Name: Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Erfahren Sie das modulare Tol2-Transgenesesystem für die Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch-Embryonen. Diese Gateway-basierte Methode ermöglicht Forschern die effiziente Erzeugung transgener Danio rerio für FASD-Studien.

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Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 an C.B.L. unterstützt.

Alle Zebrafischembryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden gemäß den etablierten IACUC-Protokollen aufgezogen und gezüchtet12. Diese Protokolle wurden von der University of Louisville genehmigt.
HINWEIS: In dieser Studie wurden der Wildtyp-Zebrafischstamm AB und die Doppelmutantenlinie bmp4 st72;smad5b1100 verwendet. Das gesamte Wasser, das bei diesem Verfahren verwendet wurde, war steriles Umkehrosmosewasser. Konfokale Bilder wurden unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Die Endodermmessungen wurden mit dem Messwerkzeug in ImageJ durchgeführt. Alle statistischen Auswertungen wurden mit Hilfe einer Statistiksoftware durchgeführt.
1. Erstellen der Lösungen und Medien
<ol><li>Bakterielle Medien: LB-Brühe oder Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers auflösen und autoklavieren. Bevor Sie das Medium in 100-mm-Petrischalen füllen, fügen Sie entweder Ampicillin (50 μg/ml), Kanamycin (50 μg/ml) oder eine Ampicillin/Chloramphenicol-Kombination (50 μg/ml bzw. 30 μg/ml) hinzu.</li>
	<li>Um 20x Embryonenmedium herzustellen, lösen Sie Folgendes in 1 l Wasser auf: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl 2, 0,41 g K 2 HPO 4, 0,142 g Na2 HPO 4 und 4,9 g MgSO4·7H2 O. Filter-sterilisieren Sie die Stammlösung mit einem 0,22-μm-Vakuumfiltrationssystem, und bei 4 °C lagern. Anmerkungen: Ignorieren Sie den weißen Niederschlag, der sich bildet; Dies hat keine Auswirkungen auf die Medien.</li>
	<li>In 19 l Wasser 1,2 g NaHCO3 auflösen und 1 l des 20-fachen Embryo-Media-Vorrats hinzufügen, um die funktionierende Embryo-Media-Lösung zu erzeugen, und diese Lösung bei 28 °C halten.</li>
	<li>Für eine 2%ige phenolrote Lösung werden 20 mg phenolrotes Natriumsalz in 1 ml RNase-freiem Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur gelagert.</li>
</ol>2. Embryonen-Injektionsformen
<ol><li>Um die Agarose-Injektionsplatte herzustellen, lösen Sie die Agarose in den Embryomedien bis zu einer Endkonzentration von 3 % auf, indem Sie sie zum Kochen bringen.</li>
	<li>Gießen Sie 50 ml Agarose in 100-mm-Petrischalen und setzen Sie, solange die Agarose noch flüssig ist, die Spritzgussform vorsichtig in die Agarose ein, um eine Blasenbildung unter der Form zu verhindern.</li>
	<li>Die Agaroseplatten abkühlen lassen. Sobald die Agarose fest ist, entfernen Sie die Spritzgussform und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.</li>
</ol>3. Injektionspipetten
<ol><li>Ziehen Sie 1,0 mm (OD) Kapillaren, die ein Filament enthalten, mit einem vertikalen Pipettenzieher in Nadeln, wobei der Magnet auf 2,5 und das Heizelement auf 14,6 eingestellt ist. Anmerkungen: Jeder beheizte Abzieher funktioniert, wenn er die Kapillaren sauber und gleichmäßig in zwei Nadeln zieht, aber die Injektionsnadeln müssen innerhalb von 1 Woche nach der Injektion der Zebrafischembryonen gezogen werden, um konsistente Injektionsergebnisse zu erzielen.<ol><li>Setzen Sie die Kapillare in den Abzieher ein, ziehen Sie die Klemme an jedem Ende fest und aktivieren Sie dann das Heizelement.</li>
		<li>Ziehen Sie an den Kapillaren, um zwei Injektionsnadeln zu erzeugen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kapillaren aus dem Abzieher und bewahren Sie sie in einer leeren Petrischale mit einem Streifen Modelliermasse auf, der als Nadelhalter dient.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Herstellung der Transposase-mRNA
<ol><li>Die Tol2Kit-Plasmid-haltige Transposase wird mit einer NotI-Restriktionsendonuklease linearisiert, indem Folgendes in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen kombiniert wird: 10 μl Transposase-Plasmid (150 ng/μl), 1,5 μl Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer, 0,3 μl NotI-Endonuklease.</li>
	<li>Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und verdauen Sie sie dann über Nacht bei 37 °C.</li>
	<li>Stoppen Sie den Transposase-Aufschluss, indem Sie der Aufschlussreaktion 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μl 5 MNH4OAc und 80 μl 100 % EtOH hinzufügen und dann mischen und über Nacht bei −20 °C kühlen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000x g für 20 min bei 4 °C, saugen Sie dann den Überstand ab und resuspendieren Sie das DNA-Pellet in RNase-freiem Wasser.</li>
	<li>Bestimmen Sie die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, indem Sie zuerst 2 μl eines RNase-freien Wasserblindlings und dann 2 μl des linearisierten Plasmids laufen lassen. HINWEIS: Die Plasmidkonzentrationen liegen typischerweise zwischen 100-200 ng/μl</li>
	<li>Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie die folgenden Komponenten in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen der Reihe nach kombinieren: 10 μl 2x NTP/CAP, 2 μl 10x Reaktionspuffer, 0,1-1 μg lineare DNA-Vorlage und 2 μl SP6-Enzymmischung.</li>
	<li>Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 μl mit RNase-freiem Wasser, mischen Sie sie und inkubieren Sie sie 2 h lang bei 37 °C.</li>
	<li>Nach 2 h Inkubation 1 μl DNase zugeben, gut mischen und weitere 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Um die SP6-Reaktion zu stoppen, geben Sie 30 μl LiCl-Fällungslösung in das Reaktionsrohr und mischen Sie es dann und kühlen Sie es über Nacht bei −20 °C.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 min bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an und waschen Sie das mRNA-Pellet mit 1 ml 80%igem EtOH (verdünnt mit RNase-freiem Wasser).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Lösung bei 14.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie dann den Überstand an. Lassen Sie das Pellet an der Luft trocknen.</li>
	<li>Das mRNA-Pellet wird in 20 μl RNase-freiem Wasser resuspendiert, die mRNA-Konzentration in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer wie in Schritt 4.5 beschrieben bestimmt (sollte mindestens 100 ng/μl betragen), 100 ng mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch aliquotieren und bei −80 °C lagern. HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die mRNA nicht abgebaut wird, können 2 μl mRNA schnell auf ein DNA-Elektrophorese-Gel aufgetragen werden, um eine einzelne Bande mit 1.950 bps zu bestätigen.</li>
</ol>5. Multisite-Gateway-Klonierung zur Erstellung von Eingangsvektoren für die Transgenese
HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Kwan et al.10 modifiziert, wobei die LR-Reaktion als Halb-LR-Reaktion und mit einem Gesamtvolumen von 5 μL geschrieben wurde. Um neue Eintrittselemente zu generieren, müssen BP-Reaktionen mit 5'-, Mittel- und 3'-Donorvektoren verwendet werden10,13.
<ol><li>Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 fmol von p5E, pME und p3E und 20 fmol des Zielvektors (pDest). HINWEIS: Bei der Multisite-LR-Rekombination werden vier verschiedene Plasmidvektoren verwendet: ein 5'-Eintrittsvektor (p5E), ein mittlerer Eintrittsvektor (pME), ein 3'-Eintrittsvektor (p3E) und ein Zielvektor (pDest), um ein einzigartiges transgenes Konstrukt zu erzeugen, das von Tol2-Wiederholungen flankiert wird, die in Zebrafischembryonen injiziert werden können.<ol><li>Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren in Basenpaaren aus der Plasmidquelle (Tabelle 1, Tol2Kit Wiki Seite14 oder Addgene11; siehe Materialtabelle). HINWEIS: Bei neuartigen Vektoren kann die vollständige Plasmidsequenzierung über kommerzielle Sequenzierungsunternehmen die genaue Plasmidgröße in bps liefern.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration aller vier Vektoren in Nanogramm pro Mikroliter (ng/μl) mit einem Fluorometer, wie in Schritt 4.5 beschrieben.</li>
		<li>Berechnen Sie unter Verwendung des DNA-Gewichts von 660 g/mol und der Plasmidgröße (in bps) die gesamten Nanogramm (ng) des Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> HINWEIS: Das Mosimann-Labor an der University of Colorado, Anschutz Medical Campus, hat eine frei verfügbare Tabelle erstellt, um die Menge des benötigten Plasmids (in ng) und das Volumen (in μL) der für die LR-Reaktion benötigten Vektoren zu berechnen15.</li>
	</ol></li>
	<li>Um das unten beschriebene Konstrukt sox17:EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie die folgenden Vektoren: einen p5E-Vektor, der den Zebrafisch-Sox17-Promotor enthält, der 6.918 bp in Größe16 hat; ein pME-Vektor, der das pränylierte EGFP enthält, das 3.345 bp in Größe10 hat; ein p3E-Vektor, der die späte Poly-A-Signalsequenz SV40 enthält, die 2.838 bp in Größe10 beträgt; und der pDest, der 5.883 bp in Größe10 beträgt.</li>
	<li>Berechnen Sie unter Verwendung der in Schritt 5.1.2 ermittelten Plasmidkonzentration und der Menge in Nanogramm (ng) für jeden Vektor (Schritt 5.1.3) die gesamten Mikroliter (μL) jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 fmol (Eintrittsvektoren) oder 20 fmol (Zielvektor) zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei, um sie in den 5-μL-Halb-LR-Reaktionen zu verwenden (alle unten aufgeführten Werte sind in Tabelle 2 aufgeführt). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>Um 10 fmol p5E-sox17 zu erzeugen, verwenden Sie 45,66 ng (in einer Konzentration von 140,3 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 4, um 0,65 μl zu erhalten.</li>
		<li>Um 10 fmol pME-EGFPCAAX zu erzeugen, verwenden Sie 22,08 ng (in einer Konzentration von 213,5 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 10, um 0,52 μl zu erhalten.</li>
		<li>Um 10 fmol p3E-Poly A zu erzeugen, verwenden Sie 15,73 ng (bei einer Konzentration von 276,1 ng/μl) und verdünnen Sie es mit sterilem Wasser um den Faktor 20, um 0,57 μl zu erhalten.</li>
		<li>Für 20 fmol des Zielvektors werden 77,66 ng pDest (in einer Konzentration von 307,3 ng/μl) verwendet und mit sterilem Wasser um den Faktor 5 verdünnt, um 1,63 μl zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Um eine 5-μl-Halb-LR-Reaktion einzurichten, kombinieren Sie die in Schritt 5.3 bestimmten Volumina von p5E, pME, p3E und pDest in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 4 μl zu erreichen.</li>
	<li>Die LR-Enzymmischung 2x für jeweils 1 Minute kräftig vortexieren, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten, und dann 1 μl zur Reaktion hinzufügen und gründlich mischen.</li>
	<li>Inkubieren bei 25 °C über Nacht (16+ h).</li>
	<li>Stoppen Sie die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 μl Proteinase K (2 μg/μl), inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 37 °C und kühlen Sie sie dann auf Raumtemperatur ab.</li>
	<li>Wandeln Sie 3-4 μl Plasmid in aufgetaute, chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25-30 Minuten auf Eis ruhen lassen.</li>
	<li>Während die Zellen auf Eis liegen, erwärmen Sie zwei LB-Ampicillin-Agarplatten auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Hitzeschock der Zellen in einem 42°C warmen Wasserbad für genau 30 s.</li>
	<li>Nach dem Hitzeschock 250 μl antibiotikafreies, reichhaltiges flüssiges Medium in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 °C 1,5 h inkubieren.</li>
	<li>Verteilen Sie 300 μl Bakterien auf einer Ampicillinplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.</li>
	<li>Am nächsten Morgen untersuchen Sie die Kolonien auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen, klar und undurchsichtig, wählen Sie die klaren Kolonien (wie in Kwan et al.10 beschrieben) nacheinander aus, impfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie dann über Nacht bei 37 °C. HINWEIS: Klare Kolonien enthalten fast immer die richtige LR-Kolonie (&gt;85% der Fälle).</li>
	<li>Führen Sie mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers eine Plasmidvorbereitung für jede Flüssigkultur durch und diagnostisch verdauen Sie jedes Plasmid, um die geeignete Größe des transgenen Konstrukts zu bestätigen, was darauf hinweist, dass die LR-Gateway-Reaktion ordnungsgemäß funktioniert hat.</li>
	<li>Die korrekten transgenen Konstrukte werden unter Verwendung des in den Schritten 5.4-5.12 beschriebenen bakteriellen Standardtransformationsprotokolls unter Verwendung von 0,5-1 μl des Plasmids erneut transformiert und nur bei 37 °C für 1 h inkubiert.</li>
	<li>Streifen Sie die Kolonien erneut und vergewissern Sie sich, dass jede das transgene LR-Konstrukt wie in Schritt 5.14 aufweist.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Plasmidkonzentration wie in Schritt 4.5 beschrieben (für die Embryoinjektion werden mindestens 150 ng/μl benötigt).</li>
</ol>6. Injektion des Transgens in die Embryonen
<ol><li>Tauen Sie eine Einweg-Transposase-mRNA-Probe und ein transgenes Tol2-Konstrukt auf Eis auf und warnen Sie eine Agarose-Injektionsplatte vor Raumtemperatur.</li>
	<li>Kombinieren Sie auf Eis: 150 ng Plasmid, 100 ng Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot (0,3 μl). Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf 3 μl zu erhöhen.</li>
	<li>Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte (siehe Schritt 2), die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50-75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte.</li>
	<li>Geben Sie das mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch in das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel, setzen Sie die Kapillarnadel in den Anker der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsbohrmaschine ein. HINWEIS:Die Injektionsanlage verwendet komprimiertes Gas, z. B. Luft, um das gewünschte Volumen (wie in Schritt 6.5 beschrieben) des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Embryo zu pulsieren, wenn es aktiviert wird.</li>
	<li>Senken Sie die Kapillarnadel in die EM der Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann.</li>
	<li>Injizieren Sie den Embryonen einen kleinen 3-nL-Bolus des mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisches in den Zellkörper des Embryos. HINWEIS: Ein Bolus von 3 nL ist ein Volumen aus mRNA/Plasmid/Phenolrot-Gemisch, bei dem theoretisch sieben Boli gleichmäßig über die Mittellinie des Embryos passen.</li>
	<li>Wenn Sie mit der Injektion fertig sind, nehmen Sie sie von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und in eine 100-mm-Petrischale mit frischem EM (ca. 40 ml) pipettieren und dann bei 28,5 °C inkubieren, damit sich die Embryonen entwickeln können.</li>
</ol>7. Screening von Embryonen auf transgene Insertion
<ol><li>Für die Expression fluoreszierender Proteine wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium aus, in dem das fluoreszierende Transgen exprimiert werden soll, und untersuchen Sie das Vorhandensein von Fluoreszenz unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop. HINWEIS: Diese Embryonen werden in ihrer Expression mosaikartig sein und eine genomische Insertion des transgenen Konstrukts zeigen.</li>
	<li>Screening nach nicht-fluoreszierenden Transgenen durch Screening nach einem fluoreszierenden transgenen Marker (wie in Schritt 7.1 beschrieben), wie z.B. GFP, das durch den kardialen spezifischen Promotor für das Gen cmlc2 oder mCherry, der durch den linsenspezifischen Promotor von αcyrstallin gesteuert wird, die in unterschiedlichen Zielvektoren enthalten sind.</li>
	<li>Lassen Sie die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, sich vollständig zu den adulten Zebrafischstadien entwickeln.</li>
	<li>Sobald potenzielle transgene Fische das Brutalter erreicht haben, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden.</li>
	<li>Diejenigen erwachsenen Tiere, deren Embryonen sich normal entwickeln und die stärkste und am besten geeignete Transgenexpression liefern, werden als einzigartige transgene Zebrafischlinien für zukünftige Arbeiten und Analysen aufbewahrt. HINWEIS: Als alternativen Ansatz für das Screening auf die genomische Insertion transgener Konstrukte sollten PCR-Primer entwickelt werden, die nur das transgene Konstrukt und keine Wildtyp-DNA amplifizieren.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Zebrafische eignen sich hervorragend, um die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf Entwicklungs- und Krankheitszustände zu untersuchen 7,8. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von durchscheinenden, extern befruchteten, genetisch beherrschbaren Embryonen, was die Live-Bildgebung mehrerer transgenmarkierter Gewebe und Zelltypen gleichzeitig in mehreren Umweltkontexten ermöglicht19,20. Diese Stärken...

Die pränatale Ethanolexposition führt zu einem Kontinuum struktureller Defizite und kognitiver Beeinträchtigungen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bezeichnet werden1,2,3,4. Die komplexen Beziehungen zwischen mehreren Faktoren machen es schwierig, die Ätiologie von FASD beim Menschen zu untersuchen und zu verstehen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine Vielzahl von Tiermodellen verwendet. Die biologischen und experimentellen Werkzeuge, die in diesen Modellen zur Verfügung stehen, haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlagen der Ethanol-Teratogenität erwiesen, und die Ergebnisse dieser Modellsysteme stimmen bemerkenswert mit dem überein, was in humanen Ethanolstudien gefunden wurde 5,6. Unter diesen haben sich Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung der Ethanol-Teratogeneseentwickelt 7,8, was zum Teil auf ihre externe Befruchtung, ihre hohe Fruchtbarkeit, ihre genetische Lenkbarkeit und ihre durchscheinenden Embryonen zurückzuführen ist. Diese Stärken zusammen machen Zebrafische ideal für Echtzeit-Live-Bildgebungsstudien von FASD mit transgenen Zebrafischlinien.
Transgene Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um verschiedene Aspekte der Embryonalentwicklung zu untersuchen9. Die Herstellung transgener Konstrukte und nachfolgender transgener Linien kann jedoch äußerst schwierig sein. Ein Standard-Transgen benötigt ein aktives Promotorelement, um das Transgen anzutreiben, und ein Poly-A-Signal oder einen "Schwanz", alles in einem stabilen bakteriellen Vektor für die allgemeine Vektorerhaltung. Die traditionelle Erzeugung eines transgenen Mehrkomponentenkonstrukts erfordert mehrere zeitaufwändige Unterklonierungsschritte10. PCR-basierte Ansätze, wie z. B. die Gibson-Assemblierung, können einige der Probleme umgehen, die mit dem Subklonen verbunden sind. Für die Erzeugung jedes einzigartigen transgenen Konstrukts müssen jedoch einzigartige Primer entworfen und getestet werden10. Neben der Konstruktion von Transgenen waren auch die genomische Integration, die Übertragung der Keimbahn und das Screening auf eine ordnungsgemäße Transgenintegration schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Transposon-basierten Tol2-Transgenesesystems (Tol2Kit)10,11. Dieses modulare System nutzt das Klonen von Gateways an mehreren Standorten, um schnell mehrere transgene Konstrukte aus einer ständig wachsenden Bibliothek von "Eingangs"- und "Ziel"-Vektoren zu generieren. Integrierte Tol2-transponierbare Elemente erhöhen die Transgeneserate erheblich und ermöglichen die schnelle Konstruktion und genomische Integration mehrerer Transgene. Mit Hilfe dieses Systems zeigen wir, wie die Generierung einer endodermen transgenen Zebrafischlinie genutzt werden kann, um die gewebespezifischen strukturellen Defekte zu untersuchen, die FASD zugrunde liegen. Letztendlich zeigen wir in diesem Protokoll, dass der modulare Aufbau und die Konstruktion transgener Konstrukte die FASD-Forschung auf Zebrafischbasis sehr unterstützen werden.

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2 Toolbox</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Luft</td><td></td><td></td><td>Direkt von der Universität zur Verfügung gestellt</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Kapillare</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laserscanning-Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Donor Plasmid Prep</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB</td><td>Agar Fisher</td><td>Scientific BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Low-EEO/Mehrzweck/Molekularbiologie Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzym</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (Heptahydrat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Pipettenhalter</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 0,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenspitzen 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkriptionskit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Berechnungsarbeitsblatt</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spektralphotometer</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotes Natriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Mikropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat (zweibasisch)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Druckinjektor</td><td>Angewandte wissenschaftliche Instrumentierung</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat (zweibasisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 &micro; m Vakuum-Filtersystem&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki-Seite</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top 10 der chemisch kompetenten E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Vertikaler Pipettierer Abzieher</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafisch-Mikrospritzgussform</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

das zebrafish tol2-system: ein modularer und flexibler gateway-basierter transgenese-ansatz

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine sehr variable Reihe von strukturellen Defekten und kognitiven Beeinträchtigungen gekennzeichnet, die aufgrund einer pränatalen Ethanolexposition auftreten. Aufgrund der komplexen Pathologie von FASD haben sich Tiermodelle als entscheidend für unser aktuelles Verständnis von Ethanol-induzierten Entwicklungsdefekten erwiesen. Zebrafische haben sich aufgrund des hohen Erhaltungsgrades sowohl der Genetik als auch der Entwicklung zwischen Zebrafisch und Mensch als leistungsfähiges Modell zur Untersuchung ethanolinduzierter Entwicklungsdefekte erwiesen. Als Modellsystem besitzen Zebrafische viele Eigenschaften, die sie ideal für Entwicklungsstudien machen, darunter eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, die genetisch beherrschbar und durchscheinend sind. Dies ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und die Dosierung der Ethanolexposition in mehreren genetischen Kontexten genau zu steuern. Ein wichtiges genetisches Werkzeug, das im Zebrafisch zur Verfügung steht, ist die Transgenese. Die Generierung transgener Konstrukte und die Etablierung transgener Linien kann jedoch komplex und schwierig sein. Um dieses Problem zu lösen, haben Zebrafischforscher das Transposon-basierte Tol2-Transgenesesystem etabliert. Dieses modulare System verwendet einen Multisite-Gateway-Klonierungsansatz für den schnellen Zusammenbau kompletter Tol2-Transposon-basierter transgener Konstrukte. Hier beschreiben wir die flexible Tol2-System-Toolbox und ein Protokoll zur Generierung transgener Konstrukte, die für die Zebrafisch-Transgenese und deren Verwendung in Ethanolstudien bereit sind.

Um die transgenen Konstrukte zu generieren, verwendeten wir das Tol2-Transgenese-System. Drei Eintrittsvektoren, darunter p5E, das die Genpromotor/Enhancer-Elemente enthält, pME, das das Gen enthält, das von den Promotor/Enhancer-Elementen exprimiert werden soll, und p3E, das mindestens den polyA-Schwanz enthält, wurden verwendet, um das transgene Konstrukt über Multisite-Gateway-LR-Klonierung zu generieren. Der Zielvektor pDest liefert die Tol2-Wiederholungen für die genomische Insertion des transgenen Konstruk...

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgene Zebrafische haben sich als entscheidend für unser Verständnis der Embryonalentwicklung erwiesen. Das Tol2-System ist ein vielseitiges Werkzeug, das es Forschern ermöglicht, schnell und systematisch mehrere transgene Zebrafische für FASD-Studien zu generieren. Der modulare Aufbau und die einfache Generierung neuer Kit-Komponenten machen das Tol2-System zu einem vielseitigen Werkzeug für die Generierung neuer Transgenetik, ohne dass Komponenten des Kits neu entworfen werden müssen.Mein Rat an Forscher, die diese Technik zum ersten Mal anwenden, ist, mehrere Testläufe durchzuführen, um die Präzision der Erzeugung und Injektion transgener Konstrukte zu trainieren. Linearisieren Sie zunächst das Tol2-Kit-Plasmid, das Transposase enthält, mit einer Endonuklease mit einer Restriktionsendonuklease von null, indem 10 Mikroliter Transposase-Plasmid, 1,5 Mikroliter Restriktionsendonuklease-Reaktionspuffer und 0,3 Mikroliter Null-Eins-Endonuklease in einem 500-Mikrozentrifugen-Röhrchen kombiniert werden. Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser.Mischen und bei 37 Grad Celsius über Nacht verdauen. Stoppen Sie am nächsten Tag den Aufschluss, indem Sie dem Reaktionsgemisch einen Mikroliter 0,5 molaren EDTA, zwei Mikroliter fünfmolaren Ammoniumacetat und 80 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzufügen. Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen.Zentrifugieren und aspirieren Sie den Überstand am nächsten Tag, bevor Sie das DNA-Pellet in RNAse-freiem Wasser resuspendieren. Bestimmen Sie dann die lineare Plasmidkonzentration in Nanogramm pro Mikroliter auf einem Fluorometer, indem Sie zwei Mikroliter der Probe laufen lassen. Richten Sie die SP6-mRNA-Produktion ein, indem Sie 10 Mikroliter 2X NTP/CAP, zwei Mikroliter 10X-Reaktionspuffer, 0,1 bis ein Mikrogramm lineare DNA-Matrize in zwei Mikrolitern SP6-Enzymmischung in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren.Füllen Sie die Reaktion bis zu 20 Mikroliter mit RNAse-freiem Wasser und mischen Sie sie vor der Inkubation bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden einen Mikroliter DNAse hinzufügen, gut mischen und weitere 15 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 30 Mikroliter Lithiumchlorid-Fällungslösung hinzufügen.Mixen und über Nacht bei minus 20 Grad Celsius kalt stellen. Zentrifugieren Sie am nächsten Tag die Lösung, um die mRNA zu pelletieren, und saugen Sie den Überstand an, bevor Sie das Pellet mit einem Milliliter 80%igem Ethanol waschen. Trocknen Sie das Pellet an der Luft und resuspendieren Sie es in 20 Mikrolitern RNAse-freiem Wasser.Bestimmen Sie die mRNA-Konzentration mit einem Fluorometer, aliquotieren Sie dann 100 Nanogramm mRNA pro Röhrchen für den einmaligen Gebrauch und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Um die Reaktion durchzuführen, sammeln Sie jeweils 10 Femtomole von P5E, PME und P3E und 20 Femtomol des Zielvektors PDEST. Bestimmen Sie die Größe aller vier Vektoren und Basenpaare aus der Plasmidquelle.Nachdem Sie die Konzentration aller vier Vektoren unter Verwendung des Gewichts der DNA von 660 Gramm pro Mol und der Plasmidgröße und der Basenpaare bestimmt haben, berechnen Sie die gesamten Nanogramm Plasmid, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol für Eintrittsvektoren oder 20 Femtomol für Zielvektoren zu erreichen. Als nächstes generieren Sie das Konstrukt sox17:EGFP-CAAX unter Verwendung der im Manuskript beschriebenen Komponenten. Berechnen Sie anhand der Plasmidkonzentration die gesamten Mikroliter jedes Plasmids, die benötigt werden, um entweder 10 Femtomol oder 20 Femtomol zu erreichen, und teilen Sie diese dann durch zwei für die Verwendung in den Fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktionen.Erzeugen Sie 10 Femtomol P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) und 20 Femtomol Zielvektor. Richten Sie eine fünf-Mikroliter-Halb-LR-Reaktion ein, indem Sie die Volumina von P5E, PME, P3E und PDEST in einem 500-Mikroliter-Röhrchen kombinieren. Fügen Sie dann steriles Wasser hinzu, um das Volumen auf vier Mikroliter zu erhöhen.Wirbeln Sie die LR-Enzymmischung zweimal für jeweils eine Minute vortex, bevor Sie der Reaktion einen Mikroliter hinzufügen, und mischen Sie sie gründlich, bevor Sie bei 25 Grad Celsius inkubieren. Stoppen Sie am nächsten Tag die LR-Reaktion durch Zugabe von 0,5 Mikrolitern Proteinase K.10 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen. Als nächstes wandeln Sie drei bis vier Mikroliter des Plasmids in aufgetaute chemisch kompetente Zellen um, indem Sie das Plasmid hinzufügen und die Zellen 25 bis 30 Minuten auf Eis ruhen lassen.Anschließend werden die Zellen in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad für 30 Sekunden erhitzt. Nach dem Hitzeschock 250 Mikroliter antibiotikafreie, reichhaltige flüssige Medien in die Zellen geben und unter Schütteln bei 37 Grad Celsius 1,5 Stunden inkubieren. Verteilen Sie 300 Mikroliter Bakteriensuspension auf einer Ampicillin-Luria-Bertani-Platte und inkubieren Sie sie über Nacht.Untersuchen Sie die Kolonien am nächsten Tag auf das Vorhandensein von zwei Phänotypen: klar und undurchsichtig. Pflücken Sie die klaren Kolonien nacheinander, beimpfen Sie die Flüssigkultur und schütteln Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Kombinieren Sie 150 Nanogramm Plasmid, 100 Nanogramm Transposase-mRNA und 2 % Phenolrot auf Eis.Fügen Sie dann RNA-freies Wasser hinzu, um das Volumen auf drei Mikroliter zu erhöhen. Übertragen Sie einen Embryo im Zellstadium mit Transferpipetten auf die mit EM gefüllte Injektionsplatte, die den Agar vollständig bedeckt, und drücken Sie dann vorsichtig etwa 50 bis 75 Embryonen pro Schlitz der Injektionsplatte. Geben Sie die mRNA-Plasmid-Phenolrot-Mischung auf das offene Ende einer Kapillarinjektionsnadel.Setzen Sie die Kapillarnadel in die Armatur der Injektionsanlage ein und schalten Sie die Injektionsanlage ein. Senken Sie die Nadel in die Injektionsplatte und brechen Sie die Spitze mit einer Pinzette, damit nur eine kleine Menge des Gemisches von der Injektionsanlage abgepumpt werden kann. Injizieren Sie den Embryonen einen drei Nanoliter großen Bolus der mRNA-Plasmid-Phenol-Rot-Mischung in den Zellkörper des Embryos.Wenn Sie fertig sind, nehmen Sie die Embryonen von der Injektionsplatte, indem Sie sie vorsichtig aus dem Schlitz nehmen und pipettieren Sie sie in eine 100-Millimeter-Petrischale mit frischem EM. Inkubieren bei 28,5 Grad Celsius. Wählen Sie das geeignete Entwicklungsstadium für die Fluoreszenztransgenexpression aus und screenen Sie es unter einem Fluoreszenzpräparationsmikroskop. Screening auf nicht-fluoreszierende Transgene durch Screening auf fluoreszierende transgene Marker wie GFP, die durch den kardialen Promotor für das Gen Cmlc2 gesteuert werden.Wenn sich die Embryonen, die für die transgene Insertion positiv sind, zu erwachsenen Embryonen entwickeln und das Zuchtalter erreichen, werden sie einzeln auf Keimbahnübertragung und Transgenexpressivität untersucht, indem sie mit Wildtyp-Zebrafischen verpaart werden. Beispielhaft werden Bakterienkolonien gezeigt, die aus der Transformation der LR-Rekombination gewonnen wurden. Klare Kolonien enthielten in mehr als 85 % der Fälle ein korrektes LR-Rekombinationsprodukt, während undurchsichtige Kolonien nie ein korrektes Rekombinationsprodukt enthielten.Die diagnostische Verdauung der drei Kolonien aus der Transformation der LR-Rekombinationsprodukte zeigte, dass die einzelne opake Kolonie kein Plasmid enthielt, während die beiden klaren Kolonien eine einzelne Bande bei 9,544 Basenpaaren enthielten. Die Transposase-mRNA bei 1,950 Basenpaaren ist hier dargestellt. Die Expression des Mosaik-Endoderms EGFP-CAAX wurde bei 75% der injizierten Embryonen beobachtet.Die transgene Markerexpression von Cmlc2 EGFP im sich entwickelnden Herzen wurde 24 Stunden nach der Befruchtung beobachtet. Adulte Zebrafische wiesen eine Keimbahnübertragung von sox17:EGFP-CAAX erzeugten fluoreszierenden Embryonen auf, wobei das Endoderm vollständig mit EGFP-CAAX markiert war. Sowohl die anterior-posteriore Länge des Endoderms als auch die dorsal-ventrale Länge jedes Beutels aus den Beuteln eins bis fünf wurden in Kontroll- und Ethanol-behandelten Wildtyp-BMP-mutierten Embryonen gemessen.Die Gesamtlänge des Endoderms wurde weder durch den Genotyp noch durch die Behandlung beeinflusst. Die Beutel eins und drei zeigten jedoch eine signifikante Zunahme der Beutellänge zwischen unbehandelten und mit Ethanol behandelten Wildtyp-Embryonen, aber eine signifikante Abnahme der Länge zwischen unbehandelten und ethanolbehandelten BMP-Mutanten. Beutel zwei zeigte signifikante Anstiege der Beutelgröße zwischen der unbehandelten und der ethanolbehandelten Wildtyp- bzw. BMP-Mutantengruppe.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, beim Pipettieren und Verdünnen des Tol2-Systems sowie beim Berühren des Zellkörpers während der Embryoinjektion präzise vorzugehen.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Erzeugung einer stabilen transgenen Zebrafischlinie, die konstitutiv ein Fluoreszenzspannungsindikatorprotein exprimiert, nach der Co-Injektion des Tol2-Transposon-Systems, bestehend aus der Transposase-mRNA und dem Tol2-Transposon-Konstrukt, das den Fluoreszenzspannungsindikator kodiert.

Tol2-Transposon-vermittelte Zebrafisch-Transgenese: Ein Verfahren zur Erzeugung transgener Zebrafische nach Co-Injektion des Tol2-Systems in befruchtete Zebrafischembryonen

Dieses Protokoll beschreibt die Methode des Gene-Trap-Insertionsmutagenese mit Gal4-VP16 als primäre Reporter und GFP / RFP als Sekundär Reportern im Zebrafisch. Etwa einer von zehn hoch-exprimierenden F0 Fischertrag Genfallen Nachkommen Co-GFP und RFP. Das Screening-Verfahren kann leicht skaliert werden, um auf die Größe des Labors Durchführung der Insertionsmutagenese Bildschirm anzupassen.

Gene Trapping Mit Gal4 in Zebrafisch

Eine Zebrafischanlage, die für die Zucht und In-vivo-Forschung geeignet ist, wird auf einfache und erschwingliche Weise gebaut. Der Wartungsaufwand ist minimal. Diese Einrichtung ist ideal für studentisches Engagement und unabhängige Forschung.

Bau eines erschwinglichen und einfach zu bauen Zebrafisch Einrichtung

Das Ziel dieser Studie ist es zu zeigen, wie die Mosaik-Transgenese-Strategie im Zebrafisch verwendet werden kann, um die relativen Beiträge mehrerer Onkogene zur Tumorinitiierung und -progression in vivo schnell und effizient zu bewerten.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Hier skizzieren wir den Arbeitsablauf für die Verwendung des TetON-Systems, um eine gewebespezifische Genexpression in der adulten regenerierenden Zebrafisch-Schwanzflosse zu erreichen.

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

Die Abbildung des dynamischen Verhaltens von Organellen und anderen subzellulären Strukturen in vivo kann Aufschluss über ihre Funktion unter physiologischen und Krankheitsbedingungen geben. Hier stellen wir Methoden vor, mit denen zwei Organellen, Zentrosomen und Mitochondrien, genetisch markiert und ihre Dynamik in lebenden Zebrafischembryonen mittels Weitfeld- und Konfokalmikroskopie abgebildet werden können.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Hier zeigen wir den Prozess der Erstellung einer zellulären elektrische Spannung Reporter Zebrafisch Linie um embryonale Entwicklung, Bewegung, zu visualisieren und Fisch Tumorzellen in Vivo.

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier stellen wir ein Protokoll zur Markierung von Proteinen mit einem Fluoreszenzprotein-Tag in Zebrafischlarven vor, ein neu entwickeltes und modifiziertes in vivo-System , das besonders nützlich für die Visualisierung von Proteinen mit geringer Abundanz im Zebrafisch ist.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Erfahren Sie das modulare Tol2-Transgenesesystem für die Entwicklungsbiologie mit Zebrafisch-Embryonen. Diese Gateway-basierte Methode ermöglicht Forschern die effiziente Erzeugung transgener Danio rerio für FASD-Studien.

Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz

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