Eine neuartige Methode zur Bestimmung der longitudinalen antibakteriellen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien

Bei diesem Protokoll wird die antibakterielle Wirksamkeit von Antibiotika, die aus einem Polymergerät eluiert wurden, in Echtzeit getestet, was dazu beitragen kann, wirksame Formulierungen genau zu bestimmen und ihren Translationswert zu erhöhen. Diese Methode ermöglicht die antibakterielle Wirksamkeitsprüfung in Echtzeit, um die longitudinale Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien zu überwachen und den Bereich der antibakteriellen Aktivität für eine bestimmte Implantatformulierung zu verstehen. Dieses polymere Material wird in über 90 % der gesamten Gelenkersatzteile als Auflagefläche verwendet.

Und diese antibiotikafreisetzenden Formulierungen davon werden als mögliche Behandlungen für periprothetische Gelenkinfektionen entwickelt. Diese Methode kann mit jedem medikamentenfreisetzenden Gerät verwendet werden, wie z. B. porösen Metallen, abbaubaren und nicht abbaubaren Polymeren, Gelen und möglicherweise partikulären Materialien mit materialspezifischen Protokollmodifikationen. Kultivieren Sie die Bakterien zunächst über Nacht in einem Milliliter tryptischer Sojabrühe.

Verdünnen Sie dann die über Nacht gezüchtete Bakteriensuspension in steriler Mueller-Hinton-Brühe (MHB) und überprüfen Sie die lebensfähige Keimzahl mit den Lumineszenzeinheiten vor Beginn des Experiments, wie im Manuskript beschrieben. Legen Sie die reinen und mit Medikamenten beladenen UHMWPE-Streifen in eine Drei-Milliliter-Spritze. Ziehen Sie dann MHB-haltige Bakteriensuspension durch die aufgehängte Nadel bis zur 1,5-Milliliter-Marke in die Spritze.

Legen Sie die Spritze bis zu den angegebenen Zeitpunkten von sechs Stunden auf einen Schüttelinkubator und dann jeden Tag bis zum siebten Tag. Nehmen Sie nach jedem angegebenen Zeitpunkt die Spritze heraus und geben Sie das Medium in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen ab. Führen Sie einen Echtzeit-Test zur mikrobiellen Viabilität durch, wie im Manuskript beschrieben, mit 100 Mikrolitern Bakteriensuspension.

Berechnen Sie nach der Bestimmung der lebensfähigen Bakterienzahl die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter aus den Lumineszenzeinheiten anhand der entsprechenden Standardkurve. Um das Fehlen lebensfähiger Bakterien in den Proben zu überprüfen, die Lumineszenzwerte unterhalb der Nachweisgrenze aufwiesen, verteilen Sie die Kultur auf tryptischen Soja-Agar-Platten. Die Platten über Nacht bei 35 Grad Celsius inkubieren.

Überprüfen Sie dann am nächsten Tag das Vorhandensein von Kolonien. Zentrifugieren Sie die restliche Bakteriensuspension. Saugen Sie die verbrauchten Medien vorsichtig ab.

Lassen Sie 100 Mikroliter Überstand in den Röhrchen mit unsichtbaren Pellets. Resuspendieren Sie die pelletierten Bakterien in frischem MHB. 10 Sekunden lang vortexen, um eine vollständige Resuspension zu gewährleisten.

Ziehen Sie dann die Bakteriensuspension durch die beigefügte Nadel in dieselbe Spritzenauflage. Beginnen Sie mit der Entnahme von reinen und mit Medikamenten beladenen UHMWPE-Oberflächen aus dem Spritzenaufbau nach Abschluss der Studie am siebten Tag. Anschließend die Oberflächen in 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und dreimal mit einem Milliliter sterilem PBS abspülen.

Beschallen Sie die Oberfläche 40 Minuten lang in einem Milliliter sterilem PBS. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der anhaftenden Bakterien, indem Sie einen Lumineszenz-Assay an 100 Mikrolitern der beschallten Probe durchführen. Die Wirkstofffreisetzung aus Vancomycin und Gentamicin-beladenem UHMWPE zeigte eine Burst-Freisetzung nach sechs Stunden, gefolgt von einer konstanten Freisetzungsrate mit einer Konzentration, die größer als die minimale Hemmkonzentration war, bis sieben Tage.

UHMWPE mit Vancomycin und Gentamicin zeigte eine Reduktion von mehr als drei Log-Schichten für anfälliges ATCC 12600 ab sechs Stunden, und eine vollständige Eradikation wurde am dritten Tag beobachtet. Für den Gentamicin-empfindlichen und Vancomycin-Intermediärstamm L1163 verursachten beide wirkstofffreisetzende Materialien nach sechs Stunden eine Reduktion von mehr als drei Log-Schichten, und am ersten Tag wurde kein Koloniewachstum beobachtet. Die Gentamicin-Elution aus UHMWPE hatte keinen Einfluss auf die bakterielle Lebensfähigkeit des Gentamicin-resistenten und Vancomycin-Intermediärstammes L1101.

Im Gegensatz dazu reduzierte die Vancomycin-Elution aus UHMWPE die bakterielle Lebensfähigkeit nach sechs Stunden signifikant. Die Oberflächen sowohl von Gentamicin als auch von Vancomycin-freisetzendem UHMWPE zeigten nach dem siebten Tag keine lebensfähigen adhärenten Bakterien, wenn sie anfälligen und mittleren Resistenzstämmen ausgesetzt waren. Einige lebensfähige Bakterien waren jedoch auf Gentamicin-freisetzendem UHMWPE vorhanden, das mit Gentamicin-resistentem L1101 exponiert war.

Die Oberfläche von reinem Polyethylen zeigte lebensfähige, anhaftende Bakterien, wenn sie jedem Stamm ausgesetzt wurde. Die Trennung der verbrauchten Medien zu jedem Zeitpunkt, die die Verschleppung der mikrobiellen Population erleichtert, ist entscheidend, um die anhaltende Exposition gegenüber den Antibiotika zu simulieren. Diese semistatische Simulationsmethode stellt zwar eine Verbesserung gegenüber statischen Methoden dar, kann aber mit einem kontinuierlichen Aufbau fortgesetzt werden, um die Aktivitätskinetik neuartiger Wirkstoffformulierungen gegen Infektionen besser zu verstehen.

Das Protokoll hat es uns ermöglicht, den Effekt der Wirkstoffelution auf die stammabhängige Bakteriendynamik zu erfassen. Es verbessert die Werkzeuge für die Wirksamkeitsbewertung von Geräten zur dauerhaften Verabreichung von Antibiotika.