3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik mit Calcofluor im Moos Physcomitrium patens
10. Februar 2023
Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der 3D-Zellwanddynamik von lebendem Moosgewebe vor, das die Visualisierung der Ablösung von Zellwänden in ggb-Mutanten und die Verdickung von Zellwandmustern im Wildtyp während der Entwicklung über einen langen Zeitraum ermöglicht.
Zeitrafferaufnahmen mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Beobachtung der dynamischen Veränderungen von Wachstum und Entwicklung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dieses einfache Protokoll für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung kann die Zellwanddynamik über einen langen Zeitraum direkt untersuchen. Dieses Protokoll verwendet Calcofluorfarbstoff, um die Dynamik der Zellwanddicke zu markieren, und erfordert daher keine Transformation eines fluoreszierenden Proteins.
Die Calcofluor-Signale sind stabil und können länger als eine Woche anhalten. Diese Methode kann auf viele andere Systeme mit einfachen Strukturen, die Zellwände enthalten, angewendet werden und kann durch Calcofluor gefärbt werden, z. B. in Blütenpflanzen. In diesem Protokoll sind die Calcofluor-Signale stabil, wenn dieser Farbstoff während des gesamten Prozesses der Zeitraffer-Bildgebung innerhalb des Mediums gemischt wird.
Verteilen Sie zunächst das sieben Tage alte Moosgewebe in ein 1,5-Milliliter-Mikroröhrchen mit 20 Mikrolitern sterilisiertem Wasser. Für den Wildtyp verwenden Sie eine Pinzette, um die Protonemata zu trennen. Für die ggb-Mutante trennen Sie die Protonemata mit der AP-1000-Pipette.
Geben Sie 10 Mikroliter des sterilisierten Calcofluor-Weiß in das Mikroröhrchen und lassen Sie das Röhrchen zum Färben zwei Minuten aufrecht in der Haube. Unmittelbar nach dem Färben mischen Sie die Pflanzen mit 200 Mikrolitern gekühltem BCDATG-haltigen BCDATG-Medium, indem Sie fünfmal mit einer P1000-Pipette pipettieren und die Mischung in eine 27-Millimeter-Glasbodenschale überführen. Stellen Sie sicher, dass die 200 Mikroliter BCDATG mit den Proben gleichmäßig auf der Oberfläche der 27-Millimeter-Glasbodenschale verteilt sind, um eine dünne Schicht Film zu erzeugen, so dass sich die Proben während der Bildgebung innerhalb des objektiven Arbeitsabstands befinden.
Nach dem Erstarren für zwei Minuten bei Raumtemperatur die dünne Schicht mit drei Millilitern abgekühltem BCDATG abdecken und 10 Minuten ruhen lassen, um wieder zu erstarren. Zeichnen Sie auf der Unterseite der Schale jeweils neun Linien in paralleler und senkrechter Richtung und markieren Sie die Zeilen mit Zeichen von A bis H und die Spalten mit Zahlen von eins bis acht. Verwenden Sie oben, unten, rechts, in der Mitte und links, um die Positionen innerhalb jedes Quadrats zu markieren.
Wenn sich beispielsweise eine Pflanze in einem Quadrat in der zweiten Reihe, in der sechsten Spalte, befindet und im oberen linken Teil des Quadrats positioniert ist, erhält diese Pflanze den Namen b6 oben links. Stellen Sie die Glasbodenschale für ein bis zwei Tage unter weißes Licht, bevor Sie jeden Tag bis zu drei Tage lang einer Zeitrafferaufnahme unterzogen werden. Um die 3D-Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie die ND2-Datei und klicken Sie auf Lautstärke.
Rekonstruieren Sie die Zellwand am Tag Null, Tag eins, Tag drei und Tag vier. Nachdem Sie jedes Bild aufgenommen haben, legen Sie die Glasschale zurück in die Zuchtkammer. Dynamische Veränderungen der Querwände wurden durch Kalcofluor-Weiß-Färbung bei Wildtyp- und GGB-Mutanten gezeigt.
Bei ggb-Mutanten zeigen weiße gestrichelte Linien unter jedem Bild die gebrochene Oberflächenzellwand in den expandierenden Zellen und orangefarbene Linien die Zellen unter der Zellwandoberfläche in ggb an. Die Unterschiede im Calcofluor-Weiß-Signal können an den Oberflächenpositionen der Zellen nachgewiesen werden, und weniger dicht gefärbte Regionen deuteten auf eine Zellexpansion in ggb-Mutanten oder neu verzweigten Stellen im Wildtyp hin. Für die Wildtyp-Vorkultur sind die Pflanzen in schwachem rotem Licht von oben für fünf Tage erforderlich, um die phototropen Reaktionen von Protonemata zu induzieren, so dass die Pflanzen am Boden des Geschirrs befestigt werden können und die Pflanzen innerhalb des objektiven Aufwärtsabstandes während der Bildgebung auftauchen können, da Calcofluor-Weiß mit anderen Farbstoffen wie Mikrosphäre verwendet werden kann.
Zusätzliche Informationen über die Zellexpansion können ebenfalls untersucht werden. Die Dynamik der pflanzlichen Zellwand ist entscheidend für effizientes Wachstum und Entwicklung sowie für die Reaktion auf Umweltsignale. Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Aufteilung von Änderungen in Zellwandsignalen und die Integration.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Manuskript präsentiert ein detailliertes Protokoll für 3D-Zeitrafferaufnahmen der Zellwanddynamik in lebendigem Moosgewebe. Die Methode ermöglicht die Visualisierung der Zellwandablösung bei ggb-Mutanten und Verdickungsmustern bei wildtypischem Moos während der Entwicklung über einen längeren Zeitraum.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Pflanzenentwicklung
- Mikroskopietechniken
Hintergrund
- Zeitrafferaufnahmen sind entscheidend für die Beobachtung zellulärer Dynamiken.
- Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine detaillierte Visualisierung von Wachstumsprozessen.
- Calcofluor-Farbstoff wird verwendet, um Zellwände anzufärben, ohne dass eine Transformation mit fluoreszierenden Proteinen erforderlich ist.
- Die Stabilität der Calcofluor-Signale erhöht die Zuverlässigkeit der Bildgebung über die Zeit.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beobachtung der Zellwanddynamik in Moos.
- Untersuchung der Unterschiede im Zellwandverhalten zwischen ggb-Mutanten und wildtypischem Moos.
- Bereitstellung einer Methode, die auf andere Pflanzensysteme mit Zellwänden anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- 3D-Zeitrafferaufnahmen mit Fluoreszenzmikroskopie.
- Verwendung von Calcofluor-Farbstoff zur Markierung der Zellwanddynamik.
- Stabile Calcofluor-Signale, die während des gesamten Bildgebungsprozesses aufrechterhalten werden.
- Anwendung des Protokolls auf verschiedene Pflanzensysteme.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung der Zellwandablösung bei ggb-Mutanten.
- Beobachtung von Verdickungsmustern bei wildtypischem Moos.
- Demonstration der Anwendbarkeit des Protokolls auf andere Pflanzenstrukturen.
- Stabile Calcofluor-Signale für längere Bildgebungszeiträume bestätigt.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung der Zellwanddynamik.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können das Verständnis der Pflanzenentwicklung verbessern.
- Diese Methode kann für verschiedene Pflanzenarten angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
