Name: HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von Clematidis armandii caulis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Erfahren Sie die HPLC-basierte chemische Fingerabdruckanalyse zur Unterscheidung echter Clematidis armandii caulis von Verfälschungen. Diese Methode sichert die Qualität traditioneller Arzneimittel durch präzise Multimustererkennung.

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Diese Arbeit wurde vom Projekt der Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (Nr. 2020JC0088, Nr. 2021MS203) unterstützt.

1. Methoden zur Detektion chemischer Fingerabdrücke
<ol><li>Chromatographische Bedingungen<ol><li>Bereiten Sie die mobile Phase Acetonitril (A)/Wasser (B) vor. Stellen Sie in der HPLC-Software ein Gradientenprogramm wie folgt ein: 0-20 min, 3%A-10%A; 20-25 min, 10%A-13%A; 25-65 min, 13%A-25%A; 65-75 min, 25%A-40%A; 75-76 min, 40%A-3%A; 76-85 min, 3%A-3%A.</li>
		<li>Halten Sie die Durchflussrate der mobilen Phase bei 1,0 ml/min.</li>
		<li>Die chromatographische Trennung wird auf einer C18-Säule (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) bei 30 °C durchgeführt.</li>
		<li>Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 μL ein.</li>
		<li>Detektieren Sie die Proben bei einer Wellenlänge von 205 nm. HINWEIS: Die spezifischen Einstellungen der chromatographischen Bedingungen finden Sie in den Arbeitsverfahren der Arbeitssoftware der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Table of Materials).</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Probenlösung<ol><li>Mahlen Sie die Rohstoffe auf eine gleichmäßige Partikelgröße, indem Sie sie durch ein Nylonnetz mit einem Innendurchmesser von 850 μm ± 29 μm leiten.</li>
		<li>2 g des gemahlenen Rohmaterials (genau gewogen) in einen 50-ml-Konikenkolben mit einem Stopfen geben und 50 ml Methanol hinzufügen. Setzen Sie den Stopfen auf den Kolben und ultraschallen Sie (600 W, 40 kHz) für 30 min.</li>
		<li>Anschließend kühlen Sie den Kolben auf Raumtemperatur (RT) ab. Wiegen Sie die Proben erneut und gleichen Sie das Ausgangsgewicht aus, indem Sie das verlorene Extraktionsmittel ersetzen.</li>
		<li>Gießen Sie 4 mL der Methanollösung, die die medizinischen Extrakte enthält, in einen 10-ml-Messkolben. 6 mlH2Ohinzufügen, mischen und 10 min einwirken lassen.</li>
		<li>Zum Schluss filtrieren Sie den Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran und versetzen ihn in den Standby-Modus.</li>
	</ol></li>
	<li>Validierung von Fingerabdruckerkennungsmethoden<ol><li>Bereiten Sie die Probe wie oben beschrieben vor (Schritt 1.2) und unterziehen Sie sie sechsmal täglich einer HPLC-Analyse (Schritt 1.1). Um die Genauigkeit zu bewerten, berechnen Sie die relative Standardabweichung (RSD) der relativen Retentionszeit und der relativen Spitzenflächen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Bewerten Sie die Stabilität der Probenlösung, indem Sie dieselbe Probenlösung analysieren, die bei RT für 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 h gelagert wurde, und berechnen Sie die RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Peakflächen, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Nehmen Sie sechs Replikate derselben Probe (CMT-4), bereiten Sie die Probenlösung gemäß dem obigen Verfahren vor (Schritt 1.2) und erkennen Sie ihren Fingerabdruck in der HPLC nach Schritt 1.1. Berechnen Sie den RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Spitzenbereiche und bewerten Sie seine Wiederholbarkeit wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Verwenden Sie dann den Peak Nummer 10 in Abbildung 1B als Referenzpeak und berechnen Sie den RSD der relativen Retentionszeit und der relativen Peakfläche jedes gemeinsamen Peaks, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Verwenden Sie die unten aufgeführten Formeln, um die relative Retentionszeit und die relative Spitzenfläche jedes gemeinsamen Peaks zu berechnen: T re = T-Kennlinie/TReferenz A re = EinMerkmal/A-Referenz Dabei ist T re = relative Retentionszeit, T-Merkmal = charakteristische Peak-Retentionszeit, T-Referenz = Referenz-Peak-Retentionszeit, A re = relative Peak-Fläche, A-Merkmal = charakteristische Peakfläche und AReferenz = Referenz-Peak-Fläche. HINWEIS: Die Etablierung von Fingerabdrücken der traditionellen chinesischen Medizin erfordert im Allgemeinen die Auswahl eines chromatographischen Peaks, der leicht zu erhalten ist und eine hohe Auflösung aufweist. Dieser dient als Referenzpeak, um die Fingerabdrücke zu identifizieren und auf ihre Stabilität und Reproduzierbarkeit zu untersuchen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Etablierung der Chuanmutong-Fingerabdruck- und Ähnlichkeitsanalyse
<ol><li>Verwenden Sie 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen Verfälschungsmittel wie Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS) und Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) als Proben für die Fingerabdruckanalyse.</li>
	<li>Bereiten Sie die Beispiellösungen wie in Schritt 1.2 beschrieben vor. Führen Sie eine Fingerabdruckanalyse aller Probenlösungen mittels HPLC gemäß den in Schritt 1.1 beschriebenen Bedingungen durch.</li>
	<li>Import der relevanten Daten in das Ähnlichkeitsbewertungssystem chromatographischer Fingerabdrücke der traditionellen chinesischen Medizin (SESCF-TCM, Version 2012). Das System bezeichnet die Peaks mit angemessener Höhe und guter Auflösung in den Chromatogrammen aller Proben als gemeinsame Peaks. HINWEIS: Die SESCF-TCM-Software kann nach Registrierung auf der Website der Chinese Pharmacopoeia Commission (http://114.247.108.158:8888/login) heruntergeladen werden.<ol><li>Klicken Sie in der Software im Menü auf die Schaltfläche Referenzspektrum festlegen .</li>
		<li>Legen Sie dann im Fenster Parametereinstellungen die Breite des Zeitfensters auf 0,5 fest und wählen Sie Steuerspektrumgenerierungsmethode als Medianmethode aus.</li>
		<li>Klicken Sie im Hauptmenü auf Multi-Point-Kalibrierung und wählen Sie dann Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.</li>
		<li>Klicken Sie abschließend auf Kontrolle generieren, um den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Art von Chuanmutong zu generieren .</li>
	</ol></li>
	<li>Importieren Sie die Verweilzeit und den Spitzenbereich von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln zur Analyse in SESCF-TCM. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:<ol><li>Klicken Sie in der Software im Hauptmenü auf die Schaltfläche Referenzspektrum einstellen .</li>
		<li>Legen Sie im Fenster Parametereinstellungen den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Chuanmutong-Art als Referenz fest, wählen Sie die Control Spectrum Generation Method als Medianmethode und legen Sie die Zeitfensterbreite auf 0,5 fest.</li>
		<li>Klicken Sie im Hauptmenü auf Multi-Point-Kalibrierung und wählen Sie dann Peak Matching als Full Spectrum Peak Matching.</li>
		<li>Klicken Sie abschließend auf Ähnlichkeit berechnen, um die Ähnlichkeit basierend auf den Referenzchromatogramm-Fingerabdrücken von Chuanmutong zu berechnen. Berechnen Sie schließlich die Ähnlichkeit der Fingerabdrücke mit dem Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (Version 2012). HINWEIS: Informationen zu den spezifischen Operationen finden Sie in den Betriebsspezifikationen für das Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (Version 2012).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Multi-Muster-Erkennungsanalyse des Chuanmutong-Fingerabdrucks
<ol><li>Clusteranalyse (CA)<ol><li>Verwenden Sie die Spitzenbereiche von 12 gemeinsamen Peaks in den Fingerabdrücken von 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben und ihrer fünf Chargen von Verfälschungsmitteln als Variablen und geben Sie sie in statistische Analysesoftware für die systematische Clusteranalyse (CA) ein.</li>
		<li>Wählen Sie die Between-Groups-Methode und verwenden Sie den Pearson-Korrelationskoeffizienten als Klassifizierungsgrundlage, um ein Clusteranalysediagramm von Chuanmutong und seinen Verfälschungsmitteln zu zeichnen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:<ol><li>Klicken Sie in der statistischen Analysesoftware auf Datei, um Daten zu importieren.</li>
			<li>Klicken Sie im Menü auf Analyse und dann auf System-Clustering in Klassifizierung.</li>
			<li>Wählen Sie den gemeinsamen Spitzenbereich als Variable aus und legen Sie die Anzahl der Cluster auf vier fest.</li>
			<li>Klicken Sie auf Methode, wählen Sie die Clustering-Methode als Inter-Group Connection aus, wählen Sie das Messintervall als Pearson-Korrelation aus und klicken Sie auf OK, um die CA-Karte zu zeichnen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Hauptkomponentenanalyse (PCA)<ol><li>Importieren Sie die relative gemeinsame Peakfläche der authentischen Sorten und ihrer Verfälschungsmittel in die Analysesoftware für die PCA-Analyse und verwenden Sie die PCA-Score-Map, um die Score-Matrix-Karte der Stichprobenunterschiede auszuwerten. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:<ol><li>Öffnen Sie die Datenanalysesoftware, klicken Sie im Menü auf Datei und erstellen Sie ein neues reguläres Projekt. Importieren Sie den Peakbereich von 12 gemeinsamen Peaks in eine Tabelle (z. B. Excel-Format) aus dem HPLC-System. Klicken Sie dann auf Fertig stellen , um den Datenimport abzuschließen.</li>
			<li>Klicken Sie auf Neu , um ein neues Modell zu erstellen, um den Modelltyp mit PCA festzulegen. Klicken Sie auf Autofit und Hinzufügen , um die Daten anzupassen, und klicken Sie dann auf Scores , um die PCA-Score-Map zu erhalten.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Orthogonale partielle Least-Squares-Diskriminierungsanalyse (OPLS-DA)<ol><li>Verwenden Sie die Orthogonal partial least-squares discrimination analysis method with supervision mode, um die relativen gemeinsamen Peak-Area-Peaks der authentischen Chuanmutong-Sorten und Verfälschungsmittel weiter zu analysieren und eine OPLS-DA-Klassifizierungs-Score-Map aller Proben zu zeichnen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:<ol><li>Klicken Sie in der Datenanalysesoftware im Menü auf Datei, um eine Datei zu importieren und ein neues reguläres Projekt zu erstellen. Importieren Sie den Spitzenbereich von 12 gemeinsamen Spitzen in einer Tabelle aus dem HPLC-System und klicken Sie dann auf Fertig stellen , um den Datenimport abzuschließen.</li>
			<li>Klicken Sie auf Neu , um ein neues Modell zu erstellen, um den Modelltyp mit PCA festzulegen. Klicken Sie auf Autofit und Hinzufügen , um die Daten anzupassen. Klicken Sie dann auf Scores , um die PCA-Score-Map zu erhalten.</li>
			<li>Klicken Sie auf Neu und wählen Sie Neu als Modell Eins, um den Modelltyp mit OPLS-DA einzustellen.</li>
			<li>Klicken Sie auf Skalieren und setzen Sie den Typ mit Par für alle. Klicken Sie zuerst auf Autofit und dann auf Scores , um die OPLS-DA-Score-Map zu erhalten.</li>
		</ol></li>
		<li>Um den Einfluss jedes gemeinsamen Peaks in Chuanmutong auf seine Klassifizierungsergebnisse und den Unterschied zwischen authentischen Chuanmutong-Materialien und verwandten Verfälschungsmitteln zu bestimmen, verwenden Sie die variable Wichtigkeit in der Projektion (VIP) für die Analyse.</li>
		<li>Zeichne die VIP-Karte der verschiedenen Komponenten von Chuanmutong. Verwenden Sie die resultierende VIP-Karte, um die Auswirkungen jeder Variablen auf die Klassifizierung zu bewerten und Komponenten auszusortieren, die wesentlich zu den Unterschieden zwischen Gruppen beitragen. Die spezifischen Operationen sind wie folgt:<ol><li>Klicken Sie in der Datenanalysesoftware im Menü auf Analyse und klicken Sie auf Permutationen, setzen Sie die Anzahl der Permutationen auf 200 und erhalten Sie die R 2 und Q2 der OPLS-DA-Score-Map.</li>
			<li>Klicken Sie auf VIP und wählen Sie VIP Predictive, um die VIP-Karte zu erhalten. </li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>4. Bestimmung von β-Sitosterol in Chuanmutong mittels HPLC
<ol><li>Chromatographische Bedingungen (siehe Schritt 1.1)<ol><li>Bereiten Sie die mobile Phase vor: Methanol-Wasser (97:3).</li>
		<li>Stellen Sie die Durchflussrate der mobilen Phase auf 1,0 ml/min ein.</li>
		<li>Die chromatographische Trennung wird auf einer C18-Säule (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) bei 30 °C durchgeführt.</li>
		<li>Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 10 μL ein.</li>
		<li>Detektieren Sie das Bauteil bei einer Wellenlänge von 204 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Probenlösung<ol><li>Die Standardlösung von β-Sitosterol (0,1 mg/ml) wird durch Auflösen einer genau gewogenen Menge des entsprechenden Referenzstandards in Methanol hergestellt.</li>
		<li>Die Analyseprobe des Rohmaterials wird auf eine gleichmäßige Partikelgröße gemahlen, indem die Probe durch das Nylonnetz mit einem Innendurchmesser von 180 μm ± 7,6 μm geleitet wird.</li>
		<li>2 g des gemahlenen Rohmaterials (genau gewogen) in einen Rundkolben geben und 50 ml Chloroform hinzufügen.</li>
		<li>Schließen Sie den Kolben an einen Rückflusskondensator an und erhitzen Sie ihn in einem Siedewasserbad (mäßiges Kochen) für 60 min. Filtern Sie die Extraktionslösung mit einem 15-20 μm Filterpapier.</li>
		<li>Das Filtrat wird in einem kochenden Wasserbad (mäßiges Kochen) ca. 10 min bis zur Trockne eingedampft.</li>
		<li>Der Rückstand wird gelöst und das Volumen mit Methanol auf 5 ml aufgefüllt. Zum Schluss wird der Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran geleitet und in den Standby-Modus versetzt.</li>
	</ol></li>
	<li>Methodenvalidierung<ol><li>Man nimmt die in Unterschritt 4.2.1 hergestellte Stammlösung von β-Sitosterol, verdünnt sie mit 100%igem Methanol und stellt Lösungen mit Konzentrationen von 100 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml, 50 μg/ml, 40 μg/ml, 30 μg/ml und 20 μg/ml her.</li>
		<li>Injizieren Sie die Proben unter den in Schritt 4.1 beschriebenen chromatographischen Bedingungen, um die Peakfläche zu bestimmen, führen Sie eine Regressionsanalyse mit der Peakfläche zum Injektionsvolumen durch und erhalten Sie die Regressionsgleichung und den Korrelationskoeffizienten, um seine Linearität zu bewerten.</li>
		<li>Bereiten Sie die Proben wie oben beschrieben vor (Schritt 4.2) und unterziehen Sie sie am selben Tag sechsmal einer HPLC-Analyse (Schritt 4.1). Berechnen Sie dann die RSD der Spitzenbereiche, um die Genauigkeit zu bewerten.</li>
		<li>Bewerten Sie die Stabilität der Probenlösung, indem Sie dieselben Probenlösungen analysieren, die bei RT für 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 h gespeichert sind, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Berechnen Sie dann die RSD der Spitzenbereiche wie in Schritt 1.3.5 beschrieben.</li>
		<li>Die Wiederholbarkeit wird untersucht, indem dieselbe Probe (CMT-4) in Hextuplikat aufgelöst wird, die wie in Schritt 4.2 beschrieben hergestellt wurde, und einer HPLC-Analyse gemäß Schritt 4.1 unterzogen wird. Berechnen Sie dann die RSD des β-Sitosterolgehalts in sechs Proben.</li>
		<li>Bewerten Sie die Genauigkeit der Methode mithilfe der Standardadditionsmethode. Dazu fügen Sie den Proben β-Sitosterol-Referenzlösungen bei 80%, 100% und 120% des β-Sitosteringehalts hinzu und wiederholen Sie jede Bedingung dreimal, wie in Schritt 4.1 beschrieben. Bewerten Sie die Genauigkeit der Methode, indem Sie die durchschnittliche Wiederfindung und RSD berechnen. HINWEIS: Die Berechnungsformel für die Rückgewinnungsrate (RR) lautet wie folgt: RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100 Dabei ist M t = die Qualität von β-Sitosterin nach Zugabe des Standards, M 0 = die Qualität der Probenlösung und Ms = die Qualität des β-Sitosterols. </li>
	</ol></li>
	<li>Bestimmung des β-Sitosteringehalts von Proben<ol><li>Nehmen Sie 10 Chargen authentischer chinesischer Arzneimittel und fünf Chargen verwandter Verfälschungsmittel, um Probenlösungen gemäß Schritt 4.2 herzustellen.</li>
		<li>Dann wird jede Probenlösung und β-Sitosterol-Referenzlösung injiziert, um die Peakfläche unter den in Schritt 4.1 beschriebenen Bedingungen zu bestimmen, und der β-Sitosteringehalt jeder Probe unter Verwendung der externen Standard-Einpunktmethode berechnet.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Research+of+Chuanmutong%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sichuan+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quality Research of Chuanmutong.</a> Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).</li>
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<li>Qing, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+oleanolic+acid+in+Caulis+clematidis+armandii+by+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22West+China+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC.</a> West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Probenentnahme für die Forschung ist der erste wichtige Schritt zum Aufbau einer Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität chinesischer Arzneimittel. Durch Marktforschung fanden wir heraus, dass Sichuan Ya'an, Liangshan und Leshan die Hauptproduktionsgebiete für wilde Ressourcen von Chuanmutong sind. Die verwandten Sorten derselben Gattung haben auch die gleiche geographische Verbreitung 6,20; CC, DC, DE, XS und SMT werden oft als Chuangmuton...

Chuanmutong, trockener Caulis von Clematis armandii Franch. oder Clematis montana Buch.-Ham., ist eine traditionelle chinesische Medizin, die häufig in den Kliniken 1,2,3 verwendet wird. Es wird zur Behandlung von Harnproblemen, Ödemen, Wunden an Zunge und Mund, verminderter Milchsekretion, Gelenksteifigkeit und Muskelschmerzen durch feuchte Hitze verwendet4. Chuanmutong wurde schon immer aus wilden Sorten gewonnen, die hauptsächlich im Südwesten Chinas verbreitet sind, insbesondere in Sichuan, wo die beste Qualität zu finden ist 5,6. Es ist schwierig, zwischen authentischen Sorten und ihren eng verwandten Verfälschungsmitteln zu unterscheiden, da sie ähnliche Eigenschaften 7,8,9,10 aufweisen. Der Qualitätsstandard von Chuanmutong in der Ausgabe 2020 des chinesischen Arzneibuchs legt nur die Eigenschaften, die mikroskopische Identifizierung und die Dünnschichtidentifizierung ohne Inhaltsbestimmung fest, die Verfälschungsmittel nicht effektiv identifizieren können und daher potenzielle Risiken birgt. Darüber hinaus gibt es nur wenige Berichte, die Chuanmutong und verwandte Pflanzen vergleichen und identifizieren. Folglich ist eine Qualitätskontrollmethode, um die Authentizität von Chuanmutong sicherzustellen, eine weitere Untersuchung wert.
Die chemischen Bestandteile von Chuanmutong bestehen hauptsächlich aus pentacyclischen Triterpenoiden vom Oleanan-Typ und ihren Glykosiden, Flavonoiden und organischen Säuren11,12,13,14. Unter ihnen haben Oleanolsäure, β-Sitosterin, Stigmasterol und Ergosterol harntreibende Wirkungen unterschiedlicher Intensität, die potenzielle pharmakodynamische Substanzen zur Förderung der Diurese und Linderung der Strangurie sein können15,16. Chemische Fingerabdrücke werden durch Trennung und Detektion vieler chemischer Komponenten, die in Proben enthalten sind, durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Gaschromatographie (GC) usw. erhalten. Die Anwendung geeigneter statistischer Analysemethoden zur Analyse der Eigenschaften von Chuanmutong kann die allgemeine Qualitätskontrolle und wissenschaftliche Identifizierung der traditionellen chinesischen Medizinbestimmen 17,18,19.
In dieser Studie wurden 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln gesammelt. Ihre Qualität wurde durch die HPLC-Fingerabdruckmethode in Kombination mit Multi-Pattern-Erkennung verglichen und analysiert, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), orthogonale partielle Least-Squares-Diskriminierungsanalyse (OPLS-CA) und Inhaltsbestimmung der pharmakodynamischen Komponente. Dieses Protokoll legt eine Methode zur Identifizierung authentischer Sorten mit hoher Spezifität fest, eine neue Strategie für die wissenschaftliche Identifizierung authentischer Sorten und Verfälschungsmittel chinesischer Arzneimittel.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>2017381038</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; Trading Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>WXBD5243V</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Sitosterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; C18 Säule</td><td>Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>Welch Ultimate LP</td><td></td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>19020103</td><td>CMT-1</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-2</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200701</td><td>CMT-3</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-4</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>210701</td><td>CMT-5</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>210401</td><td>CMT-6</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>200901</td><td>CMT-7</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>201201</td><td>CMT-8</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Limin Chinesische Kräuterstücke Co., Ltd., Sichuan, China&nbsp;</td><td>201001</td><td>CMT-9</td></tr><tr><td>Chuanmutong</td><td>Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China</td><td>210501</td><td>CMT-10</td></tr><tr><td>Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang</td><td>Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>CC</td></tr><tr><td>Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.</td><td>Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>DC</td></tr><tr><td>Clematis peterae Hand.-Mazz.</td><td>Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>DE</td></tr><tr><td>Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils</td><td>Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>XS</td></tr><tr><td>Clematis finetiana Levl. et Vaniot.</td><td>Wannian Village, Gemeinde Huangwan, Kreis Emei, Sichuan, China&nbsp;</td><td>-</td><td>SMT</td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, &nbsp; China&nbsp;</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>2021112602</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetat</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>2017042043</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>2016062901</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatographie</td><td>Agilent, USA.</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics Version 26.0</td><td>International Business Machines Corporation,</td> <td>USA-Methanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp; Trading Co., Ltd., Shanghai, China</td><td>WXBD6409V</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China</td><td>202010302</td><td></td></tr><tr><td>n-Butylalkohol</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>2020071047</td><td></td></tr><tr><td>Petrolether</td><td>Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>2020090125</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China</td><td>20200110</td><td></td></tr><tr><td>SESCF-TCM Version 2012</td><td>National Pharmacopoeia Commission,</td> <td>China-http://114.247.108.158:8888/login</td><td></td></tr> <tr><td>Stigmasterol</td><td>Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China</td><td>20210201</td><td></td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China</td> 20200214 Umetrics <td>SIMCA-Version</td><td></td></tr><tr><td> 14.1.0.2047</td><td>Umetrics,</td> <td>Schweden-https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download</td><td></td></tr> <tr><td>Reinstwassermaschine</td><td>Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China</td><td>UPH-II-10T</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallreiniger</td><td>Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China</td><td>KH3200E</td><td></td></tr></tbody></table>

hplc gekoppelt mit chemischem fingerabdruck zur multimustererkennung zur identifizierung der authentizität von clematidis armandii caulis

HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis

Eine Methode zur Identifizierung chinesischer Arzneimittel und ihrer verwandten Verfälschungsmittel wurde am Beispiel von Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, einer universell verwendeten traditionellen chinesischen Medizin) entwickelt. Zehn Chargen echter Chuanmutong-Sorten und fünf Chargen verwandter Verfälschungsmittel wurden analysiert und verglichen, basierend auf den Fingerabdrücken der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Kombination mit Chemometrie, einschließlich Clusteranalyse (CA), Hauptkomponentenanalyse (PCA) und orthogonaler partieller Diskriminierungsanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA). Zusätzlich wurde der Gehalt an β-Sitosterol bestimmt. Der chemische Kontrollfingerabdruck von Chuanmutong wurde ermittelt und 12 gemeinsame Spitzen identifiziert. Die Ähnlichkeit zwischen dem Fingerabdruck von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten und dem Kontrollfingerabdruck betrug 0,910-0,989, während die Ähnlichkeit von fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nur 0,133-0,720 betrug. Basierend auf den gemeinsamen Peaks im Chromatogramm wurden 15 Probenchargen von PCA in drei Gehaltsstufen eingeteilt und von CA in vier Kategorien aggregiert, wodurch eine klare Unterscheidung zwischen authentischem Chuanmutong und Verfälschungsmitteln von Chuanmutong erreicht wurde. Darüber hinaus wurden sieben differentielle Komponenten, die authentisches Chuanmutong und Verfälschungsmittel von Chuanmutong effektiv identifizieren können, durch OPLS-DA gefunden. Der β-Sitosterin-Gehalt von 10 Chargen echter Chuanmutong-Sorten betrug 97,53-161,56 μg/g, während der β-Sitosterin-Gehalt der fünf Chargen von Verfälschungsmitteln stark variierte, darunter der β-Sitosterin-Gehalt von Clematis peterae Hand.-Mazz. und Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. war deutlich niedriger als die authentischen Sorten von Chuanmutong. Der Inhalt der HPLC-Indexkomponente und die in dieser Studie etablierte Methode zur Erkennung chemischer Fingerabdrücke mit mehreren Mustern bieten eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung authentischer chinesischer Arzneimittel und verwandter Verfälschungsmittel.

Chromatographischer Fingerabdruck von Chuanmutong und Ähnlichkeitsanalyse (SA) Die RSD-Werte der relativen Retentionszeit von Präzision, Wiederholbarkeit und Stabilität lagen unter 0,46%, 1,65% bzw. 0,53%; die RSD-Werte der relativen Spitzenfläche lagen unter 4,23%, 3,56% bzw. 3,96%. Wie in den Abbildungen 1A,B gezeigt, gab es 12 verschiedene gemeinsame Peaks (von Peak 1 bis Peak 12) in den HPLC-Fingerabdrücken in den 10 authentischen Chuanmutong-Proben. ...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit der Multimustererkennung des chemischen Fingerabdrucks vor, das eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung der echten Sorten von Clematidis Armandii Caulis und seiner Verfälschungsmittel bietet.

HPLC gekoppelt mit chemischem Fingerabdruck zur Multimustererkennung zur Identifizierung der Authentizität von Clematidis armandii caulis

A method for identifying Chinese medicinal materials and their related adulterants was constructed by taking Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, a ...

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Dieses Protokoll kann eine neue Strategie zur effektiven Identifizierung der echten Materialien von Clematidis armandii caulis und seinen Verfälschungsmitteln bieten. Diese Methode kann in der medizinischen Materialqualitätsforschung verwendet werden und bietet eine Referenz für die Untersuchung der Qualitätsstandards anderer chinesischer Arzneimittelmaterialien. Um mit der Probenvorbereitung zu beginnen, mahlen Sie das Rohmaterial auf eine gleichmäßige Partikelgröße, indem Sie es durch ein Nylonnetz mit einem geeigneten Innendurchmesser leiten.Zwei Gramm des gemahlenen Rohmaterials wurden genau in einen verschlossenen 50-Milliliter-Konikenkolben überführt, bevor 50 Milliliter Methanol in den Kolben gegeben wurden. Legen Sie den Stopfen auf den Kolben in mit 600 Watt und 40 Kilohertz erhitztem Ultraschall für 30 Minuten. Am Ende der Inkubation die medizinische Extraktlösung durch das Filterpapier abseihen.Nach dem Abseihen werden vier Milliliter der Methanollösung, die die medizinischen Extrakte enthält, in einen 10-Milliliter-Messkolben überführt. Dann fügen Sie sechs Milliliter Wasser hinzu und mischen Sie die Lösung. Lassen Sie die Lösung 10 Minuten ruhen.Zur HPLC-Analyse der Proben. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der mobilen Phasen und stellen Sie das HPLC-Gradientenprogramm wie im Manuskript beschrieben ein. Filtern Sie die Probe durch eine 0,45 μm mikroporöse Filtermembran und unterziehen Sie sie einer HPLC-Analyse.Führen Sie für jede Probe sechs Mal täglich eine Analyse durch. Um die Stabilität der Probenlösung zu beurteilen, analysieren Sie dieselbe Probenlösung, die 0, 2, 4, 6, 8, 12 und 24 Stunden nach der Vorbereitung bei Raumtemperatur gelagert wird. Nehmen Sie sechs Replikate derselben Probe und erkennen Sie ihren Fingerabdruck in der HPLC.Importieren Sie die relevanten Daten in die Software Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine oder SESCF TCM Version 2012. Importieren Sie die Verweilzeit und den Spitzenbereich für alle 10 Chargen authentischer Chuanmutong-Proben sowie fünf Chargen von Verfälschungsmitteln zur Analyse in die SESCF-TCM. Klicken Sie im Hauptmenü auf das eingestellte Referenzspektrum und gehen Sie zum Fenster mit den Parametereinstellungen, um den chromatographischen Referenzfingerabdruck der authentischen Art von Chuanmutong als Referenz festzulegen.Legen Sie als Nächstes die Regelspektrumgenerierungsmethode als Medianmethode mit der Zeitfensterbreite von 0,5 fest. Klicken Sie dann im Hauptmenü auf Mehrpunktkalibrierung, wählen Sie die Peaks aus und wählen Sie dann die Peak-Matching-Option als markierte Peaks. Klicken Sie abschließend auf Ähnlichkeit berechnen, um eine Ähnlichkeitsanalyse der Proben basierend auf den Referenzchromatogramm-Fingerabdrücken von Chuanmutong durchzuführen.Um eine systemische Clusteranalyse durchzuführen, öffnen Sie die entsprechende statistische Analysesoftware und klicken Sie auf Datei, um die Daten von 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln in die Software zu importieren. Klicken Sie im Menü auf der Registerkarte Klassifizierung auf Analyse und Systemclustering. Wählen Sie die gemeinsamen Spitzenbereiche von 10 Chargen authentischer Proben und fünf Chargen von Verfälschungsmitteln als Variablen aus.Legen Sie die Anzahl der Cluster auf vier fest. Klicken Sie anschließend auf Methode, um die Clustering-Methode als Intergruppenverbindung auszuwählen. Wählen Sie das Messintervall als Pearson-Korrelation aus, und verwenden Sie die Registerkarte OK, um die Clusteranalysekarte zu zeichnen.Für die Hauptkomponentenanalyse oder PCA öffnen Sie die Datenanalysesoftware. Klicken Sie im Menü auf Datei und erstellen Sie ein neues reguläres Projekt. Importieren Sie die Peakfläche von 12 gemeinsamen Peaks in eine Excel- oder ähnliche Tabelle aus dem HPLC-System.Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen, um den Datenimport abzuschließen. Um den Modelltyp mit PCA festzulegen, klicken Sie auf Neu, um ein neues Modell zu erstellen, und passen Sie die Daten dann mit Autofit an und fügen Sie Registerkarten hinzu. Gehen Sie zu Ergebnisse, um die PCA-Punktekarte zu erhalten.Um die Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis oder OPLSDA zu verwenden. Generieren Sie die PCA-Score-Map wie zuvor gezeigt. Legen Sie den Modelltyp mit dem OPLSDA fest, indem Sie auf Neu und Neu als Modell eins klicken Bevor Sie bei der Auswahl von Par für alle skalieren, klicken Sie dann auf AutoFit in Scores, um die OPLSDA-Score-Map zu generieren.Um die Wichtigkeit und Projektion der Variablen zu schätzen, gehen Sie zum Menü der Datenanalysesoftware und gehen Sie zu Analysieren, gefolgt von der Einstellung der Zahl auf 200 unter pro Mutation. Rufen Sie die R-Quadrat- und Q-Quadratwerte aus dem OPLSDA-Score ab und klicken Sie auf VIP und VIP Predictive, um die VIP-Karte zu erhalten. HPLC-Fingerabdrücke der 10 authentischen Chuanmutong-Proben zeigten 12 verschiedene gemeinsame Peaks, von denen die relativ groß und gut aufgelöst sind.Peak Nummer 10 wurde als Referenzpeak verwendet, um die relativen Retentionszeiten der Ruhepeaks zu schätzen. Die authentischen Proben zeigten Ähnlichkeitsgrade sehr nahe an einem, was eine hohe Ähnlichkeit in guter Konsistenz impliziert. Die Ähnlichkeitsgrade zwischen den fünf Chargen von Verfälschungsmitteln und dem Kontroll-Chuanmutong waren jedoch recht gering.Es wurde beobachtet, dass sich die HPLC-Fingerabdrücke der fünf Verfälschungsmittel von den authentischen Proben unterscheiden, hauptsächlich in der Region mit Retentionszeiten von 28 bis 55 Minuten. PCA zeigte eine offensichtliche Ähnlichkeit zwischen den authentischen Sorten und ihrem Unterschied zu den Verfälschungsmitteln, mit Ausnahme des Verfälschungsmittels CC.Ähnliche Ergebnisse wurden auch aus der Clusteranalyse erhalten, als der Klassifizierungsabstand 20 betrug. Die aus OPLSDA generierte Score-Matrix zeigte keine Schnittmenge zwischen den Stichprobenpunkten authentischer Proben und den Verfälschungsmitteln.Auch hier ähnelte das Verfälschungsmittel CC den authentischen Sorten mehr als die anderen Verfälschungsmittel. Gemäß der VIP-Karte wurden die Gipfel mit Werten größer als eins als Hauptmarkerkomponenten identifiziert, die den Unterschied zwischen authentischen Proben und den Verfälschungsmitteln verursachen. Der Gehalt an Beta-Sitosterol, einer aktiven Komponente, die in Chuanmutong gefunden wurde, wurde in allen fünf Chargen von Verfälschungsmitteln nachgewiesen, aber der Gehalt variierte stark.Dieses Protokoll legt verschiedene Analysemethoden fest, um alle Informationen über medizinische Materialien aus verschiedenen Blickwinkeln zu reflektieren und die Authentizität von Chuanmutong-Arzneimitteln abzuschätzen.

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