Name: Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Lernen Sie eine modifizierte Sandwich-ELISA-Methode zur Quantifizierung von MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen aus Neutrophilen-Extrazellulären-Fallen. Diese Technik ermöglicht die Bewertung von Sepsis-Schweregraden.

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Die Autoren danken Dr. Huq Muhammad Aminul für die Unterstützung bei der Begutachtung des Manuskripts.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von den institutionellen Prüfungsausschüssen der Medizinischen Universität Aichi genehmigt (2017-H341, 2019-H137). Von jedem Teilnehmer wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.
1. Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Für die Durchführung des Sandwich-ELISA-Assays werden die Reagenzien wie unten beschrieben vorbereitet.
<ol><li>Puffer der Beschichtung:<ol><li>Zur Herstellung eines 0,1 mol/l Carbonat-Bicarbonat-Puffers werden 10,6 g wasserfreies Natriumcarbonat (Molekulargewicht, 106 g/mol) und 8,4 g Natriumbicarbonat (Molekulargewicht, 84 g/mol) abgewogen.</li>
		<li>Geben Sie es zu ca. 900 ml destilliertem Wasser in einem Becherglas.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert des Puffers auf 9,6 ein, indem Sie die erforderliche Menge verdünnter Salzsäure oder Natriumhydroxid hinzufügen.</li>
		<li>Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät.</li>
		<li>Fügen Sie dann das erforderliche Volumen destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 1.000 ml zu erreichen.</li>
		<li>Lagern Sie diesen 0,1 mol/L Karbonat-Bikarbonat-Puffer im Kühlschrank bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Blockierender Puffer:<ol><li>Etwa 250 μl 20%iges Natriumazid und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) werden zu 70 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gegeben, die aus 137 mmol/l NaCl, 8,1 mmol/lNa2HPO 4, 2,68 mmol/l KCl und 1,47 mol/l KH2PO 4 (pH7,4) besteht, und vorsichtig mischen.</li>
		<li>Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 100 ml zu erreichen. Die Endkonzentrationen von Rinderserumalbumin und Natriumazid betragen 1 % bzw. 0,05 %. Warten Sie 10 Minuten, dann ist die Lösung gebrauchsfertig.</li>
	</ol></li>
	<li>Waschlösung: 0,5 % t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol-tert-Octylphenylether (Triton X-100) in destilliertem Wasser herstellen.<ol><li>Verdünnen Sie 100% Triton X-100 auf 10% mit destilliertem Wasser und lassen Sie die 10%ige Lösung vor Gebrauch 1 Tag stehen.</li>
		<li>Anschließend wird die 10%ige Triton X-100-Lösung 20-fach mit destilliertem Wasser erneut verdünnt, um eine Konzentration von 0,5 % zu erreichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdünnung der Antikörper:<ol><li>Verdünnen Sie den Fängerantikörper (Anti-MPO-Antikörper [1 mg/ml] oder Anti-NE-Antikörper [1 mg/ml]) vor der Verwendung an Tag 1 des Assays (siehe unten) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:2.000 und den Nachweisantikörper (Peroxidase-konjugierter Anti-DNA-Antikörper) auf 1:40 mit PBS, bevor Sie ihn an Tag 3 des Assays verwenden (siehe unten). HINWEIS: Für das Vorexperiment werden die Isotyp-Antikörper (IgG-Kaninchen [5 mg/ml] und IgG1-Mausklon Ci4 [0,5 mg/ml]) im Beschichtungspuffer (pH 9,6) auf 1:10.000 und 1:1.000 verdünnt.</li>
	</ol></li>
	<li>ABTS-Substratlösung: Je nach Anzahl der Proben eine, zwei oder drei 2,2'-Azino-Bis(3-Ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS)-Tabletten in 5 ml, 10 ml oder 15 ml ABTS-Puffer (mit Natriumperborat, Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat) auflösen; pro Probe werden 100 μl benötigt. Lagern Sie die zubereitete Lösung bei 2-8 °C lichtgeschützt. Die Lösung ist bis zu 3 Monate haltbar.</li>
</ol>2. Probenentnahme und -lagerung
<ol><li>Plasma-Isolierung:<ol><li>4 ml periphere Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-g-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen entnommen und bei 1.600 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Den Überstand in ein 2-ml-Probenröhrchen mit sicherem Verschluss überführen.</li>
		<li>Der Überstand wird bei 16.000 x g für 10 min bei 4 °C erneut zentrifugiert, um alle Restzellen zu entfernen.</li>
		<li>Sammeln Sie den Überstand in einem neuen Probenröhrchen mit sicherer Verriegelung, ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu stören.</li>
		<li>Lagern Sie das erhaltene Plasma bis zur weiteren Verwendung bei −80 °C. HINWEIS: Um mit diesem Assay Ergebnisse mit hohem Durchsatz zu erzielen, sind Proben von guter Qualität erforderlich. Wenn Plasmaproben verwendet werden, führen Sie eine zweite Zentrifugation durch, um alle Restzellen zu entfernen. Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen der Proben. Verwenden Sie Heparin als Antikoagulans, da EDTA die DNase-Aktivität beeinflusst.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung polymorphkerniger Neutrophiler<ol><li>Die peripheren Blutproben werden durch Venenpunktion mit einer 22-G-Spritze in ein Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen gesammelt.</li>
		<li>6 ml Blut werden auf 6 ml einstufige Polymorphe aufgetragen und die Röhrchen bei 1.000 x g für 45 Minuten bei Raumtemperatur (RT) zentrifugiert.</li>
		<li>Entnehmen Sie die dritte Buffy-Coat-Schicht, die Neutrophile enthält, und waschen Sie sie dreimal in phenolrotfreiem RPMI-1640 bei 400 x g für 10 Minuten bei RT.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die neutrophilen Granulozyten in phenolrotfreiem RPMI-1640, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und zählen Sie die Zellen im Mikroskopfeld mit einem Hämozytometer. HINWEIS: Diese Methode ergibt eine Reinheit von 96 % bis 98 % bei einer Lebensfähigkeit von mehr als 95 %, wie durch den Ausschluss des Farbstoffs Trypanblau bewertet.</li>
	</ol></li>
	<li>Aktivierung von polymorphkernigen Neutrophilen und NETose in vitro
	<ol><li>Frisch isolierte polymorphkernige Neutrophile werden auf 1 × 105 Zellen/ml in phenolrotfreiem RPMI-1640 verdünnt, das 2 mM L-Glutamin enthält, ergänzt mit 6 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, und in 35-mm-Kulturschalen ausgesät.</li>
		<li>Um NETs zu induzieren, werden polymorphkernige Neutrophile mit 25 nM PMA für 4 h bei 37 °C in 5 % CO2/95 % Luft stimuliert.</li>
		<li>Nach 4 h Inkubation werden die NETs teilweise verdaut, indem 0,6 μg/ml DNase I 15 min lang bei RT direkt in die Kulturschalen gegeben werden, und die DNase I-Aktivität durch Zugabe von 5 mM EDTA gestoppt.</li>
		<li>Das Medium, das die synthetisierten NETs enthält, wird aufgefangen und bei 400 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen.</li>
		<li>Die Überstände aus vier gesunden Kontrollen gewinnen, mischen und bis zur Verwendung bei −80 °C lagern. HINWEIS: DNase-verdaute PMA-stimulierte Neutrophile, die von vier gesunden Kontrollen gewonnen wurden, werden als NET-Standard 1,14,15 verwendet. Generieren Sie eine Kalibrierkurve aus einem seriell verdünnten NET-Standard mit PBS und weisen Sie die aus einem unverdünnten NET-Standard erhaltenen optischen Dichtewerte (OD) als 100% NET zu.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analysemethode
HINWEIS: Die Schritte zur Durchführung des Assays werden im Folgenden ausführlich beschrieben.
<ol><li>Tag 1<ol><li>Tragen Sie insgesamt 100 μl verdünnten Anti-MPO- oder Anti-NE-Antikörper mit 0,05 μg Antikörper auf jede Vertiefung der Platte, einschließlich der Blindvertiefung, auf. HINWEIS: Der Beschichtungspuffer darf kein Detergens enthalten, da sich die Antikörper sonst nicht gleichmäßig und gleichmäßig an die Wände der einzelnen Vertiefungen binden können. Um den Hakeneffekt zu verhindern, darf die Konzentration des Beschichtungsproteins nicht mehr als 20 μg/ml betragen, da Konzentrationen über diesem Wert die meisten verfügbaren Stellen auf der Mikrotiterplatte sättigen. Der typische Konzentrationsbereich von Proteinbeschichtungslösungen liegt bei 2-10 μg/ml. Für das vorläufige Experiment wird verdünnter Isotyp-Kontrollantikörper IgG-Kaninchen anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen MPO verwendet. Verwenden Sie verdünnte Isotyp-Kontrollantikörper IgG1-Maus für die Beschichtung anstelle von spezifischen monoklonalen Antikörpern gegen NE.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2<ol><li>Verwerfen Sie die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.</li>
		<li>Blockieren Sie jede Vertiefung der ELISA-Platte mit 200 μl des Blockierungspuffers.</li>
		<li>Decken Sie die Platte eng mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und inkubieren Sie sie 1,5-2 Stunden lang bei RT, um die Vertiefungen zu verstopfen.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Blockierungslösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.</li>
		<li>Entfernen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken klopfen.</li>
		<li>Tragen Sie insgesamt 25 μl Plasma oder Medium auf jede Vertiefung mit Ausnahme der Leervertiefung auf und fügen Sie 75 μl PBS als Verdünnungsmittel hinzu, um das endgültige Volumen auf 100 μl zu erhöhen. 100 μl PBS in die Leervertiefung geben.</li>
		<li>Mischen Sie dann die Proben 10 s lang bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Shaker stellen.</li>
		<li>Tragen Sie 2 μl 100-fach verdünnte DNase I (0,03 mg/ml) auf jede Vertiefung auf, einschließlich der Leervertiefung (Endkonzentration von DNase I in der Reaktionsmischung: 0,6 μg/ml).</li>
		<li>Versiegeln Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und mischen Sie die Proben 10 s lang gründlich bei RT, indem Sie die Platte mit 250 U/min auf einen Schüttler legen. HINWEIS: Um die optimalen Bedingungen für die DNA-Verdauung zu bewerten, haben wir bei der Entwicklung des Assays Proben, die MPO-assoziierte DNA von Patienten mit COVID-19 enthalten, 15 Minuten lang bei RT mit 0-0,9 μg/ml DNase I inkubiert und Platten verwendet, die mit einem spezifischen Fängerantikörper für MPO oder einem speziesangepassten Isotyp-Kontrollantikörper beschichtet waren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben für 15 Minuten bei RT.</li>
		<li>Entfernen Sie die selbstklebende Kunststoffabdeckung und tragen Sie 1 μl 0,5 M EDTA auf jede Vertiefung auf, um die DNase-Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Verschließen Sie die Platte wieder mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und schütteln Sie sie 15 s lang bei RT, indem Sie sie mit 250 U/min auf einen Shaker legen.</li>
		<li>Anschließend wird die Platte über Nacht bei 4 °C inkubiert, damit sich die Proteinkomponenten der NETs an die Fängerantikörper anlagern können.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3<ol><li>Entferne die selbstklebende Plastikabdeckung und entsorge die Lösung aus den Vertiefungen.</li>
		<li>Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl der Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.</li>
		<li>Tragen Sie insgesamt 100 μl des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Nachweisantikörpers auf jede Vertiefung auf.</li>
		<li>Verschließen Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang bei RT.</li>
		<li>Verwerfen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen, pipettieren Sie dann 300 μl Waschlösung pro Vertiefung und wiederholen Sie diesen Waschvorgang drei- bis viermal.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Restlösung.</li>
		<li>Tragen Sie insgesamt 100 μl ABTS-Substratlösung auf jede Vertiefung auf und decken Sie die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab.</li>
		<li>Die Platte im Dunkeln bei RT 20-30 min auf einem Shaker bei 250 U/min inkubieren. HINWEIS: Überwachen Sie die Platte in 5-Minuten-Intervallen, bis die gewünschten OD-Messwerte erreicht sind.</li>
		<li>Fügen Sie insgesamt 50 μl 2 M Schwefelsäure hinzu, um die Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Mischen Sie den flüssigen Inhalt der Vertiefungen, indem Sie vorsichtig auf die Seite der Platte klopfen.</li>
		<li>Schalten Sie das Mikroplatten-Lesegerät ein und schließen Sie es an den Computer an.</li>
		<li>Öffnen Sie die Softwareanwendung auf dem Computer.</li>
		<li>Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.</li>
		<li>Stellen Sie alle folgenden Parameter für das Lesen der Platte ein: Lesetyp, Absorption; Lesemodus, Endpunkt; Wellenlängen, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisches Mischen und Ausblenden vor, Aus; Vorgelesene Platte, Aus; Automatische Kalibrierung, Ein; Streifen, ganze Platte lesen; Wellenlängenpriorität der Spalte, Priorität der Spalte; Wagengeschwindigkeit, Normal; und Automatisches Lesen, Aus.</li>
		<li>Legen Sie dann die 96-Well-Platte mit den Proben in die Schublade und schließen Sie sie.</li>
		<li>Wählen Sie abschließend die Schaltfläche Lesen , damit die Platte sofort gelesen wird.</li>
		<li>Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einem Mikroplatten-Reader ab (verwenden Sie in diesem Stadium eine Wellenlänge von 490 nm als Referenz).</li>
		<li>Führen Sie eine automatische Subtraktion des Absorptionswerts des Assay-Mediums allein von allen unbekannten Proben durch und speichern Sie die Daten. ANMERKUNG: Zur Berechnung der relativen Nettokonzentration in der Probe 1,14,15 ist eine Standardkurve zu verwenden, die aus dem seriell verdünnten NET-Standard gewonnen wurde. Hier werden die Endergebnisse als "MPO- oder NE-DNA-Komplexe (% des NET-Standards)" dargestellt. Die Nachweisgrenze (LOD) wurde aus der Standardabweichung (SD) und der Steigung der Kalibrierkurve (S) wie folgt berechnet: LOD = 3,3(SD/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Statistik
<ol><li>Führen Sie alle statistischen Analysen mit einer geeigneten statistischen Analysesoftware durch. Hier kam SigmaPlot v14.5 zum Einsatz. Prozentsätze und kontinuierliche Variablen werden aufgrund der verzerrten Verteilung der meisten Parameter als Median mit dem Interquartilsabstand angezeigt.</li>
	<li>Vergleichen Sie die MPO-DNA- und NE-DNA-Plasmaspiegel zwischen COVID-19-Patienten und gesunden Kontrollpersonen mit dem Wilcoxon-Rangsummentest. Verwenden Sie die Korrelationsanalyse, um die Beziehung zwischen der optischen Dichte und dem Prozentsatz des NET-Standards zu untersuchen.</li>
</ol>

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<li>Gong, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+biomarkers+and+immune+features+of+sepsis+using+bioinformatics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis.</a> Mediators of Inflammation. 2020, 3432587(2020).</li>
<li>Almansa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+correlates+of+organ+failure+extent+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis.</a> Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).</li>
</ol>

Alle Daten, die während dieser Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Wir haben eine Sandwich-ELISA-Methode beschrieben, bei der MPO oder NE während der anfänglichen Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers bindet. Nach dem Waschen wird das "Sandwich" vervollständigt, indem die Proben mit einem Peroxidase-assoziierten monoklonalen Anti-DNA-Antikörper inkubiert werden. Nach der Entfernung des ungebundenen Sekundärantikörpers wird das gebundene Peroxidase-Konjugat durch Zugabe eines chromogenen ABTS-Peroxidase-Substrats detektie...

In diesem Artikel wird eine Methode zur Quantifizierung der Bildung von extrazellulären Fallen (NET) in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, indem der Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verwendet wird, um Komplexe von Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) mit DNA 1,2 nachzuweisen. NETs bestehen aus einem DNA-Rückgrat, das mit antimikrobiellen Proteasen aus neutrophilen Granula dekoriert ist 3,4. Sowohl MPO-DNA- als auch NE-DNA-Komplexe sind wichtige und spezifische Bestandteile von NETs und werden als Abbauprodukte von NETsin den extrazellulären Raum freigesetzt 3,4.
Neben ihrer wichtigen physiologischen Rolle bei der antimikrobiellen Abwehr3 haben NETs auch verschiedene pathologische Wirkungen4,5, einschließlich der Förderung der Thrombogenese6 und der Verschlechterung der Sepsis7. Dementsprechend haben NETs in letzter Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Nichtsdestotrotz hat sich die In-vivo-Quantifizierung von NETs als schwierig erwiesen, da es keine empfindliche, zuverlässige quantitative Assay-Methode gibt.
Es stehen einige Methoden zur Verfügung, darunter die direkte Messung von NETs mittels Fluoreszenzmikroskopie8,9 und Durchflusszytometrie 10 sowie die indirekte Messung von zirkulierender zellfreier DNA, Nukleosomen und citrulliniertem Histon H3, aber jede Methode hat ihre eigenen Vorteile und Einschränkungen11. Obwohl die immunfluoreszenzmikroskopische Methode spezifisch für NETs ist und die Lokalisation und den Grad der NET-Bildung deutlich zeigt, sind die Proben auf Biopsiegewebe und sezernierte Materialien beschränkt. Darüber hinaus muss diese Methode von erfahrenen Forschern durchgeführt werden und erfordert eine lange Zeit, bis Ergebnisse vorliegen. Die Messung der zirkulierenden Konzentrationen von NET-bezogenen Komponenten mittels Durchflusszytometrie ist einfach und liefert schnell Ergebnisse. Die Methode ist jedoch nicht spezifisch für NETs12.
Wir13 und andere 1,2 haben einen hochempfindlichen und zuverlässigen Assay entwickelt, um die zirkulierenden NET-Komponenten, MPO-konjugierte oder NE-konjugierte DNA, in menschlichem Plasma mit einer modifizierten ELISA-Technik zu messen, die spezifische Antikörper für MPO oder NE als Fangantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper verwendet. Dieser Assay kann auch ex vivo verwendet werden, um NET-Komponenten in Zellkulturüberständen zu identifizieren, die von aktivierten Neutrophilen als Reaktion auf die Stimulation von Phorbol-12-Myristat-13-Acetat (PMA) freigesetzt werden.

<table><tbody><tr><td>1-Step Polymorphs</td><td>Accurate Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>Isolierung von PMNs aus menschlichem Blut.</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466 ABTS-Pufferlösung</td> mit <td>flachem Boden</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Enthält Natriumperborat, Zitronensäure und Dinatriumhydrogenphosphat.</td></tr><tr><td>ABTS Tabletten</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Jede Tablette enthält 5 mg ABTS-Substrat und 60 mg Vehikelsubstanzen.</td></tr><tr><td>Selbstklebende Kunststoffabdeckung, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I</td><td>Bei 2-8 °C lagern, 1 Jahr haltbar. Die Wirtsart ist das Kaninchen.</td></tr><tr><td>Anti-NE-Antikörper, Klon AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td> Bei <td>2-8 μC lagern, 1 Jahr stabil. Die Wirtsart ist die Maus.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Biomedical Science</td><td>BR-220700081</td><td>Albumin aus Rinderfraktion V. Bei 2&ndash; lagern; 8 &°C. 2 Jahre haltbar.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M</td><td>Lagern bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>IgG, Kaninchen, Isotyp-Kontrolle</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Als konzentrierte Lösung bei 2&ndash; lagern; 8 &°C.</td></tr><tr><td>IgG1, Maus-Isotyp-Steuerung, Klon Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>Als konzentrierte Lösung bei 2&ndash; lagern; 8 &°C.</td></tr><tr><td>Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroplattenmischer</td><td>Als ein Unternehmen</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Jedes Mikroplatten-Reader, das Wellenlängen von 405&ndash; 490 nm verwendet werden können.</td></tr><tr><td>Anwendung für Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-konjugierter Anti-DNA-Antikörper, Zelltoderkennung ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; Flasche 2. Lagern bei 2&ndash; 8 &°C. 1 Jahr haltbar.</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristat-13-acetat</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Aktivierung von PMN's aus menschlichem Blut.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Lösung</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Bei Raumtemperatur lagern. Stabil für 6 Monate.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San Jose, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol tert-octylphenylether</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr></tbody></table>

quantifizierung von myeloperoxidase-dna- und neutrophilen elastase-dna-komplexen aus extrazellulären neutrophilenfallen unter verwendung eines modifizierten sandwich-elisa

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Bestimmte Stimuli, wie z. B. Mikroorganismen, veranlassen Neutrophile, neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freizusetzen, bei denen es sich im Wesentlichen um netzartige Strukturen handelt, die aus DNA mit Körnerproteinen wie Myeloperoxidase (MPO) und neutrophiler Elastase (NE) sowie zytoplasmatischen und zytoskelettalen Proteinen bestehen. Obwohl das Interesse an NETs in letzter Zeit zugenommen hat, gibt es keine empfindliche, zuverlässige Testmethode für die Messung von NETs im klinischen Umfeld. Dieser Artikel beschreibt einen modifizierten Sandwich-Enzym-gekoppelten Immunosorbent-Assay zur quantitativen Messung von zwei Komponenten zirkulierender NETs, MPO-DNA und NE-DNA-Komplexe, die spezifische Bestandteile von NETs sind und als Abbauprodukte von NETs in den extrazellulären Raum freigesetzt werden. Der Assay verwendet spezifische monoklonale Antikörper gegen MPO oder NE als Fängerantikörper und einen DNA-spezifischen Detektionsantikörper. MPO oder NE bindet während der ersten Inkubation von Proben, die MPO-DNA- oder NE-DNA-Komplexe enthalten, an eine Stelle des Fängerantikörpers. Dieser Assay weist eine gute Linearität und eine hohe Präzision zwischen und innerhalb des Assays auf. Wir setzten es bei 16 Patienten mit COVID-19 und damit einhergehendem akutem Atemnotsyndrom ein und stellten fest, dass die Plasmakonzentrationen von MPO-DNA und NE-DNA signifikant höher waren als im Plasma gesunder Kontrollen. Dieser Detektionsassay ist eine zuverlässige, hochempfindliche und nützliche Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs in humanen Plasma- und Kulturüberständen.

Bei dieser Methode wurde ein Sandwich-ELISA mit monoklonalen Anti-MPO-, Anti-NE- und Anti-DNA-Antikörpern verwendet, um MPO-assoziierte und NE-assoziierte DNA zu messen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wurden die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit einem MPO- oder NE-spezifischen monoklonalen Antikörper beschichtet, um DNA-assoziiertes MPO und DNA-assoziiertes NE sowie nicht-DNA-assoziiertes MPO und NE einzufangen. Zur Berechnung des Intra-Assay-Variabilitätskoeffizienten (CV) wurden fü...

Wir präsentieren ein Protokoll für eine modifizierte Sandwich-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Technik zur quantitativen Messung von zwei Komponenten von neutrophilen extrazellulären Fallenresten, Myeloperoxidase-konjugierter DNA und neutrophiler Elastase-konjugierter DNA-Komplexe, die von aktivierten Neutrophilen abgeleitet sind.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

NETs haben in jüngster Zeit Aufmerksamkeit erregt, aber die Quantifizierung von NETs in vivo hat sich als schwierig erwiesen. Dieses Protokoll bietet eine wünschenswerte, hochempfindliche und wertvolle Methode zur Untersuchung der Eigenschaften von NETs im klinischen Umfeld. Diese Technik sollte erweitert werden, um den Schweregrad der Sepsis oder des septischen ARDS, des akuten Atemnotsyndroms, zu beurteilen.Es ist allgemein anerkannt, dass die Regulierung von Dumps oder schadensassoziierten molekularen Mustern ein Schlüssel zur Verbesserung des klinischen Zustands der Sepsis ist. Der größte Vorteil dieser Methode ist die genaue Quantifizierung von zirkulierenden NET-Resten wie Myeloperoxidase-DNA und neutrophiler Elastase-DNA in kurzer Zeit. Es ist ratsam, die Proben vor dem Assay zu schleudern und wiederholtes Auftauen zu vermeiden.Es ist wichtig, die im Protokoll angegebenen Inkubationszeiten einzuhalten. Beginnen Sie mit der Verdünnung frisch isolierter polymorphkerniger Neutrophiler auf 10.000 Zellen pro Milliliter in phenolrotfreiem RPMI 1640. In 35-Millimeter-Kulturschalen sieben.Um neutrophile extrazelluläre Fallen oder NETs zu induzieren, stimulieren Sie zunächst die polymorphkernigen Neutrophilen mit 25 nanomolaren PMA. Dann werden die extrazellulären Fallen durch Zugabe von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I teilweise verdaut und die Mischung 50 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie nun fünf-millimolares EDTA hinzu, um die DNase-Aktivität zu stoppen, und sammeln Sie das Medium, das die synthetisierten NETs enthält.Zentrifugieren, um die Zelltrümmer zu entfernen. Sammle die Überstände von vier gesunden Kontrollen. Mischen Sie sie und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die weitere Verwendung.Pipettieren Sie 100 Mikroliter verdünnte Antimyeloperoxidase mit 0,05 Mikrogramm des Antikörpers in eine ELISA-Platte. Decken Sie nun die Platte mit einer selbstklebenden Kunststoffabdeckung ab, um die Verdunstung der Probe zu verhindern, und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um die Bindung der Fängerantikörper zu ermöglichen. Am nächsten Tag wird die verdünnte Antikörperlösung aus den Vertiefungen entsorgt und 300 Mikroliter Waschlösung in jede Vertiefung pipettiert.Klopfen Sie die Platte auf einem Papiertuch trocken, um den überschüssigen PBS zu entfernen. Blockieren Sie jede Vertiefung der Platte mit 200 Mikrolitern des Sperrpuffers. Decken Sie es mit einer selbstklebenden Plastikabdeckung ab und verstopfen Sie die Vertiefungen, indem Sie es inkubieren.Nachdem Sie die Blockierungslösung aus den Vertiefungen entsorgt und die Platte drei- bis viermal gewaschen haben, klopfen Sie sie auf einem Papiertuch trocken. Als nächstes pipettieren Sie 25 Mikroliter Plasma in alle Vertiefungen mit Ausnahme des Rohlings. Und verdünnen Sie es mit 75 Mikrolitern PBS, so dass das endgültige Well-Volumen 100 Mikroliter beträgt.Geben Sie dann 100 Mikroliter PBS in die leere Vertiefung. Mischen Sie die Proben, indem Sie die Platte 10 Sekunden lang bei 250 U/min bei Raumtemperatur auf einen Shaker legen. Geben Sie zwei Mikroliter 100 voll verdünnte DNase I in alle Vertiefungen und legen Sie die versiegelte Platte 10 Sekunden lang auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie einen Mikroliter 0,5 molar EDTA in jede Vertiefung, um die DNase-Reaktion zu stoppen. Legen Sie dann die versiegelte Platte für 15 Sekunden auf den Schüttler, um die Proben gründlich zu mischen.Zum Schluss wird die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert, damit sich die Proteinbausteine der NETs an die Fängerantikörper anlagern können. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Lösung aus den Vertiefungen. Nach mehreren Well-Waschungen werden 100 Mikroliter des verdünnten Peroxidase-konjugierten Anti-DNA-Detektionsantikörpers in jede Vertiefung pipettiert.Die Platte 1 1/2 Stunden lang inkubieren und dann die Lösung in die Vertiefungen geben. Nach dem dreimaligen Waschen der Vertiefungen werden 100 Mikroliter ABTS-Substratlösung in jede Vertiefung pipettiert und die versiegelte Platte auf einem Schüttler im Dunkeln inkubiert. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter zweimolare Schwefelsäure hinzufügen.Mischen Sie den Inhalt der Vertiefung, indem Sie vorsichtig auf die Tellerränder klopfen. Schließen Sie als Nächstes den Mikroplatten-Reader an den Computer an und starten Sie die Softwareanwendung. Erstellen Sie in der Statusleiste ein neues Experiment, und geben Sie ihm einen Namen.Legen Sie dann die Parameter für das Ablesen der Platte fest, indem Sie Absorption als Lesetyp, Endpunkt als Lesemodus und zwei als Wellenlängen auswählen. Legen Sie als Nächstes Lambda eins auf 405 Nanometer und lambda zwei auf 490 Nanometer fest. Wählen Sie nun den Status "Aus" sowohl für "Automix" als auch für "Blanking" aus, während Sie die Option "AutoKalibrierung" auf "Ein" setzen.Wählen Sie dann unter "Streifen" die Option "Gesamte Platte lesen" aus.Legen Sie abschließend die Wellenlängenpriorität der Spalte mit Normal als Wagengeschwindigkeit fest, und wählen Sie dann unter AutoRead die Option Aus aus. Legen Sie die Platte gut in die Instrumentenschublade und schließen Sie sie. Klicken Sie auf Lesen, damit die Platte sofort gelesen wird.Lesen Sie die Absorption jedes Wells bei 405 Nanometern ab und führen Sie eine automatische Subtraktion der Absorption des Assaymediums von allen unbekannten Proben durch. Zuverlässige Standardkalibrierungskurven wurden sowohl für MPO-DNA als auch für NE-DNA erhalten, wenn die Absorptionswerte 0,93 bzw. 0,9 nicht überschritten. Die höchste OD wurde bei der Anwendung von 0,6 Mikrogramm pro Milliliter DNase I erzielt.Die Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für die Komplexe bei gesunden Kontrollen betrugen 1,871 bzw. 0,987, während die COVID-19-Patienten Variabilitätskoeffizienten von 2,532 bzw. 2,010 aufwiesen. Die mittleren Inter-Assay-Variabilitätskoeffizienten für MPO-DNA und NE-DNA betrugen 6,524 bzw. 4,389. Die Spezifität der Fängerantikörper gegenüber den MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen zeigte, dass die Isotyp-Kontrollantikörper wenig auf die Komplexe reagierten.Der prozentuale Anteil beider Komplexe war im Plasma von Patienten mit COVID-19 höher als bei den gesunden Kontrollen. Die Verdauungszeit sollte optimiert werden, da sonst eine übermäßige Verdauung die Absorption verringert.

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) sind ein wichtiger angeborenen Immunsystems Mechanismus auf pathogene Bakterien, Pilze und Parasiten zu kämpfen. Hier beschreiben wir Methoden, um neutrophilen Granulozyten aus menschlichem Blut zu isolieren und sie zu aktivieren, um NETs zu bilden. Wir präsentieren Vorbereitung Techniken, um NETs in Licht-und Elektronenmikroskopie zu visualisieren.

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Dieses Video zeigt die Induktion und Visualisierung von extrazellulären Neutrophilen-Fallen oder NETs in vormarkierten Neutrophilen unter Verwendung von Patientenserum, das zytoplasmatische Antikörper gegen Neutrophile enthält. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines undurchlässigen DNA-Farbstoffs und der Fluoreszenzmikroskopie die Visualisierung von NETs.

Induktion und Visualisierung von extrazellulären Fallen von Neutrophilen in vormarkierten Neutrophilen

Es werden Hochdurchsatz-Assays vorgestellt, die in Kombination hervorragende Werkzeuge zur Quantifizierung der NET-Freisetzung von menschlichen Neutrophilen bieten.

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Wir beschreiben Methoden zum isolieren eckzahn Neutrophils aus Vollblut und NET Bildung in live Neutrophilen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu visualisieren. Protokolle, NET Bildung und citrullinierte Histon H3 zu quantifizieren sind auch beschrieben (citH3) Ausdruck mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erzeugung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und zum Betrieb von NETQUANT vor, einer vollautomatischen Softwareoption zur Quantifizierung von NETs in Immunfluoreszenzbildern.

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Dieses Protokoll beschreibt einen hochempfindliche und hohen Durchsatz Neutrophilenzahl extrazelluläre Falle (NET) Assay für die halbautomatische Quantifizierung von ex-Vivo NET Bildung durch Immunfluoreszenz dreidimensionale konfokalen Mikroskopie. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um NET Bildung und Abbau nach verschiedenen Reize zu bewerten und kann verwendet werden, um mögliche NET gezielte Therapien zu studieren.

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Hier wird ein Protokoll für die Induktion und Analyse von in vitro neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) vorgestellt. Die Quantifizierung von DNA, Cathelicidin (LL37) und Enzymaktivität ergab Daten, die die Variabilität in der Zusammensetzung und Morphologie von NETs zeigen, die durch mikrobielle und chemische Stimuli unter ähnlichen kontrollierten Bedingungen induziert werden.

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.

Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Lernen Sie eine modifizierte Sandwich-ELISA-Methode zur Quantifizierung von MPO-DNA- und NE-DNA-Komplexen aus Neutrophilen-Extrazellulären-Fallen. Diese Technik ermöglicht die Bewertung von Sepsis-Schweregraden.

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA (Video) | JoVE Journal

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

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