Analyse von rohen und verarbeiteten Cyperi-Rhizom-Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie bei Ratten mit primärer Dysmenorrhoe

Metabonomics misst die Gesamt- und die dynamischen Stoffwechselreaktionen und steht im Einklang mit der Bestimmung der Gesamtwirksamkeit der traditionellen chinesischen Medizin. Veränderungen der Arzneimittelbestandteile aufgrund der Stoffwechselreaktion des Körpers können mit der Metabonomik festgestellt werden. Der Umfang des Screenings der Wirkstoffe der TCM kann durch den Einsatz dieser Technik eingegrenzt werden.

Einseitigkeit kann vermieden werden, indem man die einzelnen Bestandteile untersucht. Diese Methode kann gleichzeitig erfolgen, um die endogenen Metaboliten und exogenen Bestandteile zu bestimmen, die in das Blut aufgenommen werden. Metabonomics wurde häufig in Studien zu TCM, Arzneimitteltoxikologie, Gesundheitsmanagement, Sport, Lebensmitteln und anderen Bereichen eingesetzt.

Bestimmen Sie zunächst den erforderlichen Extrakt aus Cyperi-Rhizom oder CR oder Cyperi-Rhizom, das mit Essig oder CRV verarbeitet wurde, um eine Gruppe von sechs Sprague-Dawley-Ratten drei Tage lang zu behandeln. Berechnen Sie das Volumen von CR oder CRV, das pro Ratte angewendet werden soll, mit dieser Gleichung. Um das CRV zu verarbeiten, mischen Sie gründlich 100 g CR und 20 g Essig, der mehr als 5,5 g Essigsäure pro 100 Milliliter enthält, und inkubieren Sie 12 Stunden lang.

Nach der Inkubation die Mischung in einer Eisenpfanne 10 Minuten bei 110 bis 120 Grad Celsius anbraten. Entfernen Sie dann die Mischung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen. Um den CR-Extrakt herzustellen, tränken Sie den CR zwei Stunden lang mit reinem Wasser, das 10-fache der aufgenommenen CR-Menge beträgt, und achten Sie darauf, dass sich die medizinischen Materialien unter dem Flüssigkeitsspiegel befinden.

Als nächstes bringen Sie die Mischung aus Wasser und Medizin bei starker Hitze zum Kochen und lassen Sie sie 20 Minuten bei schwacher Hitze kochen. Filtern Sie dann den Inhalt durch ein 100-Mesh-Filtertuch und sammeln Sie das Filtrat. Anschließend wird das gesammelte Filtrat mit einem Rotationsverdampfer zu einem Extrakt auf ein Gramm pro Milliliter konzentriert.

Um den CRV-Extrakt herzustellen, führen Sie die Schritte des Einweichens, Kochens und Konzentrierens durch, wie für die CR-Extraktion gezeigt. Um die CR- und CRV-Extrakte zu testen, pipettieren Sie 500 Mikroliter des Extrakts in 500 Mikroliter Methanol in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und wirbeln Sie 30 Sekunden lang, um es zu mischen. Zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 16.500 g bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie dann den Überstand und geben Sie ihn zum Testen in das Probenfläschchen. Führen Sie nach dem Testen der Proben die Hauptkomponentenanalyse (PCA) und die Modellierung mit der Analysesoftware durch. Importieren Sie die standardisierten Daten der Metaboliten in die Software, und verwenden Sie dann die automatische Anpassung, um das Analysemodell zu erstellen.

Verwenden Sie schließlich die Scores, um das Score-Scatter-Diagramm des PCA zu erhalten. Um die orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) durchzuführen, importieren Sie die standardisierten Daten zu den Metaboliten und den CR- und CRV-Gruppen in die Software. Importieren Sie dann die CR- und CRV-Daten in die jeweiligen erstellten Gruppen.

Verwenden Sie dann Autofit, um das Analysemodell zu erstellen, und verwenden Sie die Bewertung, um das Bewertungsstreudiagramm des OPLS-DA zu erhalten. Verwenden Sie schließlich VIP, um die variable Signifikanz in der Projektion oder den VIP-Wert im OPLS-DA zu erhalten. Um die potenziell differentiellen Metaboliten zu identifizieren, filtern Sie die Metaboliten mit VIP-Werten größer als eins aus.

Verwenden Sie dann die statistische Software, um den P-Wert der gescreenten Metaboliten durch den T-Test des Schülers zu berechnen. Um die differentiellen Metaboliten zu identifizieren, verwenden Sie als Nächstes die annotierten Metaboliten und filtern Sie die differentiellen Metaboliten aus, die in der KEGG-Datenbank abgeglichen werden sollen. Zeigen Sie die Veränderungen der differentiellen Metaboliten in den CR- und CRV-Gruppen, indem Sie eine Heatmap zeichnen.

Um die möglichen Stoffwechselwege zu untersuchen, gehen Sie in die MetaboAnalyst-Datenbank. Verwenden Sie die Pfadanalyse, um die verschiedenen Metaboliten hochzuladen, um die potenziellen Stoffwechselwege zu erhalten. Laden Sie die verschiedenen Metaboliten in die KEGG-Datenbank hoch, um die potenziellen Stoffwechselwege zu analysieren.

Das analysierte Dysmenorrhoe-Modellexperiment zeigte signifikante Unterschiede in den Prostaglandinspiegeln. Die Ratten in den Modell-CR- und CRV-Gruppen zeigten nach der Oxytocin-Injektion erhebliche Krümmungsreaktionen. Die Ergebnisse der PCA-Analyse zeigten, dass die Cluster der CR und CRV im Vergleich zu den Modellgruppen sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus signifikant getrennt waren.

Das OPLS-DA wurde verwendet, um nach metabolischen Unterschieden zu suchen, und die Ergebnisse des Streudiagramms zeigten, dass die CR- und CRV-Gruppen getrennt waren. Univariate statistische Analysen wurden durchgeführt, um metabolische Variationen zu identifizieren. Es wird ein Vulkandiagramm gezeigt, wobei jeder Punkt einem anderen Metaboliten entspricht.

Signifikante Veränderungen wurden bei 63 Metaboliten im positiven Modus und 30 im negativen Modus beobachtet. Die differentiellen Metaboliten wurden mit Hilfe der KEGG- und HDMB-Datenbanken bestimmt, und die genau übereinstimmenden Verbindungen wurden aufgelistet. Die quantitativen Werte der differentiellen Metaboliten zwischen der CR- und der CRV-Gruppe wurden berechnet und geclustert.

Die Farbflecken zeigen an, wie jeder Metabolit relativ zu den anderen exprimiert wird. Im Vergleich zur CR-Gruppe stiegen die Spiegel von vier differentiellen Metaboliten in der CRV-Gruppe an, während 11 Metaboliten im positiven Ionenmodus abnahmen. Im Fall des negativen Ionenmodus nahmen vier differentielle Metaboliten zu und sieben Metaboliten ab.

Die Ergebnisse der KEGG-Signalweganalyse zeigten, dass die differentiellen Metaboliten mit neun Signalwegen im positiven und negativen Modus assoziiert waren. Je mehr differentielle Metaboliten vorhanden sind, desto besser sind die Ergebnisse, sodass genügend Stoffwechselwege verknüpft werden können und die wichtigsten Stoffwechselwege, die untersucht werden, genauer sind.