HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von Clematidis armandii caulis

Dieses Protokoll kann eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung der echten Materialien von Clematidis armandii caulis und seinen Verfälschungsmitteln bieten. Diese Methode kann in der medizinischen Materialqualitätsforschung verwendet werden und bietet eine Referenz für die Untersuchung der Qualitätsstandards anderer chinesischer Arzneimittelmaterialien. Um mit der Probenvorbereitung zu beginnen, mahlen Sie das Rohmaterial auf eine gleichmäßige Partikelgröße, indem Sie es durch ein Nylonnetz mit einem geeigneten Innendurchmesser leiten.

Zwei Gramm des gemahlenen Rohmaterials wurden genau in einen verschlossenen 50-Milliliter-Konikenkolben überführt, bevor 50 Milliliter Methanol in den Kolben gegeben wurden. Legen Sie den Stopfen auf den Kolben in mit 600 Watt und 40 Kilohertz erhitztem Ultraschall für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation die medizinische Extraktlösung durch das Filterpapier abseihen.

Nach dem Abseihen werden vier Milliliter der Methanollösung, die die medizinischen Extrakte enthält, in einen 10-Milliliter-Messkolben überführt. Dann fügen Sie sechs Milliliter Wasser hinzu und mischen Sie die Lösung. Lassen Sie die Lösung 10 Minuten ruhen.

Zur HPLC-Analyse der Proben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der mobilen Phasen und stellen Sie das HPLC-Gradientenprogramm wie im Manuskript beschrieben ein. Filtern Sie die Probe durch eine 0,45 μm mikroporöse Filtermembran und unterziehen Sie sie einer HPLC-Analyse.

Führen Sie für jede Probe sechs Mal täglich eine Analyse durch. Um die Stabilität der Probenlösung zu beurteilen, analysieren Sie dieselbe Probenlösung, die 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 Stunden nach der Vorbereitung bei Raumtemperatur gelagert wird. Nehmen Sie sechs Replikate derselben Probe und erkennen Sie ihren Fingerabdruck in der HPLC.

Importieren Sie die relevanten Daten in die Software Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine oder SESCF TCM Version 2012. Importieren Sie die Verweilzeit und den Spitzenbereich für alle 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben sowie fünf Chargen von Verfälschungsmitteln zur Analyse in die SESCF-TCM. Klicken Sie im Hauptmenü auf das eingestellte Referenzspektrum und gehen Sie zum Fenster mit den Parametereinstellungen, um den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Art von Chuanmutong als Referenz festzulegen.

Legen Sie als Nächstes die Regelspektrumgenerierungsmethode als Medianmethode mit der Zeitfensterbreite von 0,5 fest. Klicken Sie dann im Hauptmenü auf Mehrpunktkalibrierung, wählen Sie die Peaks aus und wählen Sie dann die Peak-Matching-Option als markierte Peaks. Klicken Sie abschließend auf Ähnlichkeit berechnen, um eine Ähnlichkeitsanalyse der Proben basierend auf den Referenzchromatogramm-Fingerabdrücken von Chuanmutong durchzuführen.

Um eine systemische Clusteranalyse durchzuführen, öffnen Sie die entsprechende statistische Analysesoftware und klicken Sie auf Datei, um die Daten von 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln in die Software zu importieren. Klicken Sie im Menü auf der Registerkarte Klassifizierung auf Analyse und Systemclustering. Wählen Sie die gemeinsamen Spitzenbereiche von 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln als Variablen aus.

Legen Sie die Anzahl der Cluster auf vier fest. Klicken Sie anschließend auf Methode, um die Clustering-Methode als Intergruppenverbindung auszuwählen. Wählen Sie das Messintervall als Pearson-Korrelation aus, und verwenden Sie die Registerkarte OK, um die Clusteranalysekarte zu zeichnen.

Für die Hauptkomponentenanalyse oder PCA öffnen Sie die Datenanalysesoftware. Klicken Sie im Menü auf Datei und erstellen Sie ein neues reguläres Projekt. Importieren Sie die Peakfläche von 12 gemeinsamen Peaks in eine Excel- oder ähnliche Tabelle aus dem HPLC-System.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um den Datenimport abzuschließen. Um den Modelltyp mit PCA festzulegen, klicken Sie auf Neu, um ein neues Modell zu erstellen, und passen Sie die Daten dann mit Autofit an und fügen Sie Registerkarten hinzu. Gehen Sie zu Ergebnisse, um die PCA-Punktekarte zu erhalten.

Um die Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis oder OPLSDA zu verwenden. Generieren Sie die PCA-Score-Map wie zuvor gezeigt. Legen Sie den Modelltyp mit dem OPLSDA fest, indem Sie auf Neu und Neu als Modell eins klicken Bevor Sie bei der Auswahl von Par für alle skalieren, klicken Sie dann auf AutoFit in Scores, um die OPLSDA-Score-Map zu generieren.

Um die Wichtigkeit und Projektion der Variablen zu schätzen, gehen Sie zum Menü der Datenanalysesoftware und gehen Sie zu Analysieren, gefolgt von der Einstellung der Zahl auf 200 unter pro Mutation. Rufen Sie die R-Quadrat- und Q-Quadratwerte aus dem OPLSDA-Score ab und klicken Sie auf VIP und VIP Predictive, um die VIP-Karte zu erhalten. HPLC-Fingerabdrücke der 10 authentischen Chuanmutong-Proben zeigten 12 verschiedene gemeinsame Peaks, von denen die relativ groß und gut aufgelöst sind.

Peak Nummer 10 wurde als Referenzpeak verwendet, um die relativen Retentionszeiten der Ruhepeaks zu schätzen. Die authentischen Proben zeigten Ähnlichkeitsgrade sehr nahe an einem, was eine hohe Ähnlichkeit in guter Konsistenz impliziert. Die Ähnlichkeitsgrade zwischen den fünf Chargen von Verfälschungsmitteln und dem Kontroll-Chuanmutong waren jedoch recht gering.

Es wurde beobachtet, dass sich die HPLC-Fingerabdrücke der fünf Verfälschungsmittel von den authentischen Proben unterscheiden, hauptsächlich in der Region mit Retentionszeiten von 28 bis 55 Minuten. PCA zeigte eine offensichtliche Ähnlichkeit zwischen den authentischen Sorten und ihrem Unterschied zu den Verfälschungsmitteln, mit Ausnahme des Verfälschungsmittels CC.Ähnliche Ergebnisse wurden auch aus der Clusteranalyse erhalten, als der Klassifizierungsabstand 20 betrug. Die aus OPLSDA generierte Score-Matrix zeigte keine Schnittmenge zwischen den Stichprobenpunkten authentischer Proben und den Verfälschungsmitteln.

Auch hier ähnelte das Verfälschungsmittel CC den authentischen Sorten mehr als die anderen Verfälschungsmittel. Gemäß der VIP-Karte wurden die Gipfel mit Werten größer als eins als Hauptmarkerkomponenten identifiziert, die den Unterschied zwischen authentischen Proben und den Verfälschungsmitteln verursachen. Der Gehalt an Beta-Sitosterol, einer aktiven Komponente, die in Chuanmutong gefunden wurde, wurde in allen fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nachgewiesen, aber der Gehalt variierte stark.

Dieses Protokoll legt verschiedene Analysemethoden fest, um alle Informationen über medizinische Materialien aus verschiedenen Blickwinkeln zu reflektieren und die Authentizität von Chuanmutong-Arzneimitteln abzuschätzen.