Peptid / CFA enthält.</li>
	<li>Mindestens 1,5 h nach der Immunisierung mit der Emulsion und dann wieder nach 24 h insgesamt 80 ng Bordetella pertussis-Toxin in 200 μL Keuchhustentoxinpuffer an jede Maus durch intraperitoneale Injektionen (100 μL auf der linken und 100 μL auf der rechten Seite des Bauches) verabreichen. HINWEIS: Die genaue Lokalisation der intraperitonealen Injektion mit Keuchhustentoxin hat sich als essentiell für die Aktivierung von T-Zellen im drainierenden Lymphknoten15 erwiesen.</li>
	<li>Optional: Injizieren Sie MOG35-55 Peptid erneut an Tag 7 (wie in einigen Protokollen16 verwendet), indem Sie Schritt 4.2 wiederholen. HINWEIS: Am wichtigsten ist, dass die Spritzen und Nadeln, die für die Immunisierung verwendet werden, die MOG / CFA oder Keuchhustentoxin enthalten, ordnungsgemäß in Biogefahrenbeuteln / -behältern entsorgt werden.</li>
	<li>Bewerten Sie den klinischen Score täglich auf einer Skala von 0-6, wie zuvor beschrieben6.</li>
</ol>

<ol><li>Walton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rising+prevalence+of+multiple+sclerosis+worldwide%3A+Insights+from+the+Atlas+of+MS%2C+third+edition%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis%22%5BJournal%5D)">Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition.</a> Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).</li>
<li>van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+and+T+cells+driving+multiple+sclerosis%3A+identity%2C+mechanisms+and+potential+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers.</a> Frontiers in Immunology. 11, 760(2020).</li>
<li>Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+No+One%2C+and+One+Hundred+Thousand%3A+T+Regulatory+Cells%27+Multiple+Identities+in+Neuroimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells' Multiple Identities in Neuroimmunity.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2947(2019).</li>
<li>Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+multiple+sclerosis--potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of multiple sclerosis--potentials and limitations.</a> Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).</li>
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<li>Topping, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+antigen-emulsion+preparations+for+the+induction+of+autoimmune+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models.</a> Frontiers in Immunology. 13, 892251(2022).</li>
<li>Flies, D. B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+vortex+method+for+preparing+antigen%2Fadjuvant+emulsions+for+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization.</a> Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).</li>
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</ol>

BTB Emulsions AB hat eine Patentanmeldung für die Verwendung einer Vorrichtung und eines Verfahrens zur Herstellung von Emulsionen für die Immunisierung sowie für Tiere und Menschen eingereicht (europäische Patentanmeldungsnummer: EP3836884A1). BTB ist CEO und Gründer des Unternehmens und Aktionär von BTB Emulsions. Bertin-Instruments vertreibt die in dieser Publikation verwendeten Emulsionskits weltweit.

Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie das Antigen/Freund-Adjuvans, werden seit mehr als einem halben Jahrhundert verwendet, um EAE17 zu induzieren. Derzeit gibt es keine standardisierte Methode zur Herstellung von Antigenemulsionen, die unabhängig vom menschlichen Einfluss ist. Das manuelle Mischen mit Spritzen ist in den meisten Laboratorien Standard, jedoch ist diese Methode zeitaufwendig, führt oft zu einem übermäßigen Materialverlust und die Qualität unterscheidet sich je nach Wissenschaftler, der sie ...

Ein Zusammenbruch der immunologischen Toleranz kann zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose (MS) führen. Es wird geschätzt, dass weltweit 2,8 Millionen Menschen mit MS leben1. Obwohl die genaue Ursache der MS noch weitgehend unbekannt ist, spielen Dysregulation autoreaktiver T- und B-Zellen sowie Defekte in der Treg-Funktion eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der Erkrankung 2,3.
Tiermodelle von Autoimmunerkrankungen sind wesentliche Werkzeuge, um mögliche therapeutische Modalitäten zu untersuchen. Das experimentelle Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird seit fast einem Jahrhundert von Forschern verwendet, die sich für MS4 interessieren. In frühen Experimenten war die Inzidenz der Krankheit relativ gering. Die Einführung eines vollständigen Freund-Adjuvans (CFA), das Mycobacterium und Pertussis-Toxin enthält, ermöglichte die konsistente Induktion von EAE bei Mäusen4. Am wichtigsten ist, dass CFA mit einem ZNS-spezifischen Antigen gemischt werden muss, um eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion zur Induktion von EAE zu erzeugen. Die derzeit gebräuchlichsten EAE-Modelle basieren auf der aktiven Immunisierung von Mäusen mit enzephalitogenen Peptiden. Der genetische Hintergrund der Mäuse spielt eine wichtige Rolle bei der Krankheitsanfälligkeit, wobei Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG35-55) und Myelin-Proteolipidprotein (PLP139-151) Peptide verwendet werden, um EAE in C57BL / 6J- bzw. SJL-Mäusen zu induzieren5. Es können jedoch auch andere Mausstämme und ZNS-abgeleitete Peptide verwendet werden.
Die Qualität der CFA/Peptid-Emulsion ist ein kritischer Faktor, der die Krankheitspenetranz im aktiven ImmunisierungsmodellEAE 6 bestimmt. Eine homogene Wasser-in-Öl-Emulsion muss hergestellt werden, indem die in wässrigem Puffer gelösten enzephalitogenen Peptide mit CFA gemischt werden, da sonst Tiere die Krankheit nicht entwickeln. Zur Herstellung von CFA/Peptid-Emulsionen wurden zahlreiche Protokolle veröffentlicht. Beispiele umfassen die Verwendung eines Wirbels7, Ultraschall8, Spritzen und eines Drei-Wege-T-Steckers9 oder einer Spritze nur5. Alle diese Methoden sind jedoch schwer zu standardisieren und oft mit langwierigen und komplizierten Protokollen verbunden.
Im Vergleich zu allen oben genannten Methoden bietet die hier beschriebene einfache Methode zur Emulsionsherstellung den Vorteil, dass sie keine Unterschiede von Mensch zu Mensch aufweist und relativ schnell ist. Die Emulsion wird durch einen Homogenisator erzeugt, der die Reagenzien mit einer eingestellten Geschwindigkeit, Zeit und Temperatur schüttelt, um schnelle und konsistente Ergebnisse zu gewährleisten. Neben der Induktion von Krankheiten im EAE-Modell kann diese Methode auch verwendet werden, um andere Autoimmunerkrankungsmodelle wie Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) und Antigen-induzierte Arthritis (AIA) zu untersuchen6. Daher wird erwartet, dass diese Methode verwendet werden kann, um Krankheiten in anderen Tiermodellen konsistent zu induzieren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen mit Autoantigenen angewiesen sind, wie experimentelle Autoimmunneuritis (EAN)10, experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT)11, autoimmune Uveitis (EAU)12 und Myasthenia gravis (MG)13. Diese Methode induziert auch allgemeine Immunantworten wie verzögerte Typ-Überempfindlichkeit (DTH) konsistent6 und könnte daher für die Verabreichung von Krebs- und Malariaimpfstoffen verwendet werden (siehe Diskussion).
So wurde eine schnelle (Gesamtherstellungszeit ~30 min), einfache (alle Reagenzien können im Voraus hergestellt und gelagert werden) und standardisierte (die Emulsion wird mit einem Schüttelhomogenisator erreicht) Methode entwickelt und hier vorgestellt. Die nach diesem Protokoll hergestellten CFA/Antigen-Emulsionen induzieren in Autoimmuntiermodellen durchweg Krankheiten.

<table><tbody><tr><td>1 mL Injektionsspritze</td><td>B. Braun</td><td>9166017V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Injektionsspritze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683531</td><td></td></tr><tr><td>7 ml leere Röhrchen mit Verschlüssen</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000944LYSK0A.0</td><td>7 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>50 mL steriles Zentrifugenröhrchen &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10788561</td><td>50 mL Röhrchen</td></tr><tr><td>Bordetella pertussis Toxin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2980</td><td>Bei -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Dispergiermittel, leichtes Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>Bei RT lagern</td></tr><tr><td>Emulsionskit</td><td>Bertin-Instruments</td><td>D34200.10 ea</td><td>Enthält ein Rohr, eine Kappe und einen Kolben</td></tr><tr><td>unvollständig Freund's Adjuvans</td><td>Sigma-Aldbsp</td><td>; F5506</td><td>Bei +4 > lagern; C</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis, H37RA</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF3114-33-8</td><td>Bei +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Mastersizer 2000&nbsp;</td><td>Malvern Panalytical</td><td>N/A</td><td>Partikelgrößenanalysator</td></tr><tr><td>Minilys-Personal Homogenisator</td><td>Bertin-Instruments</td><td>P000673-MLYS0-A</td><td>Schüttelhomogenisator</td></tr><tr><td>MOG 35-55 Peptid&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Innovagen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Montanid ISA 51 VG</td><td>Seppic</td><td>36362Z</td><td>FDA-zugelassenes Öl-Adjuvans</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc Spritzenvorsatzfilter 0,2 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>17124381</td><td>Sterlie Filter</td></tr><tr><td>PBS, Ca2+/Mg2+ frei</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Phasenkontrastmikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX40-B</td><td></td></tr><tr><td>Stahlperlen 3,2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0445832</td><td>Autoklav und Lagerung bei RT</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>648463</td><td>Bei RT aufbewahren</td></tr></tbody></table>

eine schnelle, einfache und standardisierte homogenisierungsmethode zur herstellung von antigen/adjuvans-emulsionen zur induktion experimenteller autoimmuner enzephalomyelitis

A Rapid, Simple, and Standardized Homogenization Method to Prepare Antigen/Adjuvant Emulsions for Inducing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) weist ähnliche immunologische und klinische Merkmale wie Multiple Sklerose (MS) auf und wird daher häufig als Modell verwendet, um neue Wirkstoffziele für eine bessere Patientenbehandlung zu identifizieren. MS ist durch verschiedene Krankheitsverläufe gekennzeichnet: schubförmig-remittierende MS (RRMS), primär progrediente MS (PPMS), sekundär progrediente MS (SPMS) und eine seltene progressiv-schubförmige Form der MS (PRMS). Obwohl Tiermodelle nicht alle diese kontrastierenden Phänotypen menschlicher Krankheiten genau nachahmen, gibt es EAE-Modelle, die einige der verschiedenen klinischen Manifestationen von MS widerspiegeln. Zum Beispiel ahmt Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-induzierte EAE in C57BL / 6J-Mäusen menschliches PPMS nach, während Myelin-Proteolipidprotein (PLP)-induzierte EAE in SJL / J-Mäusen RRMS ähnelt. Andere Autoantigene, wie Myelin Basic Protein (MBP), und eine Reihe verschiedener Mausstämme werden ebenfalls verwendet, um EAE zu untersuchen. Um eine Erkrankung in diesen Autoantigen-Immunisierungs-EAE-Modellen zu induzieren, wird eine Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt und subkutan injiziert. Die meisten EAE-Modelle erfordern auch eine Injektion von Pertussis-Toxin, damit sich die Krankheit entwickeln kann. Für eine konsistente und reproduzierbare EAE-Induktion ist ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der Reagenzien zur Herstellung von Antigen-/Adjuvansemulsionen erforderlich. Das hier beschriebene Verfahren nutzt ein standardisiertes Verfahren zur Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen. Es ist einfach und schnell und verwendet einen Schüttelhomogenisator anstelle von Spritzen, um qualitätskontrollierte Emulsionen herzustellen.

Das schnelle, einfache und standardisierte Protokoll für die Herstellung von CFA/MOG-Emulsionen ist in Abbildung 1 dargestellt. Diese Methode wurde kürzlich an anderer Stelle beschrieben6. Die CFA/MOG-Emulsionen können auch mit anderen Methoden hergestellt werden, wie z.B. dem traditionellen Spritzenverfahren oder durch Vortexen. Diese Methoden wurden hier verglichen, indem die Qualität der Emulsionen bewertet wurde. Alle Methoden erzeugten Wasser-in-Öl-Emulsionen; Di...

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) shares similar immunological and clinical features with multiple sclerosis (MS), and is therefore widely ...

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis oder EAE ist ein Tiermodell, das zur Entwicklung neuer und verbesserter Behandlungen für Patienten mit multipler Sklerose verwendet wird. Die Induktion von Krankheiten bei EAE erfordert eine perfekte Öl- und Wasseremulsion, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Die hier vorgestellte Methode der Emulsionsherstellung ist frei von menschlichen Einflüssen, wodurch Inkonsistenzen von einem Versuch zum anderen begrenzt werden.Obwohl die Methode für EAE optimiert wurde, kann sie auch für andere Autoimmunerkrankungsmodelle und auch zum Testen von Krebsimpfstoffen verwendet werden. Zur Herstellung der CFA-Aufschlämmung werden 100 Milligramm gefriergetrocknete M-Tuberkulose H37 RA und fünf 3,2 Millimeter Stahlperlen zu einem Sieben-Milliliter-Rohr hergestellt. Schütteln Sie das Röhrchen im Homogenisator 60 Sekunden lang bei höchster Geschwindigkeitseinstellung.Fünf Milliliter IFA-Adjuvans in die Tube geben und erneut 60 Sekunden bei höchster Geschwindigkeit schütteln. Dann die Aufschlämmung mit einer Pipette in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen zurücklassen und bei vier Grad Celsius bis zum Gebrauch lagern. Um eine CFA/Peptid-Emulsion herzustellen, laden Sie die erste Zusatzdatei herunter, um die für jedes Reagenz benötigte Menge zu berechnen.Legen Sie dann das verschraubte Rohr und die zu verwendenden Reagenzien auf Eis. Als nächstes fügen Sie die Emulsionskomponenten hinzu. Zuerst PBS, dann das Peptid, die CFA-Aufschlämmung.Und schließlich die IFA. Verschließen Sie den Schlauch mit der Kappe fest, indem Sie ihn mehrmals festziehen und lösen. Schütteln Sie das Röhrchen 5 bis 10 Sekunden lang kräftig von Hand, um die Reagenzien vorzumischen.Legen Sie das Röhrchen in den Schüttelhomogenisator und sichern Sie es mit dem Stab. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf die höchste Einstellung und die Zeit auf 60 Sekunden ein. Sobald der Lauf beendet ist, legen Sie die Röhre für drei Minuten auf Eis und wiederholen Sie den Lauf noch ein oder zwei Mal mit den gleichen Einstellungen.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 G aus einer Minute, um eingeschlossene Luft zu entfernen und die Emulsion zu verdichten. Entfernen Sie die Kappe aus dem Röhrchen. Führen Sie den Kolben in das Röhrchen ein und drücken Sie ihn langsam nach unten, bis er die Oberseite der Emulsion erreicht.Entfernen Sie das Schnappgehäuse an der Unterseite des Röhrchens, indem Sie es drehen. Als nächstes entfernen Sie den Kolben von allen Injektionsspritzen und fügen Sie den Injektionsspritzen eine Nadel hinzu. Befestigen Sie dann die Rückseite der Injektionsspritze an dem dafür vorgesehenen Schloss am Boden des Röhrchens und verriegeln Sie es mit einer kurzen Drehung.Übertragen Sie die Emulsion aus dem Röhrchen in die Injektionsspritze, indem Sie den Kolben vorsichtig drücken. Stoppen Sie, wenn die Emulsion die 0,15-Milliliter-Graduierung der Injektionsspritze erreicht hat. Trennen Sie die Injektionsspritze vom Schlauch und führen Sie den Kolben vorsichtig ein, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in diese Spritze gelangt.Drücken Sie den Kolben, bis die Emulsion aus der Nadel kommt, und wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der im Röhrchen vorhandenen Emulsion. Um die Größe der Wasser- und Ölpartikel zu analysieren, fügen Sie einen winzigen Tropfen der Emulsion zu einem Objektträger hinzu, schmieren Sie ihn mit einem Abdeckschlicker aus und drücken Sie dann hart in einer kreisförmigen Bewegung, um die Emulsion abzuflachen. Untersuchen Sie die verschmierte Emulsion unter einem Phasenkontrastmikroskop mit 400-facher Vergrößerung und fokussieren Sie auf ein Feld mit einer Monoschicht der Emulsion.Stellen Sie sicher, dass kleine, gleichmäßige, graue oder weiße Partikel sichtbar sind. Emulsionen, die durch die Homogenisierungsmethode hergestellt wurden, zeigten graue oder weiße bohnenförmige Partikel, die winzige Tröpfchen von Wasser- und Ölemulsionen darstellten. Im Gegensatz dazu waren die mit der Spritzenmethode hergestellten Emulsionströpfchen größer und breiter.Bei der Wirbelmethode wurden große graue oder schwarze Partikel beobachtet, die Luftblasen entsprechen, die in der Emulsion eingeschlossen sind. Änderungen in der Partikelgrößenverteilung im Laufe der Zeit, die mit einem Laserdefraktions-Partikelgrößenanalysator für Wasser- und Ölemulsionen gemessen wurden, zeigten keine Änderung der Partikelgröße über einen Zeitraum von sechs Wochen. Die frischen 3 Wochen alten und 15 Wochen alten Emulsionen induzierten alle ähnliche EAE-Erkrankungen bei allen Tieren, die während des gesamten Experiments getestet wurden.Mäuse entwickelten in allen Experimenten ein ähnliches Krankheitsbild und zeigten, dass die hier vorgestellte Homogenisierungsmethode Emulsionen erzeugte, die EAE konsistent und reproduzierbar induzierten. Bevor Sie die Emulsion für ein Experiment herstellen, laden Sie die Zusatzdatei Nummer eins herunter, um die Menge jeder Komponente zu berechnen, die zur Minimierung des Abfalls benötigt wird. Mit der hier vorgestellten Methode könnte die Emulsionspräparation nicht nur für die präklinische Forschung, sondern zukünftig auch für die Herstellung von Krebsimpfstoffen in der Klinik standardisiert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion und klinischen Scoring von einem Tiermodell der Multiplen Sklerose: chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in DA-Ratten. Die Krankheit, durch die Immunisierung von Ratten mit einer Emulsion, die ganze Ratte Rückenmark und komplettem Freund-Adjuvans induziert, weist klinische Symptome ähnlich der menschlichen Erkrankung.

Induction and Clinical Scoring von chronisch-rezidivierende experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Autoimmune Hypophysitis kann in Mäusen durch Injektion ein Auszug aus Maus Hypophyse Proteine ​​reproduziert werden.

Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Bestimmte Maus-Stämme sind in der Lage, die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Myelin basisches Protein zu widerstehen. Hier beschriebene ist ein einfaches Protokoll, das die Immunisierung Teilnahmslosigkeit umkehrt und induziert paralytischen Erkrankung in mehreren typischen EAE resistent Maus Flecken.

Die Überwindung der nicht mehr reagiert, in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) Beständig Mausstämmen durch adoptiven Transfer-und Antigen-Challenge

Dieses Video zeigt eine effiziente Homogenisierungstechnik zur Erzeugung einer Antigen-adjuvanten Emulsion zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in einem Mausmodell. Die Emulsion enthält ein Autoantigen – Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) – in der Wasserphase, umgeben von einer kontinuierlichen Ölphase, die aus einem inaktivierten pathogenen Bakterium besteht. Die Emulsion sorgt für eine anhaltende Freisetzung von Antigenen für eine verlängerte...

Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein etabliertes Tiermodell für multiple Sklerose. C57BL / 6 Mäuse mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)-Peptid 35-55 (MOG 35-55) immunisiert, was zu einer aufsteigenden schlaffen Lähmung durch autoreaktive Immunzellen im zentralen Nervensystem verursacht. Protokolle für die Krankheitsinduktion und Überwachung diskutiert.

Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Induzierten experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 Mäuse

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll, das nur grundlegende Laborgeräte verwendet, um große Mengen eines Fusionsproteins zu erzeugen und zu reinigen, das das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein der Maus enthält. Dieses Protein kann verwendet werden, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis zu induzieren, die sowohl von T- als auch von B-Zellen angetrieben wird.

Einfache und effiziente Herstellung und Reinigung von Maus-Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein für experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis Studies

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

In dieser Arbeit stellen wir ein alternatives Protokoll vor, um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in C57BL/6-Mäusen aktiv zu induzieren, indem wir das immunogene Epitop Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG)35-55 verwenden, das in einem unvollständigen Freund-Adjuvans suspendiert ist, das die hitzeabgetötete Mycobacterium avium-Subspezies paratuberculosis enthält.

Adjuvante Aktivität von Mycobacterium paratuberculosis bei der Verbesserung der Immunogenität von Autoantigenen während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis ist eines der am weitesten verbreiteten murinen Modelle der Multiplen Sklerose. Im aktuellen Protokoll werden C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinpeptid immunisiert, was hauptsächlich zu einer aufsteigenden Parese des Schwanzes und der Gliedmaßen führt. Hier besprechen wir das Protokoll der EAE-Induktion und -Auswertung.

Modellierung der Multiplen Sklerose bei beiden Geschlechtern: MOG35-55-induzierte experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis

Erfahren Sie eine standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen für experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis. Dieses Protokoll minimiert menschliche Einflüsse und verbessert die Reproduzierbarkeit in der Immunforschung.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (Video) | JoVE Journal

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

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