Name: Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch mittels PCR, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Screening von CRISPR-induzierten Mutationen.

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Wir danken Anna Hindes von der Washington University School of Medicine für ihre anfänglichen Bemühungen, mit der Hot-Shot-Methode genomische DNA von Spermien in guter Qualität zu erhalten. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Arthritis and Muskuloskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health unter Auszeichnung (R01AR072009 an R.S.G.) finanziert.

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur schnellen Charakterisierung von mutmaßlichen Genomänderungen oder gezielten Mutationen mit Hilfe der CRISPR-Cas-Technologie durch gezielte Analyse von F0-männlichen Spermiengenomen. Dieses Protokoll sollte für andere Tiermodelle zugänglich sein, bei denen Spermien ohne Euthanasie leicht für die Probenahme zur Verfügung stehen. Diese Methode erhöht den Durchsatz beim Screening auf gewünschte Bearbeitungen und ist besonders nützlich für die Identifizierung seltener HDR-vermittel...

Das CRISPR-System (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Durchführung von Loci-spezifischer Mutagenese und präziser Genom-Editierung im Danio rerio (Zebrafisch) Modellsystem 1,2,3,4. Das Cas-Ribonukleoprotein (RNP) besteht aus zwei Hauptkomponenten: einer Cas-Endonuklease (üblicherweise Cas9 oder Cas12a) und einer locusspezifischen synthetischen Guide-RNA (sgRNA)5. Zusammen erzeugen die Cas-RNP einen doppelsträngigen Bruch (DSB) im gewünschten Locus, der durch einen von zwei intrinsischen Reparaturmechanismen repariert werden kann. Der Reparaturmechanismus der nicht-homologen Endverknüpfung (NHEJ) ist fehleranfällig und führt häufig zu einer Vielzahl von Insertionen oder Deletionen (Indels) um das DSB herum. Diese Indels können schädlich sein, wenn sie eine Frameshift-Mutation oder einen vorzeitigen Stopp in der resultierenden Proteinsequenz einführen. Alternativ verwendet der Homologie-gerichtete Reparaturmechanismus (HDR) eine Spenderschablone mit Homologieregionen, die die DSB-Stelle umgeben, um den Schaden zu reparieren. Forscher können das HDR-System nutzen, um präzise genomische Bearbeitungen zu generieren. Konkret können sie ein doppelsträngiges DNA-Spenderkonstrukt koinjizieren, das die gewünschten Bearbeitungen sowie Homologieregionen enthält, die die DSB-Stelle im Genom flankieren. Die erhöhten Skaleneffekte für diese kommerziell hergestellten CRISPR-Komponenten haben die Hürden für das Screening mehrerer Loci und für die Einrichtung größerer Anstrengungen zur präzisen Genom-Editierung erheblich verringert. Ein großer Engpass bei der sexuell reproduzierenden Tiervermehrung ist jedoch die Identifizierung und Isolierung keimbahnstabiler mutierter Tiere.
Das Zebrafisch-Modellsystem weist mehrere Schlüsseleigenschaften auf, die seine Verwendung in reversen genetischen Studien verbessern. Sie lassen sich leicht in großer Zahl aufziehen, und die Weibchen weisen das ganze Jahr über eine hohe Fruchtbarkeit auf6. Darüber hinaus sind sie durch ihre äußere Eiablage und Befruchtung für die Mikroinjektion von CRISPR/Cas-Komponenten zugänglich. Das Cas-RNP wird üblicherweise in Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium injiziert, um DSBs/Reparaturen zu erzeugen, die theoretisch von allen Tochterzellen vererbt werden. Diploide Genome benötigen jedoch zwei DSB/Reparaturereignisse, um beide homologen Chromosomen zu mutagenisieren. Obwohl Cas-RNP im Ein-Zell-Stadium injiziert wird, kann es sein, dass die DSB/Reparatur erst zu einem späteren Zeitpunkt in der Entwicklung erfolgt. Zusammen tragen diese Faktoren zur Mosaiknatur von F0-injizierten Fischen bei. Eine gängige Praxis ist es, F0-injizierte Fische zu kreuzen und die F1-Nachkommen auf Indels/spezifische Bearbeitungen zu untersuchen. Da jedoch nicht alle F0-injizierten Fische Keimbahnmutationen aufweisen, führt diese Praxis zu vielen unproduktiven Kreuzungen, die nicht den gewünschten Edit erzeugen. Das Screening der F0-Keimbahn anstelle des F1-Samengewebes erhöht die Wahrscheinlichkeit, die gewünschte Keimbahnreduktion zu isolieren, und reduziert die Anzahl der für diesen Prozess erforderlichen Tiere.
Spermien können leicht aus F0-injizierten Zebrafischen entnommen werden, ohne dass eine Euthanasie erforderlich ist. Diese Funktion ermöglicht die Kryokonservierung und Rederivation von gefrorenen Spermienbeständen7, kann aber auch genutzt werden, um die Keimbahnträger der gewünschten genomischen Mutationen 8,9 schnell zu screenen, zu identifizieren und zu isolieren. Brocal et al. (2016) beschrieben zuvor eine sequenzierungsbasierte Methode zum Screening von Keimbahn-Edits bei F0-injizierten männlichen Zebrafischen10. Obwohl dieser Ansatz für die Identifizierung der in der Keimbahn vorhandenen mutierten Allele nützlich ist, kann er im Hochdurchsatz kostspielig werden und ist möglicherweise nicht für alle Labore zugänglich. Im Gegensatz dazu bietet das aktuelle Protokoll eine zugängliche und kostengünstige elektrophoresebasierte Strategie zur Identifizierung von Keimbahn-Editierungen. Konkret beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum Screening und zur Isolierung von Keimbahnmutationen an bestimmten Loci mittels hochauflösender Agarose-Gelelektrophorese. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll eine ähnliche Strategie zur Identifizierung der erfolgreichen Integration eines Spenderkonstrukts, das spezifische Bearbeitungen enthält. Wie immer, wenn bestimmte Bearbeitungen gewünscht werden, können sequenzierungsbasierte Strategien zusammen mit dem unten beschriebenen Protokoll durchgeführt werden. Obwohl dieses Protokoll spezifisch für das Zebrafisch-Modellsystem ist, sollten diese Prinzipien auf jedes Modell übertragbar sein, in dem die Entnahme von Spermien ein Routineverfahren ist. Zusammen ermöglichen diese Strategien die Identifizierung von F0-injizierten Männchen mit Keimbahn-Indels/Editits, die nach Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und/oder Restriktionsverdauung auf einem Gel aufgelöst werden können.

<table><tbody><tr><td>Agarose-Pulver&nbsp;</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Zuchtbecken</td><td>Carolina Biological&nbsp;</td><td></td><td></td>161937</tr><tr><td>BstNI-Restriktionsenzym</td><td>NEB</td><td>R0168S</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-Endonuklease</td><td>IDT</td><td>1081060 DNA-Leiter</td><td></td></tr><tr><td>, 100 bp&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>FERSM0241</tr><tr><td>dnah10 Spenderkonstrukt&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich DNA-Oligo</td><td>im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken. Phosphorthioatbindung auf dem Donor an den ersten drei Phosphatbrücken sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 forward primer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich DNA-Oligo</td><td>im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3')</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 Reverse Primer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich DNA-Oligo</td><td>im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dnah10 synthetische sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>Synthetische sgRNA, Zielsequenz: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Elektrophorese-Stromversorgung</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>105ECA-115</td><td></td></tr><tr><td>Filterzange</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>Fisch (System) Wasser</td><td>Generisches</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoresesystem (einschließlich Gießrahmen, Kamm und Elektrophoresekammer)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging Leuchtkasten&nbsp;</td><td>Azure Biosystems</td><td>AZI200-01</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Fleck, 10000X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Glasschale, 250 mL&nbsp;</td><td>Generisch</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Isolationsbehälter, 0,8 L&nbsp;</td><td>Aquaneering</td><td>ZT080</td><td></td></tr><tr><td>Microcap Kapillarrohr mit Kolben, 20 & Mikro; L&nbsp;</td><td>Drummond</td><td>1-000-0020/CA</td><td></td></tr><tr><td>Minizentrifuge</td><td>Bio-Rad</td><td>12011919EDU</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten, verschiedene mit entsprechenden Spitzen</td><td>Generisch&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle&nbsp;</td><td>Generisch&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td><td>Promega</td><td>P119-C</td><td></td></tr><tr><td>Papierhandtücher</td><td>Generische</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen, 0,2 mL</td><td>Bioexpress</td><td>T-3196-1</td><td></td></tr><tr><td>Kunststofflöffel, mit gebohrten Löchern/Schlitzen&nbsp;</td><td>Generisches</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl-Lösung, 0,2 M RNAse freies</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 Forward Primer&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich DNA-Oligo</td><td>im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3')</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 Reverse-Primer</td><td>Sigma-Aldrich DNA-Oligo</td><td>im Röhrchen; 0,025 nM, Standard-Entsalzungsreinigung, trocken (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3')&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p2ry12 synthetische sgRNA&nbsp;</td><td>Synthego&nbsp;</td><td>Synthetische sgRNA, Zielsequenz: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriktionsenzym</td><td></td></tr> <tr><td>10X Puffer</td><td>NEB</td><td>B6003SVIAL NaOH-Lösung</td><td></td></tr><tr><td>, 50 mM&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>S318; 424330010</td><td></td></tr><tr><td>Schwamm, 1 Zoll x 1 Zoll geschnitten mit kleiner ovaler Vertiefung</td><td>Generisch&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polymerase Master Mix, 2X</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>TBE Puffer Konzentrat, 10X</td><td>VWR</td><td>E442</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Seidenpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat-Lösung (Syncain, MS-222), 0,016% in Fischwasser (pH 7,0&plusmn; 0.2)&nbsp;</td><td>Syndel</td><td>200-266</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base, 1M (gepuffert mit HCl bis ph 8,0) &nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5131</td><td></td></tr></tbody></table>

screening von spermien zur schnellen isolierung von keimbahnveränderungen im zebrafisch

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

Das Aufkommen zielgerichteter CRISPR-Cas-Nuklease-Technologien hat die Fähigkeit revolutioniert, sowohl in etablierten als auch in neu entstehenden Modellsystemen eine präzise Genom-Editierung durchzuführen. CRISPR-Cas-Genomeditierungssysteme verwenden eine synthetische Guide-RNA (sgRNA), um eine CRISPR-assoziierte (Cas) Endonuklease auf bestimmte genomische DNA-Loci auszurichten, wobei die Cas-Endonuklease einen Doppelstrangbruch erzeugt. Die Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch intrinsische fehleranfällige Mechanismen führt zu Insertionen und/oder Deletionen, die den Locus stören. Alternativ kann der Einschluss von doppelsträngigen DNA-Donoren oder einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden in diesen Prozess die Einbeziehung präziser Genom-Editierungen hervorrufen, die von Einzelnukleotid-Polymorphismen über kleine immunologische Markierungen bis hin zu großen fluoreszierenden Proteinkonstrukten reichen. Ein großer Engpass bei diesem Verfahren kann jedoch darin bestehen, die gewünschte Bearbeitung in der Keimbahn zu finden und zu isolieren. Dieses Protokoll beschreibt eine robuste Methode zum Screening und zur Isolierung von Keimbahnmutationen an bestimmten Loci in Danio rerio (Zebrafisch); Diese Prinzipien können jedoch in jedem Modell adaptiert werden, in dem eine In-vivo-Spermienentnahme möglich ist.

Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Ansätze ermöglichen eine schnellere Identifizierung von Genom-Edits oder vermeintlich schädlichen Allelen, indem sie sich auf die Analyse von Tausenden von Genomen konzentrieren, die aus der Sammlung von F0-injizierten männlichen Spermien stammen. Abbildung 2 zeigt, wie die mit diesem Protokoll erzielten Ergebnisse zu interpretieren sind.
Um Mutationen im p2ry12-Locus zu erzeugen, wurden Zebrafischembryonen im ...

Die CRISPR-Cas-Technologien haben die Genom-Editierung revolutioniert. Das Finden und Isolieren der gewünschten Keimbahnreduktion bleibt jedoch ein großer Engpass. Daher beschreibt dieses Protokoll eine robuste Methode zum schnellen Screening von F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien auf Keimbahn-Editierungen unter Verwendung von Standard-PCR-, Restriktionsverdauungs- und Gelelektrophoresetechniken.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum schnellen Screening von Tausenden von Genomen mit F0 CRISPR-injizierten Zebrafischspermien. Diese Technik ist vorteilhaft in ihrer Zugänglichkeit. Anstelle von teuren, spezialisierten sequenzierungsbasierten Ansätzen verwendet unsere Methode PCR-Restriktionsenzyme und Gelelektrophorese, um männliche F0-Träger auf Indels oder spezifische Genom-Editierungen zu untersuchen.Der schwierigste Teil dieses Verfahrens ist es, die Spermien schnell zu bekommen, aber es wird zu einer guten Technik für die In-vitro-Fertilisation, wenn wir mit vielen dysmorphen Fischen arbeiten, und so ist es eine einfache Möglichkeit für uns, Fische zu kreuzen, die uns Probleme bereiten. Beginnen Sie mit dem Aufstellen von Zuchtbecken sowohl für den Wildtyp als auch für F0-Fische und bebrüten Sie die Becken über Nacht. Nachdem Sie den männlichen Fisch am nächsten Tag betäubt haben, verwenden Sie einen geschlitzten Löffel, um ihn auf einen Stapel sauberer Papiertücher zu übertragen.Rollen Sie den Fisch vorsichtig, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Entfernen Sie jegliches Wasser, indem Sie es mit einem sauberen, gefalteten Taschentuch trocken tupfen. Übertragen Si

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dies ist ein Verfahren zur Erzeugung gynogenetic diploid Zebrafischembryonen (Embryonen, deren einzige genetische Beitrag kommt von der Mutter) durch die Blockierung der zweiten Reifeteilung unmittelbar nach der Befruchtung mit UV-Licht-inaktivierten Sperma. EP Embryonen sind nicht vollständig homozygot durch Rekombination während der ersten meiotischen Teilung, aber sie sind homozygot überhaupt loci, die nicht von ihrem Zentromer wurden durch Rekombination getrennt.

Machen Gynogenetic Diploid Zebrafisch von Anfang Druck

PCR in Kombination mit hochauflösenden Schmelzanalyse (HRMA) als schnelle und effiziente Methode, um Zebrafisch-Genotyp nachgewiesen.

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Der Zebrafisch ist aufgrund seiner genetischen Ähnlichkeit mit höheren Wirbeltieren ein leistungsfähiges Modellsystem für die Entwicklungsbiologie und die Erforschung menschlicher Krankheiten. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung haploider Zebrafischembryonen, die für Forward-Screening-Strategien verwendet werden können, um rezessive Mutationen in Genen zu identifizieren, die für die frühe Embryogenese essentiell sind.

Die Produktion von Haploid Zebrafischembryonen durch<em&gt; In-vitro-</em&gt; Düngung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Ein modifiziertes Protokoll zur Ploidie Manipulation verwendet einen Hitzeschock eine Ein-Zyklus-Stall in cytokinesis im frühen Embryo zu induzieren. Dieses Protokoll wird in dem Zebrafisch gezeigt, sondern kann auf andere Arten anwendbar.

Ploidy Manipulation von Zebrafischembryonen mit Heat Shock 2 Behandlung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.

Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen

Zebrafisch wurden als zuverlässige genetische Modellorganismen in der biomedizinischen Forschung, vor allem mit dem Aufkommen von Gen-Bearbeitung Technologien verwendet. Wenn Larven Phänotypen zu erwarten sind, kann DNA-Extraktion und Genotyp Identifizierung schwierig sein. Hier beschreiben wir eine effiziente Genotypisierung Verfahren für zebrafischlarven durch Rute zuschneiden, so früh wie 72 h nach Befruchtung.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Die Regeneration der Skelettmuskulatur wird durch geweberesidente Muskelstammzellen angetrieben, die bei vielen Muskelerkrankungen wie Muskeldystrophie beeinträchtigt sind, was dazu führt, dass sich die Muskeln nicht regenerieren können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen ermöglicht.

Untersuchung der Muskelregeneration in Zebrafischmodellen von Muskelerkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz, um präzise Knock-in-Bearbeitungen in Zebrafischembryonen mit der CRISPR-Cas9-Technologie zu ermöglichen. Eine Phänotypisierungspipeline wird vorgestellt, um die Anwendbarkeit dieser Techniken zur Modellierung einer Long-QT-Syndrom-assoziierten Genvariante zu demonstrieren.

CRISPR-Cas9-vermittelte präzise Knock-In-Bearbeitungen in Zebrafischherzen

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine effiziente Adeninbasen-Editierung ohne PAM-Beschränkung durchgeführt werden kann, um ein präzises Zebrafisch-Krankheitsmodell mit zSpRY-ABE8e zu konstruieren.

Effizientes PAM-loses Baseneditieren für die Zebrafisch-Modellierung menschlicher genetischer Erkrankungen mit zSpRY-ABE8e

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung einer maternalen Mutante, das eine stabile zpc: cas9-Knock-in-Linie mit der Tol2-vermittelten Verabreichung von sgRNA-Expressionskassetten koppelt.

Erzeugung von maternalen Mutanten mit zpc:cas9 Knock-in-Zebrafisch

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch mittels PCR, Restriktionsverdau und Gelelektrophorese. Diese Technik ermöglicht Forschern die effiziente Screening von CRISPR-induzierten Mutationen.

Screening von Spermien zur schnellen Isolierung von Keimbahnveränderungen im Zebrafisch

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