Name: Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Lernen Sie die enzymatische Zellauflösung zur Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen aus dem Darm von Oreochromis niloticus. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Einzelzell-Sequenzierungsstudien in der Aquakulturforschung.

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Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung durch die Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (Nr. 320QN211) und das Forschungsfondsprogramm des Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (Nr. PBEA2021ZD01).

Alle Tierprotokolle während dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Hainan genehmigt (Protokollnummer: HNUAUCC-2022-00063; Datum der Genehmigung: 03.03.2022). Eine Liste der in diesem Experiment verwendeten Geräte und Verbrauchsmaterialien finden Sie in der Materialtabelle. Eine Zusammenfassung des aktuellen Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Fischzubereitung
<ol><li>Besorge dir 6 Monate alten Nil-Tilapia mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 100 g aus einer zuverlässigen Quelle. Wählen Sie Fische aus, die frei von Krankheitszeichen sind.</li>
	<li>Stoppen Sie die Fütterung der Fische 24 Stunden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. HINWEIS: Fischfasten reduziert das Volumen des Darminhalts und erleichtert die Vorbereitung von Darmsegmenten.</li>
	<li>Spülen Sie den Fisch 15 Minuten lang in gut belüftetem, sterilem Wasser ab, um lose gebundene Bakterien auf der Körperoberfläche abzuwaschen.</li>
	<li>Euthanasieren Sie den Fisch mit 300 mg/l Tricain-Methansulfonat (MS-222) für etwa 10 Minuten, bis alle Bewegungen aufhören.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>Bereiten Sie 0,08 % BSA-Dulbecco-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (BSA-DPBS, für Zellspülung und Resuspension) vor. 0,08 g BSA (0,8 % w/v) in 100 ml 1x DPBS auflösen. Bei 4 °C lagern und bei Gebrauch auf Eis vorkühlen. HINWEIS: Die Zugabe von BSA ist vorteilhaft für die Minimierung der Zellverklumpung. Das BSA-Verhältnis kann je nach Zellverklumpungsbedingungen von 0,04 % auf 1 % erhöht werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das enzymatische Zelldissoziationsreagenz vor.<ol><li>Verdünnen Sie die Kollagenase/Dispase mit 1x PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml (0,1 U/ml Kollagenase und 0,8 U/ml Dispase). Stellen Sie sicher, dass PBS und nicht DPBS verwendet wird. HINWEIS: PBS liefert die Kalziumionen, die für die ordnungsgemäße Funktion des Enzyms benötigt werden. DPBS sollte in diesem Schritt nicht verwendet werden, da es frei von Ca2+/Mg2+ ist. Zusätzlich wird im aktuellen Protokoll Kollagenase Typ I verwendet.</li>
		<li>Filtrieren Sie die Verdünnung durch einen sterilen 0,22 μm Membranfilter.</li>
		<li>Bereiten Sie ein Zelldissoziationsreagenz vor, das zu 95 Vol.-% aus Kollagenase/Dispase-Lösung und zu 5 Vol.-% aus fötalem Kälberserum (FBS) besteht. Anmerkungen: Das Dissoziationsreagenz sollte bei jeder Verwendung frisch zubereitet werden. Die Verwendung von 5% FBS trägt dazu bei, die Lebensfähigkeit der Zellen während der Verdauung aufrechtzuerhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie die Trypanblau-Lösung vor.<ol><li>Nehmen Sie die Trypanblau-Lösung aus dem 4 °C-Kühlschrank und bewahren Sie sie vor der Verwendung einige Minuten bei 15-20 °C auf, um Niederschläge zu vermeiden.</li>
		<li>Filtrieren Sie die Lösung durch eine sterile 0,22 μm Membran.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Vorbereitung der Ausrüstung
<ol><li>Kühlen Sie die Kühlzentrifuge vor Gebrauch auf 4 °C vor.</li>
	<li>Besorgen Sie sich sterile RNase-freie 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen, konische 50-ml-Röhrchen, Glaspipetten und -spitzen mit breitem Durchgang, Membranfilter, Zellsiebe und alle Röhrchen und Spitzen mit geringer Retention.</li>
	<li>Autoklavieren Sie Glaspipetten und Dissektionswerkzeuge, einschließlich Pinzetten, Scheren und Skalpelle, und behandeln Sie sie mit der RNase-Entfernungslösung vor, um die nachteiligen Auswirkungen der RNase auf die Einzelzell-RNA-Seq zu verhindern.</li>
</ol>4. Gewebedissektion und Zelldissoziation
<ol><li>Legen Sie den eingeschläferten Fisch zum Sezieren auf Eis. Sammeln Sie aseptisch 3-4 cm des mittleren Darmabschnitts und entfernen Sie so viel Fett und Mesenterium wie möglich. Entfernen Sie vorsichtig das an der Darmoberfläche anhaftende Fett und die Schicht aus elastischer und formbarer klarer Schleimhaut mit einer Pinzette. HINWEIS: Das Fett und das Mesenterium sind an der äußeren Oberfläche des Darms befestigt.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel Fett wie möglich, um nachteilige Auswirkungen auf das Dissoziationsprotokoll zu vermeiden. Spülen Sie die Fragmente mit einer Spritze mehrmals vorsichtig mit sterilem, eiskaltem PBS aus, um den Darminhalt und den Schleim abzuwaschen. Vermeiden Sie grobe Handhabung.</li>
	<li>Präparieren Sie das Darmsegment in kleine Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen, das mit 1 ml eiskaltem PBS gefüllt ist.</li>
	<li>Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch 1 ml eiskaltes 0,08%iges BSA-DPBS. Resuspendieren Sie die Gewebefragmente durch sanftes Absaugen mit einer Glaspipette. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und verdauen Sie die Gewebefragmente mit 1 ml des enzymatischen Dissoziationsreagenzes (950 μl Kollagenase/Dispase-Lösung und 50 μl FBS) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 30-60 Minuten.<ol><li>Zusätzlich werden 5 μl RNase-Inhibitor (40 U/μl in der Stammlösung) zum Dissoziationsreagenz gegeben, wenn die Proben für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung vorbereitet werden. HINWEIS: Die Endkonzentration der Kollagenase/Dispersionsmischung beträgt 1 mg/ml, einschließlich Kollagenase bei 0,1 U/ml und Dispase bei 0,8 U/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Drehen Sie den Schlauch während des 30-60-minütigen Wasserbades in 5-Minuten-Intervallen manuell um. HINWEIS: Die genaue Inkubationszeit variiert je nach verwendetem Gewebe. Kontrollieren Sie den Fortschritt der Dissoziation unter dem Mikroskop, bis kein Massengewebe mehr zu sehen ist. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension mit einer Pipette auf einen Objektträger und untersuchen Sie ihn unter dem Mikroskop. Erhöhen Sie die Verdauungszeit, wenn die Zellen nicht vollständig dissoziiert sind.</li>
	<li>Drehen Sie die Röhrchen bei 300 × g für 5 min bei 4 °C herunter und entfernen Sie vorsichtig das enzymatische Zelldissoziationsreagenz mit weit geöffneten Spitzen. Fügen Sie 1 ml eiskaltes 0,08 % BSA-DPBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 1 Minute lang mit einer Glaspipette mit breitem Durchmesser auf und ab.<ol><li>Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Anmerkungen: Das Auf- und Abpipettieren sollte mit Vorsicht unter Verwendung von Spitzen mit breiter Bohrung und geringer Retention durchgeführt werden, um einen Zellaufschluss zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Befeuchten Sie ein 40-μm-Zellsieb mit 0,08 % BSA-DPBS und legen Sie es in ein konisches 50-ml-Röhrchen. Führen Sie die Zellsuspension durch das Sieb. Klopfen und spülen Sie mit zusätzlichen 200 μl DPBS und sammeln Sie die Suspension am Boden des Röhrchens.</li>
	<li>Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. 5 μl DNase I (1 U/μl) zugeben und 15 min bei 15-20 °C inkubieren. Bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 μl eiskaltem DPBS (Ca 2+/Mg2+ frei). Pipettieren Sie vorsichtig mit weit geöffneten Spitzen auf und ab, um die Zellen zu vermischen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.</li>
</ol>5. Färbung und mikroskopische Untersuchung
<ol><li>Zum Färben wird die Zellsuspension im Verhältnis 1:1 mit 0,4%iger Trypanblaulösung gemischt. 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie 5-10 μl der Mischung auf ein Hämozytometer und untersuchen Sie sie unter dem Mikroskop. HINWEIS: Lebensfähige Zellen haben ungefärbtes Zytoplasma, während tote Zellen ein blaues Zytoplasma haben (Abbildung 2).</li>
	<li>Zählen Sie die lebensfähigen und toten Zellen in drei verschiedenen Feldern unter dem Mikroskop. Berechnen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität, indem Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in einem Feld dividieren. HINWEIS: Die Zellviabilität sollte mehr als 85% betragen und die Zellkonzentration sollte nicht weniger als 1 x 105-1 x 107/ml betragen. Der Hintergrund der Zellsuspension sollte sauber sein, ohne Klumpen, Fragmente oder Verunreinigungen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer hochwertigen einzelligen Suspension aus Nil-Tilapia-Darm. Vor der Dissoziation ist die Entfernung von Fett und Mesenterium aus dem Darm notwendig, insbesondere bei fleischfressenden Fischdärmen mit viel Fett. Die Verwendung einer Spritze anstelle von hartem Schaben zum Abwaschen des Darminhalts reduziert die mechanische Schädigung der Zellen. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten, ist es auch wichtig, die Temperatur für die Gewebedissektion und das Spülen bei...

Zellen sind die Grundbausteine von Organismen. Im Vergleich zu Bulk-Gewebestudien können Studien auf Einzelzellebene die Zellheterogenität widerspiegeln und Informationen mit höherer Auflösung liefern1. In den letzten Jahren haben Forscher Einzelzellsequenzierungstechnologien für Genom-, Transkriptom-, Epigenom- oder Multi-Omik-Studien auf Einzelzellebene bei Säugetieren, Zebrafischen und anderenModellorganismen angewendet und von großen Durchbrüchen berichtet 2,3,4,5,6,7 . Während sich die meisten Studien auf Modellorganismen konzentriert haben, gibt es nur wenige Referenzprotokolle oder kommerzielle Dissoziationskits für die Einzelzellsequenzierung bei wirtschaftlichen Fischarten, was die Anwendung der Einzelzellsequenzierung in der Aquakulturforschung einschränkt. Daher ist die Entwicklung von Gewebedissoziationsprotokollen, die qualitativ hochwertige Einzelzellsuspensionen mit hoher Zellviabilität und Nukleinsäureintegrität herstellen, von entscheidender Bedeutung.
Die Optimierung des Gewebedissoziationsprotokolls mit dem geeigneten Enzym oder der Enzymkombination ist von entscheidender Bedeutung, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Welches Enzym für die Gewebedissoziation am effektivsten ist, hängt vom Gewebetyp ab. Bei Säugetieren wurden mehrere Enzyme zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für festes Gewebe von Säugetieren verwendet, darunter Kollagenase, Dispase, Trypsin, Papain, Elastase, Hyaluronidase, Liberase, Accutase und TrypLE 8,9. Die Trypsinverdauung in Kombination mit mechanischer Störung wurde häufig verwendet, um Gewebe für die Zellkultur bei Fischen zu dissoziieren 10,11,12,13,14. Trypsin wurde auch für die Gewebedissoziation im Rattendarm15 und im Zebrafisch-Kiemengewebe16 verwendet oder dem Verdauungscocktail zugesetzt. Aus mehreren Gründen ist Trypsin jedoch nicht die beste Option für die Einzelzellsequenzierung. Trypsin allein ist bei der Gewebedissoziation in der Regel unwirksam. Zusätzlich induziert Trypsin DNA-Strangbrüche 17,18 und RNA-Abbau19.
Papain baut die Proteine ab, aus denen die Tight Junctions zwischen den Zellen bestehen. In Nervenzellen und glatten Muskelzellen von Säugetieren ist Papain effizienter und weniger zerstörerisch als andere Proteasen20,21. Wie Trypsin führt Papain jedoch zu einer freien DNA-induzierten Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse, die während der enzymatischen Verdauung stattfindet9. Elastase baut Elastin ab, das typischerweise in Haut, Lunge, Bändern, Sehnen und Gefäßgewebe vorkommt22. Es wird häufig in Kombination mit Kollagenase, Dispase oder Trypsin zur Dissoziation von Lungengewebe verwendet8. Hyaluronidase spaltet die glykosidischen Bindungen der Hyaluronsäure und trägt zur Verdauung der extrazellulären Matrix in verschiedenen Bindegeweben und der Haut bei 9,23.
Im Allgemeinen sind Kollagenase und Dispase gute Optionen für den Abbau der extrazellulären Matrix. Sie wurden bei der Dissoziation von Menschen-, Maus- und Zebrafischdärmenverwendet 24,25,26,27. Kollagenase zerstört die Peptidbindung im Kollagen, fördert die Verdauung der extrazellulären Matrix und setzt die Zellen in Suspension frei, so dass Kollagenase häufig für die Dissoziation von festem Gewebe von Mensch und Maus verwendet wird, einschließlich für die Leber 28,29, Milz30, Bauchspeicheldrüse31 und Darm 25. Dispase ist eine Protease, die die N-terminalen Peptidbindungen unpolarer Aminosäurereste hydrolysiert und milder als Kollagenase ist. Es spaltet die Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Fibronektin, Typ-IV-Kollagen und in geringerem Maße Typ-I-Kollagen, ohne die Zell-Zell-Verbindungen zu beeinträchtigen. Dispase wird separat oder zusammen mit anderen Enzymen zur Gewebedissoziation verwendet, z. B. für Darm25,32, Gehirn 33, Leber 34 usw. Darüber hinaus sind kommerziell erhältliche Verdauungscocktails, einschließlich Liberase, Accutase und TrypLE, auch gute Alternativen für die Dissoziation fester Gewebe, insbesondere für Haut, Leber und Niere 8,9.
Nil-Tilapia (Oreochromis niloticus) gehört zur Familie der Cichlidae aus der Ordnung der Perciformes. Er ist eine der am häufigsten gezüchteten Süßwasserfischarten in tropischen und subtropischen Gebieten mit einer Jahresproduktion von 4,5 Millionen Tonnen im Jahr 202235. Er ist eine der am besten untersuchten Aquakulturfischarten mit einem gut annotierten Genom. Nil-Tilapia ist aufgrund seiner kurzen Generationszeit, seiner einfachen Aufzucht und seiner Anpassungsfähigkeit an eine Vielzahl von Aufzuchtumgebungen ein ideales Forschungsmodell für Aquakulturfischarten. Der Darm ist von großem Forschungsinteresse, da er das Organ der Ernährung, der Verdauung und Resorption, des Stoffwechsels und der Immunität der Schleimhäute ist. Der Darm ist Lebensraum mikrobieller Populationen und ein essentielles Immungewebe36. Es ist immunologisch aktiv, da zahlreiche Immunzelltypen vorhanden sind, darunter Makrophagen, B-Zellen, Granulozyten und T-Zellen.
In der aktuellen Studie haben wir ein Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus dem Nil-Tilapia-Darm entwickelt, um Einzelzellstudien in Aquakulturfischarten zu ermöglichen. Entsprechend den Eigenschaften dieser gewebespezifischen Enzyme und der Vorarbeiten ist Kollagenase/Dispase geeignet, um Tilapia-Darmgewebe zu dissoziieren. Der letzte Enzymtyp, der bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen zu berücksichtigen ist, ist DNase-I, der die Zellaggregation verhindert, indem er freie DNA abbaut, die durch die Lyse toter Zellen während der enzymatischen Verdauung freigesetzt wird, ohne apoptotische Wege zu initiieren9 , und die Ausbeute an lebenden Zellen erhöht36. Zusätzlich wird dem Waschpuffer Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt, um die Zellverklumpung zu reduzieren und die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Mehrere Reagenzienhersteller beschreiben BSA als Enzymstabilisator. Die Zugabe von 0,04 %-1 % BSA zu PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) wurde verwendet, um eine Waschlösung zur Herstellung von Einzelzell-Sequenzierungssuspensionen ohne nachteilige Auswirkungen zu entwickeln38. Die Zugabe eines niedrigen BSA-Verhältnisses könnte dazu beitragen, die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die durch freie DNA induzierte Aggregation von Zellen aufgrund der Zelllyse zu vermeiden. Dieses Protokoll kann auch eine wertvolle Referenz für die Entwicklung von Zelldissoziationsprotokollen aus dem Darm anderer Aquakulturfischarten darstellen.

<table><tbody><tr><td>0,22-&mu; m Sterilfilter</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SLGV033RB</td><td>Er wird zum Filtern und Sterilisieren der Enzymlösung verwendet.</td></tr><tr><td>40-& mu; m Cell Strainer</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>F8200</td><td>Cell Strainer wird verwendet, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0098</td><td>Pulver; 0,04 g BSA mit 100 mL verdünnen 1&mal; DPBS zur Aufbereitung von 0,04 % BSA-DPBS Waschbffer. Bei 2 - 8 °C lagern.</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>Mit PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.</td></tr><tr><td>Kollagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td> Mit <td>PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td> Mit <td>PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNase I hilft, die Zellverklumpung zu reduzieren.</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS), Ca2+/Mg2+frei</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600438</td><td>Mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml verdünnen.</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Serum, verwendet in einer Volumenmenge von 5 % in Digtstionslösung.</td></tr><tr><td>Invertiert&nbsp; Mikroskop</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>Es wird verwendet, um die Lebensfähigkeit von Zellen zu untersuchen.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Mit PBS auf eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml verdünnen.</td></tr><tr><td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift Aquaculture Technology Co., Ltd.</td><td>NA</td><td>Gesunder Fisch ohne Krankheitszeichen (mittleres Körpergewicht: 100 g).</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Es dient zum Schleudern des Gewebes und der Zelle.</td></tr><tr><td>RNase-Inhibitor</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>Hemmung der RNase-Aktivität</td></tr><tr><td>Festphasen-RNase-Be-Gone-Reagenz</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>Es wird verwendet, um die RNase von Werkzeugen wie Präparierscheren und Glaspipetten zu entfernen. Bei Raumtemperatur lagern.</td></tr><tr><td>Tricain-Methansulfonat (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Zur Euthanasie von Fischen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>Es wird zum Färben abgestorbener Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607001</td><td>Mit PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen.</td></tr></tbody></table>

einzelzell-suspensionspräparat aus nil-tilapia-darm für die einzelzell-sequenzierung

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nil-Tilapia ist eine der am häufigsten kultivierten Süßwasserfischarten weltweit und ein weit verbreitetes Forschungsmodell für Aquakulturfischstudien. Die Herstellung von qualitativ hochwertigen Einzelzellsuspensionen ist für Einzelzellstudien wie Einzelzell-RNA oder Genomsequenzierung unerlässlich. Es gibt jedoch kein gebrauchsfertiges Protokoll für Aquakulturfischarten, insbesondere für den Darm von Tilapia. Die wirksamen Dissoziationsenzyme variieren je nach Gewebetyp. Daher ist es wichtig, das Gewebedissoziationsprotokoll durch die Auswahl des geeigneten Enzyms oder der Enzymkombination zu optimieren, um genügend lebensfähige Zellen mit minimaler Schädigung zu erhalten. Diese Studie veranschaulicht ein optimiertes Protokoll zur Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Nil-Tilapia-Darm mit einer Enzymkombination aus Kollagenase/Dispase. Diese Kombination ist hochwirksam für die Dissoziation mit der Verwendung von Rinderserumalbumin und DNase, um die Zellaggregation nach der Verdauung zu reduzieren. Der Zellausstoß erfüllt die Anforderungen für die Einzelzellsequenzierung mit einer Zellviabilität von 90 % und einer hohen Zellkonzentration. Dieses Protokoll kann auch modifiziert werden, um eine einzellige Suspension aus dem Darm anderer Fischarten herzustellen. Diese Forschung stellt ein effizientes Referenzprotokoll dar und reduziert den Bedarf an zusätzlichen Versuchen bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Aquakulturfischarten.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzellsequenzierung (Abbildung 1). Diese Forschung zeigt, dass die Kollagenase/Dispase-Mischung eine gute Dissoziationswirkung hat und mild für das Darmgewebe ist. Die Auswahl des optimalen Verdauungsenzyms ist entscheidend für die Herstellung einer hochwertigen einzelligen Suspension. In den Vorarbeiten wurden die Dissoziationseffizienzen mehrerer häufig verwendeter Enzyme ve...

Hier demonstrieren wir die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung.

Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Referenz für die Herstellung einer hochwertigen Einzelzellsuspension aus dem Nil-Tilapia-Darm, um Einzelzellstudien in Aquakulturfischarten zu erleichtern. Die Technologie ist hocheffizient und kann unter den meisten Laborbedingungen eingesetzt werden. Es reduziert den Bedarf an zusätzlichen Versuchen zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Aquakulturfischarten.Beginnen Sie damit, sechs Monate alte Nil-Tilapia-Fische 15 Minuten lang in gut belüftetem, sterilem Wasser abzuspülen, um lose gebundene Bakterien von der Oberfläche abzuwaschen. Zur Herstellung des enzymatischen Zelldissoziationsreagenzes wird die Kollagenase-Dispase in PBS auf eine Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnt. Mischen Sie 95 Volumenprozent der hergestellten enzymatischen Lösung und 5 Volumenprozent FBS.Anschließend die Zentrifuge vor Gebrauch auf vier Grad Celsius vorkühlen. Legen Sie den eingeschläferten Fisch für die Gewebedissektion auf Eis und sammeln Sie drei bis vier Zentimeter des Darmmittelteils. Entfernen Sie das Fett und das Mesenterium mit einer Pinzette.Entfernen Sie das Fett, das an der Darmoberfläche haftet, und die elastische und formbare klare Schleimhaut. Spülen Sie das Darmfragment vorsichtig mit sterilem, eiskaltem PBS mit einer Spritze ab, um den Darminhalt und den Schleim abzuwaschen. Zerlegen Sie das Fragment nach mehreren Wäschen in kleine Stücke und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter eiskaltem PBS.Zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 x g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Und ersetzen Sie den Überstand durch einen Milliliter eiskaltes 0,08%BSA-DPBS. Mit einer Glaspipette vorsichtig absaugen, um die Gewebefragmente zu resuspendieren.Nachdem Sie die Stücke noch einmal gewaschen haben, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter des vorbereiteten enzymatischen Dissoziationsreagenzes hinzu. Mischen Sie außerdem fünf Mikroliter RNA-Inhibitor mit dem Dissoziationsreagenz für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Stellen Sie das Röhrchen in ein temperiertes Wasserbad mit 37 Grad Celsius und drehen Sie das Röhrchen während der Inkubationszeit von 30 bis 60 Minuten alle fünf Minuten manuell um.Sobald die Röhrchen gedreht sind, entfernen Sie das enzymatische Zelldissoziationsreagenz mit weit geöffneten Spitzen. Fügen Sie einen Milliliter eiskaltes 0,08%BSA-DPBS hinzu und pipettieren Sie die Zellen vorsichtig auf und ab, um eine Zellzerstörung zu verhindern. Nach der Zentrifusion und dem erneuten Resuspendieren der Zellen wird das mit 0,08 % BSA-DPBS vorbenetzte 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben.Führen Sie die Zellsuspension durch das Sieb. Klopfen Sie auf das Sieb, spülen Sie es dann mit 200 Mikrolitern DPBS aus und sammeln Sie die Suspension am Boden des Röhrchens. Nachdem Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umgefüllt haben, fügen Sie fünf Mikroliter DNA hinzu und inkubieren Sie die Suspension 15 Minuten lang bei 15 bis 20 Grad Celsius.Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern eiskaltem DPBS ohne Kalzium- und Magnesiumionen. Pipettieren Sie dann vorsichtig mit weiten Spitzen auf und ab, um die Zellen zu mischen, und wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal. Zum Färben wird die Zellsuspension in 0,4%iger Trypanblaulösung in einem gleichen Verhältnis gemischt und drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.Dann 10 Mikroliter der Mischung auf den Objektträger geben. Zählen Sie die lebensfähigen und toten Zellen unter dem Mikroskop in drei Feldern und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität. Die Dissoziationseffizienzen mehrerer häufig verwendeter Enzyme wurden verglichen.Es wurde nachgewiesen, dass die Kollagenase-Dispase-Mischung einen besseren Dissoziationseffekt hat als die Kollagenase-Dispase oder Trypsin allein und mehrere andere Enzymmischungen. Die mikroskopische Untersuchung zeigte, dass die Darmzellen eine hohe Lebensfähigkeit aufwiesen und sich als Einzelzellen verteilten. Die meisten Zellen waren lebensfähig, während einige wenige aufgrund der permeablisierten Zellmembran abgestorben waren.Achten Sie auf die Art des verwendeten PBS. Die enzymatische Verdauungslösung kann nicht mit Calcium/Magnesium-freiem PBS verwendet werden, da das Enzym Calcium/Magnesium-Ionen benötigt, um effektiv zu funktionieren. Das Verfahren erleichtert Einzelzellstudien an Aquakulturfischarten und bietet eine wertvolle Referenz für die Entwicklung von Zelldissoziationsprotokollen von Aquakulturfischarten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um schnell qualitativ hochwertige Kerne aus dem frischen oder gefrorenen Gewebe für die nachgelagerten massiv parallelen RNA Sequenzierung zu isolieren. Wir enthalten Waschmittel-mechanische und hypotone-mechanische Gewebe Störung und Zelle Lyse Optionen, die für die Isolierung von Kernen verwendet werden können.

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

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Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen und -kernen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern vor, die stabilen oder gestörten Strömungsbedingungen ausgesetzt sind, um Einzelzell-Omics-Experimente durchzuführen.

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Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus schockgefrorenem, archiviertem Lebergewebe für Einzelkern-RNA-seq, ATAC-seq und Gelenk-Multiomics (RNA-seq und ATAC-seq) vor.

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Die Studie beschreibt ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenem Säugetiergewebe für die nachgeschaltete Einzelkern-RNA-Sequenzierung.

Ein einfaches, schnelles und teilautomatisiertes Protokoll für die Isolierung von Einzelkernen aus gefrorenem Säugetiergewebe für die Einzelkernsequenzierung

Hier beschreiben wir ein zweistufiges Zellverdauungsprotokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension von Maus-Halsschlagadern.

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Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.

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Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

Um die Perizyten des Gehirnkortikats der Maus zu erhalten, die den Anforderungen von scRNA-seq entsprechen, stellen wir ein kritisch optimiertes FACS-Protokoll auf Basis der CD13/CD31⁻-Auswahl vor. Unsere wichtigsten Verfeinerungen verbessern die Zelllebensfähigkeit und die RNA-Integrität erheblich und ermöglichen eine zuverlässige transkriptomische Profilierung.

Isolierung von Perizyten aus Mauskortikalgewebe mittels FACS zur Einzelzellsequenzierung

Lernen Sie die enzymatische Zellauflösung zur Herstellung hochwertiger Einzelzellsuspensionen aus dem Darm von Oreochromis niloticus. Diese Methode ermöglicht zuverlässige Einzelzell-Sequenzierungsstudien in der Aquakulturforschung.

Einzelzell-Suspensionspräparat aus Nil-Tilapia-Darm für die Einzelzell-Sequenzierung

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